CN107854730A - 交联cga的海藻酸钠‑明胶共混膜关节补片的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种交联CGA的海藻酸钠‑明胶共混膜关节补片的制备方法及其应用，属于医药技术领域。该关节补片包括如下步骤：选取鸡胚软骨干细胞胰酶消化后，海藻酸钠溶液重悬并在细胞悬液中添加CGA，吹打均匀后取少量添加在CaCl₂溶液中，待海藻酸钠与鸡胚软骨干细胞聚合成形状稳定的3D复合物后，换软骨诱导培养基，体外培养14天后，得到交联CGA的海藻酸钠‑明胶共混膜关节补片。以新生鸡股骨外侧髁表面软骨损伤为模型，将关节补片移植至软骨损伤处，通过行为学、影像学和形态学等观测手段，观察软骨缺损修复的效果，并采用分子生物学方法探索其可能的机制，为全面开发和利用CGA、及寻求有效的关节损伤治疗方法提供实验依据。

Description

交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片的制备方法及其 应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，通过运用海藻酸钠-明胶共混膜交联CGA技术，制备一种关节补片，用于修复关节缺损，尤其针对骨关节炎(OA，osteoarthritis)相关的关节缺损，对OA的预后具有重要意义。具体涉及一种交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片的制备方法及其应用。

背景技术

随着生活质量的提高和体育事业的发展，肌肉、骨骼和关节相关疾病日益引起关注。关节软骨损伤是临床上十分常见的病症，迁延难愈，是骨科和运动医学的治疗难题。

关节软骨属于透明软骨，其细胞密度、增殖和迁移的能力都比较低，并且属于无血管组织，具有高度分化的特性，因此一旦受到损伤，组织再生、修复的能力非常有限(Richter W.Cell-based cartilage repair:illusion or solution forosteoarthritis.Current opinion in rheumatology.2007；19(5):451-6.)；如果软骨损伤没有得到及时治疗处理，缺损会逐渐扩大至周围正常软骨造成进一步磨损，甚至引发骨关节炎(Osteoarthritis，OA)。关节软骨病变影响着数千万人的健康，是致残的主要原因之一。据统计，年龄范围在15～24岁的年轻人中有4～10％出现软骨病变，而年龄超过55岁的老年人中这个比例高达80％。

目前临床修复关节软骨损伤的常用方法有药物治疗、外科手术、中西医结合等，这些手段可以减轻关节疼痛和缓解肿胀等症状，但并不能有效地促进软骨组织的修复再生。因此，探索出促进软骨再生的治疗措施显得极为迫切。

近年来，随着组织工程和再生医学技术的不断成熟，关节软骨的修复技术有了新的突破。尤其是干细胞及其来源的软骨细胞体外培养后移植治疗，解决了软骨组织再生能力低的问题，已成为临床上治疗软骨损伤的有效方法。然而，研究发现体外有氧环境下培养的细胞移植进入类似关节腔内缺氧环境后，细胞活性及存活率均明显下降，影响了移植细胞进一步增殖和分化而来的软骨组织的厚度、机械强度等生物学特性，制约了软骨组织工程的应用和发展(Pfander D,Swoboda B,Cramer T.The role of HIF-1alpha inmaintaining cartilage homeostasis and during the pathogenesis ofosteoarthritis.Arthritis Res Ther.2006；8(1):104.)。寻找促进软骨细胞增殖、增强软骨细胞分泌基质的有效成分，是研究关注的重点。生长因子如IGF-1、bFGF、TGF-β等在促进干细胞增殖及成软骨分化方面有着明显的效果，但是具体到临床应用，价格昂贵及生长因子作用的广泛系统性也是需要考虑的因素。

正常关节的骨软骨组织结构，主要包括“透明软骨-界面结构(软骨钙化层)-软骨下骨”三部分(图1)。

在整个关节软骨中，水和蛋白质的含量，细胞形态以及纤维方向和直径均呈梯度排列。从浅表层至辐射层，胶原与水的含量显著递减，而胶原纤维直径逐渐递增。推测这是因为负荷转移物竞天择而成。骨软骨组织各层的结构、胶原纤维直径及排列的不同产生了一系列力学特性。软骨的压缩模量也遵循梯度变化，由浅表层的0.079MPa递增至软骨下骨的5.7GPa。该梯度特性对维持关节的正常功能与力学稳定有着重要意义，也是组织工程仿生策略的重点和难点。

由损伤而引起的关节软骨的降解和退变一直被看作是OA首要的发病因素。在软骨损伤和OA发生过程中，结构性损伤一般发生在软骨表层。首先是细胞外基质中的GAGs流失，胶原纤维所构成的网络被打乱；随后软骨细胞开始变性并且大量流失。最初的小范围局域性损伤逐渐扩大，最终蔓延到中、深层软骨(图1)。在此过程中，尽管缺损周围正常软骨细胞的代谢活性会加强，但合成代谢远低于软骨退变造成的分解代谢。

从图1可知，该模式图显示了骨与软骨组织不同的细胞组成、局部物理环境和代谢速率。由于软骨组织无血管、无神经的特殊结构，关节软骨一旦受到损伤，再生修复能力极度有限。同时软骨含水量高，细胞成分少，与新生或者植入组织整合能力差，限制了软骨的自发修复能力。这些特性使得软骨损伤后需要外源性因素改善修复效果，使得体外软骨组织工程的要求高于骨的修复。by Daniel J,2012。

根据损伤的深度将软骨损伤分为三种类型：部分软骨损伤(partial-thicknessdefects)，全层软骨损伤(full-thickness defects)和骨软骨损伤(osteochondraldefects)。部分软骨损伤是指发生在软骨表面、深度未达到潮线的缺损；全层软骨损伤是指缺损深达潮线以下、但尚未穿透软骨下骨的缺损；骨软骨损伤是指深达骨髓腔的缺损。不同损伤缺损深度，其发病过程和机理各不相同。

软骨组织工程技术的发展为软骨损伤修复提供了新的思路。组织工程的概念在1987年由美国国家科学基金委员会提出，指利用生物活性物质，通过体外培养或构建的方法，再造或者修复器官及组织的技术。作为跨学科领域，组织工程涵盖了细胞学、生物力学和材料学方法，以及合适的生物化学和物理化学因素，以恢复、维持或改进损伤、疾病或衰老组织的结构和功能。种子细胞、支架材料和生物活性分子是构建组织工程的三要素。种子细胞作为原料，支架提供生长空间，生物活性分子作为诱导剂。

﹣种子细胞

自体软骨组织很长时间内被当做移植治疗损伤的金标准。传统方法通过从体内健康非负重区取出一小块软骨组织，体外扩大培养出足量细胞，种在合适的支架材料上，加以生物活性分子诱导分化，最终将这块体外构建的组织工程软骨移回体内软骨缺损处，实现软骨修复再生。由于软骨细胞是一种增殖能力较差的终末分化细胞，体外培养的软骨细胞常出现去分化、异常分化，细胞活力差，细菌、支原体污染等影响；另一方面，重新移植到体内的软骨细胞往往难以长时间停留在缺损处，细胞流失过快，严重降低移植的有效性与安全性。所以自体软骨细胞体外构建软骨组织，来源受限是最大的障碍。生物体内软骨微环境中，本身也存在着内源性的种子细胞，除了耳熟能详的骨髓基质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)，研究者们还分离鉴定出了一群来自软骨与滑膜的、具有很强迁移能力的干细胞，即软骨干细胞(Cartilage MSCs)，滑膜干细胞(SM-MSCs)。

如前所述，业界认为骨软骨损伤有一定的自发修复能力，这是由于在骨软骨损伤中，软骨下骨板被穿透，造成大量的种子细胞BMSCs从骨髓腔蔓延到缺损部位，从而促进骨软骨损伤的修复治疗。而部分软骨损伤之所以没有自发修复能力，是由于缺少参与修复的种子细胞造成的，尤其是BMSCs造成的。奇怪的是，为什么同为干细胞，C-MSCs和SM-MSCs却没有承担起部分软骨损伤的自发修复这项功能呢？又有研究表明，软骨修复生成的新生组织不仅仅从缺损下方向表面生长，还有一群细胞从软骨缺损的边缘向中间生长，参与该修复过程，这意味着缺损边缘处的C-MSCs和SM-MSCs也参与了自发修复，贡献不仅仅来自BMSCs，但是显然C-MSCs和SM-MSCs没有成为自发修复的中坚力量。

在理化和生物学特性上，透明软骨与软骨下骨的基质微环境有很大不同，这极可能是不同来源的干细胞对软骨损伤的修复能力不同的主要原因。BMSCs分泌的基质细胞衍生因子SDF-1，能有效调节干细胞归巢和迁移。全层软骨损伤的微环境中，SDF-1有可能从骨髓腔扩散到软骨下骨部位，进而诱导了C-MSCs和SM-MSCs迁移。此外，I型胶原(Col I)和二型胶原(Col II)分别作为软骨下骨和透明软骨的主要细胞外基质，对细胞粘附力、形态和生物合成能力也都有一定影响。透明软骨的细胞外基质中，存在着硫酸角质素等生物大分子，抑制细胞的迁移与黏附。实验证实，用相应的酶对其消化后，可以促进细胞的迁移、黏附与软骨修复再生。但是软骨GAG的成分，对于维持细胞功能一样重要。在自然进化的过程中，生物体利用碳氢氧氮等几种基本元素精巧地结合，构建着功能多样化的结构，每种成分每种结构都是物竞天择形成的，有着其最有效、最经济的设计。不论选择干细胞，还是终末分化细胞，选择的标准就在于细胞能分泌相应的细胞外基质，即形成功能性软骨细胞。

﹣支架材料

构建合适的生物活性材料，要根据不同种类软骨损伤，选择适宜的支架材料。目前软骨组织工程使用的支架材料分为两类：合成化学材料和天然生物材料。两类材料皆有大量研究和临床试验报道。不同部位的力学支持、细胞传递等需求各不相同，需要通过研究不同类型的软骨损伤自发修复特点，找出促进其修复的关键因素。理想的软骨支架可以引导并促进新生软骨组织的形成。

化学合成材料包括聚羟基乙酸(polyglycolic acid，PGA)、聚乳酸(polylacticacid，PLA)、聚乳酸与聚羟基乙酸的共聚体(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)和聚乙二醇(PEG)等，这些也是目前应用最广泛的可降解的纳米高分子材料。化学合成材料力学性能强，但材料本身难以降解、生物相容性较差，体内植入可能会引发排斥和侵姓反应。

天然生物材料与天然细胞外基质相接近，具有相容性好、毒副作用小、易降解、降解产物易吸收的优势，在组织工程支架材料的研究中备受青睐。目前采用的天然材料主要包括胶原(Collagen)、壳聚糖(Chitosan)、藻酸盐(Alginate)、琼脂糖、透明质酸(Hyaluronic acid，HA)、纤维蛋白(Fibrin)、蚕丝蛋白(丝素，Fibroin)、脱细胞软骨基质、明胶、硫酸软骨素、几丁质等。其中以Col II为原料的支架，因来源广、生物相容性好等优势成为早期软骨组织工程广泛使用的材料。Wakitani等在胶原凝胶携带BMSCs修复全层软骨缺损的实验中，发现缺损区有玻璃样软骨形成，但部分修复组织存在与周围关节软骨不整合的问题，新生软骨较正常软骨质软，韧性较差。胶原支架的缺点是降解速度快，新生组织塑形欠佳，机械应力强度不足，限制了其在受力较强组织的修复应用，如软骨下骨等部位，目前常与其他材料复合使用。藻酸盐和琼脂糖是从海藻分离出的多糖聚合物，其凝胶形态可以作为支架材料，具有可塑性好、亲和性好、易于细胞吸附、可使细胞均匀分布等特点。它们也常被制成注射支架材料。琼脂糖虽然在软骨细胞的体外研究中得到广泛应用，但也有其局限性，该材料在体内吸收不良，且可能导致异物巨细胞反应。Wang等采用微流控设备制作高度组织化藻酸盐三维支架，并在其上接种猪软骨细胞，然后将支架植入严重免疫缺乏综合征的小鼠背部皮下，移植后2、4、6周观察发现有软骨样组织形成，ColⅡ蛋白分泌并产生氨基葡聚糖，S-100持续表达，而其他类型胶原分泌检测结果为阴性，提示高度组织化的三维海藻盐支架是组织工程支架的良好选择。

虽然不同研究中使用的材料各有不同，但大体上可分为单相支架，双相或多相支架以及梯度支架三类。

﹣生物活性因子

大多数生物活性分子为蛋白质，如细胞因子、生长因子、激素，还包括营养分子、代谢物和其他信号分子等。细胞因子及激素等作用具有系统性，广泛参与软骨发生、损伤修复甚至OA的病理过程，调节着合成代谢和分解代谢的平衡状态，并且生理功效常与受体水平的调控有很大关系。使用合适的生物活性分子能够给予细胞正向刺激，能以特定方向引导分化并诱导细胞增殖，加速组织修复。借鉴软骨发生的生理过程，甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)、骨形成蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMP)、转化生长因子(Transforminggrowth factor，TGF)超家族、成纤维生长因子(Fibroblast growth factor，FGF)等均参与软骨发育，可作为有价值的生物活性分子与支架组合使用。

目前，临床上对于关节损伤和OA类疾病的药物治疗主要以非甾体类药物和关节软骨保护药物为主，中药在此类疾病也有很好的疗效，且不良反应少。中医有“肾主骨生髓”的观点，药物主要来自于补肾方、活血方、补肾活血方、补肾固筋方、祛风除湿方、温阳益髓方等，市场化的复方中药包括骨痹消、正清风痛宁、补肾壮骨胶囊、仙灵骨葆等。近年来，中药复方及相关提取物的关节软骨保护作用在动物实验及体外细胞培养实验中不断得到证实，研究着眼于软骨细胞本身的代谢周期和各阶段的病理特征、并集合软骨下骨力学及相关理化因素，探讨中药干预软骨细胞凋亡及保护关节的机制。研究证实：中药能通过调节相关细胞因子、生物活性分子、基质蛋白酶表达、血液循环、提高性激素水平等因素改善关节局部微环境，促进软骨细胞增殖并抑制其凋亡、影响软骨细胞代谢，促进胶原形成，防止或延缓关节软骨退变。较既往多为中药复方研究相比，近年对单味药及中药提取物研究增多，为临床防治关节软骨疾病提供了更多理论基础。

现有的相关研究仍存在一些问题，例如某些补肾类中药能促进软骨修复与增殖或抑制软骨凋亡，但作用机制尚不十分清楚；中药对OA发生发展相关基因表达谱的调控作用越来越多被研究，但很多相关基因尚不明确；含药血清成分复杂，中药有效成分不太明晰，不利于进一步地临床应用；另外，现代医学对软骨细胞代谢的研究进展及干细胞在增殖、分化、转分化的研究仍是热点问题，值得我们密切关注。

项目组前期通过文献梳理，挑选了近10种中药单体，观察其在体外对间充质干细胞成软骨分化、软骨细胞增殖和功能的影响，发现绿原酸(chlorogenic acid，CGA)有明显的增强软骨细胞活性、促进增殖的效果(图2，3)。CGA又名咖啡鞣酸、咖啡单宁酸，化学名3-O-咖啡酰奎尼酸，是植物有氧呼吸过程中产生的一种苯丙素类极性有机酸。它广泛存在于高等双子叶植物和蕨类植物中，可从金银花、杜仲等忍冬科忍冬属、菊科蒿属植物中提取。

随着研究手段的深入，CGA许多新的药效被陆续挖掘，包括抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抑菌等，药理作用广泛。文献证实：CGA可通过降低细胞内的活性氧水平、稳定线粒体膜电位而抑制缺氧引起的软骨样细胞凋亡率。大鼠腹腔注射CGA可显著降低高强度跳跃运动诱导的膝关节软骨中炎症因子IL-1β、TNF-α的表达，降低炎性因子所诱导的MMP-3活性升高，从而缓解软骨表面和滑膜损伤，抑制软骨基质降解或促进其合成。而在IL-1β诱导的兔OA模型中，CGA在mRNA和蛋白水平上降低MMP-1、MMP-3和MMP-13的表达，上调TIMP-1的表达，并抑制了IL-1β的下游分子NF-κB及κB的抑制剂(IκB)而成为OA治疗的潜在药物。

目前临床探索中的软骨组织再生修复技术，有如下问题需要考量：

-不同类型软骨损伤发病机理、自发修复能力、局部微环境均有不同，需要针对不同类型软骨损伤制定针对性的治疗方案；

-除了疗效和安全的考量外，该治疗手段大多需要活组织或活细胞操作，鉴于质量、安全控制的难度和疗效，难以大范围推广和产业化，国内外医药监管当局对此类技术和产品的批准异常谨慎。改善自身环境，引导机体对内源性干细胞分化、软骨组织功能再生的响应，联合组织工程技术，是软骨缺损的再生修复治疗的新策略；

-任何受力部位的组织工程修复，必须结合考虑替代组织的立体结构与功能的关系。目前大量软骨组织工程支架的研究重点是将上述几种材料配合交联使用，取长补短，并进一步改进制备工艺水平，提高支架的机械及理化性能；复合多种生物活性因子的新型可降解支架再生修复技术，将会对软骨组织工程领域产生巨大影响；

-生物活性因子是提高组织工程软骨修复质量的重要因素，其对支撑软骨再生的环境因素、生物材料特性及细胞存活及分化的影响至关重要。探索有效的生物活性因子，弄清楚其作用机理，通过调控负载的生物活性物质，可以提升组织工程软骨治疗的成功率。

关节疾病迁延难愈，是造成人类丧失劳动力和致残的主要原因之一，极大影响了患病人群的生活质量和劳动能力。关节软骨破坏是其重要病理机制，由于无血管、细胞密度和增殖能力低，损伤后组织再生、修复能力差。因此，深入研究有效方案抑制软骨退化、促进软骨修复成为备受重视的关键问题。组织工程和再生医学技术为提高软骨的修复质量带来新的机会。然而，研究发现将干细胞体外构建的移植物置于关节腔内缺氧环境后，细胞活性及存活率均明显下降，制约了软骨组织工程的应用和发展。寻找促进软骨细胞增殖、增强软骨细胞分泌基质的有效成分，是研究关注的重点。

发明内容

为克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片的制备方法，该关节补片主要成分为交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的关节补片，并基于动物模型验证该关节补片的修复作用。

本发明的再一目的在于提供上述关节补片的应用，通过阐明该关节补片的修复机理，为该领域进一步的研究提供参考。

为阐明和全面开发CGA的药理功效、实现老药新用提供实验依据。

观察经CGA处理的干细胞体外构建软骨组织修复软骨缺损的功效并探索其可能机制。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片的制备方法，包括如下步骤：

选取鸡胚软骨干细胞胰酶消化后，海藻酸钠溶液重悬并在细胞悬液中添加CGA，吹打均匀后取少量添加在CaCl₂溶液中，待海藻酸钠与鸡胚软骨干细胞聚合成形状稳定的3D复合物后，换软骨诱导培养基，体外培养14天后，备用，得到交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片，得到用于后续实验。

所述的海藻酸钠溶液的浓度是2％。

所述的CGA的浓度是60μM。

所述的CaCl₂溶液的浓度是102mM。

所述的软骨诱导培养基为：含有10％胎牛血清的DMEM培养基。

一种交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片，通过上述制备方法制备得到。

所述的交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片在软骨建模中的应用。

一种鸡股骨外侧髁软骨损伤修复模型的制备方法，包括如下步骤：

新生鸡股骨外侧髁表面软骨损伤为模型，将交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片移植至软骨损伤处，得到鸡股骨外侧髁软骨损伤修复模型。

本项目在前期工作的基础上，利用鸡胚和新生鸡股骨外侧髁表面软骨损伤模型开展以下研究：

-采用离体培养手段，通过形态学染色、电镜观察、免疫荧光、ELISA、PCR等方法，观察CGA对间充质细胞聚集、成软骨分化、功能形成等各个环节的影响，及CGA对软骨细胞形态、活力、增殖、凋亡、成骨分化的影响；

-构建以交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片为主体的组织工程软骨，并测试其物化理性能和生物学性能；

-在体动物实验以新生鸡股骨外侧髁表面软骨损伤为模型，将交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片移植至软骨损伤处，通过行为学、影像学和形态学等手段，观察软骨缺损修复的效果，综合评估移植的组织对关节软骨的改变和修复能力，验证CGA促进关节损伤修复的功效并探求其可能机理。

本发明的机理是：

实验结果表明CGA具有明显的促进软骨细胞增殖和分泌基质的功效。在此基础上，以中医理论为指导，运用细胞生物学和分子生物学的研究手段，1)采用离体培养等方法，探究CGA对以鸡胚软骨干细胞为主体构建的软骨组织的理化性质、生物学特征和生物力学性能的影响；2)制备新生鸡股骨外侧髁软骨损伤模型，将交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片移植至软骨损伤处，观察缺损修复的效果，并采用分子生物学方法探索其可能的机制，为全面开发和利用CGA、利用现有资源发扬中华传统医学、及寻求有效的关节损伤治疗方法提供实验依据，从而进一步加深对中医药治疗关节损伤、退行性变、OA等疾病的认识，为临床治疗开辟更广阔的领域。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

关节软骨是无血管且高度特化的组织，衬在活动关节的表面以减少关节面的相互摩擦，并起到缓冲、减震和承载压力的作用。由于无血管、低细胞密度及低细胞迁移能力等特点，关节软骨一旦受到损伤，再生修复的能力极为有限，对患者生活造成极大影响，因此探索出促进软骨再生的治疗措施极为迫切。项目组通过前期对中药单体的筛选，发现绿原酸(chlorogenic acid，CGA)具有明显的促进软骨细胞增殖和分泌基质的功效。在此基础上，本研究1)采用离体培养手段，通过形态学染色、免疫荧光、ELISA、PCR等方法，探究CGA对以鸡胚软骨干细胞为主体构建的软骨组织的理化性质及生物学特征的影响；2)以新生鸡股骨外侧髁表面软骨损伤为模型，将交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片移植至软骨损伤处，通过行为学、影像学和形态学等观测手段，观察软骨缺损修复的效果，并采用分子生物学方法探索其可能的机制，为全面开发和利用CGA、及寻求有效的关节损伤治疗方法提供实验依据。

附图说明

图1是骨与软骨组织不同的细胞组成、局部物理环境和代谢速率的模式图。

图2是CCK-8检测显示CGA明显增强原代培养的软骨细胞的活性的结果图。

图3是pH3和F-actin免疫荧光染色的结果图，显示，CGA促进软骨细胞增殖，并促进软骨细胞的伸展和迁移(unpublished data)。

图4是本发明的技术路线图。

图5是交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜及软骨干细胞组织工程学软骨的构建。

图6是体外构建海藻酸钠-明胶共混膜作为3D支架，复合CGA和鸡胚软骨干细胞构建组织工程软骨。

图7是术后8周取动物膝关节切片，观察组织工程软骨的生长及损伤修复情况。

图8是足迹示踪实验结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。未注明实验材料具体来源的，通常是市售产品。

实施例1

1.1研究目标：

探究CGA处理的干细胞体外构建的软骨组织修复软骨缺损的功效，并探索其可能的机制，为寻求有效的关节损伤治疗方法提供理论依据，为阐明和全面开发CGA的药理功效、实现老药新用提供实验依据。

1.2研究内容：

本项目在前期工作的基础上，利用鸡胚和新生鸡股骨外侧髁表面软骨损伤模型开展以下研究：

-采用离体培养手段，通过形态学染色、电镜观察、免疫荧光、ELISA、PCR等方法，观察CGA对鸡胚软骨干细胞聚集、成软骨分化、功能形成等各个环节的影响，及CGA对软骨细胞形态、活力、增殖、凋亡、成骨分化的影响；

-构建以交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片为主体的组织工程软骨，并测试其物化理性能和生物学性能；

-在体动物实验以新生鸡股骨外侧髁表面软骨损伤为模型，将交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片移植至软骨损伤处，通过行为学、影像学和形态学等手段，观察软骨缺损修复的效果，综合评估移植的组织对关节软骨的改变和修复能力，验证CGA促进关节损伤修复的功效并探求其可能机理。

1.3拟解决的关键问题：

观察经CGA处理的干细胞体外构建软骨组织修复软骨缺损的功效并探索其可能机制。

2.1研究方法：

-鸡胚在体和体外孵育：

孵育早期鸡胚至实验所需的发育阶段时从鸡蛋中取出，继续用EC Culture体外培养，这个发育过程可以在荧光显微镜孵箱中进行，可以用Time-Lapse记录发育过程中标记细胞的运动。

-器官与细胞体外培养：

体式镜下分离鸡胚软骨干细胞原代培养，在体外环境较单一的条件下，研究细胞增殖、分化能力或基因表达水平等指标，对体内实验结果进行补充。

-交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜的构建：

选取长势良好的鸡胚软骨干细胞胰酶消化后，2％海藻酸钠溶液重悬并在细胞悬液中添加60μM CGA，吹打均匀后取少量添加在102mM CaCl₂溶液中，待海藻酸钠与鸡胚软骨干细胞聚合成形状稳定的3D复合物后，换软骨诱导培养基(含有10％胎牛血清的DMEM培养基)，体外培养14天后用于后续实验。

-石蜡切片制作和组织学染色：

应用常规石蜡切片技术制作骨切片，阿利新蓝-茜素红双染显示整体骨骼和切片上的软骨和成骨情况，根据实验需要采用甲苯胺蓝染色、Massion染色等，观察CGA对软骨增殖、分化功能的影响。

-原位杂交(in situ hybridization)和免疫荧光：

利用原位杂交和免疫荧光技术来检测基因在mRNA和蛋白质水平的原位表达。

-qRT-PCR，Western blot：

检测相关的基因在mRNA和蛋白水平上的变化情况。

-细胞GFP标记：

项目组成员熟练利用电穿孔(electroporation)技术将早期鸡胚分胚层GFP标记后，利用在体(in vivo)时间流逝(real time-lapse)计算机程序控制每间隔2-3分钟拍摄1张发育中的胚胎照片制作成电影放映的方法来跟踪GFP标记细胞在胚早期的完整移行轨迹和肢芽形成过程中细胞迁移的行为。也可以用于体外原代培养的细胞，可观察单细胞的细胞行为。

-荧光显微镜观察和显微图象处理(imaging process)：

利用各种图像处理技术来定量的分析各种细胞运动的差异。

-实验动物外科手术

实验雏鸡乙醚麻醉，施术髋部去羽消毒，后外侧切口，分离阔筋膜张肌，切开关节囊，将下肢内收内旋屈曲，显露内侧股骨外髁关节面，以针头在关节面作直径3mm深3mm的缺损区。然后将10μL移植体植入缺损区内，依次缝合关节囊、皮下组织及皮肤。

2.2技术路线，如图4所示

2.3实验方案

离体实验：

-HH23期鸡胚软骨干细胞微团培养，培养基中添加不同浓度的CGA，BrdU掺入、PCNA等免疫荧光染色、克隆形成实验等观察CGA对骨骼发育过程中前体细胞增殖的影响，同时阿利新蓝染色、番红O染色显微拍照后，分光光度法/ELISA定量分析sGAG的含量，RT-PCR/real-time PCR结合western blot检测细胞内SOX-9、p-SOX-9、COL-2A1的表达情况；

-E17d鸡胚胸骨柄来源的软骨细胞原代培养，培养基中添加不同浓度的CGA，WST-1/ATPlite细胞活力实验，p-Histone 3免疫荧光染色观察CGA对软骨细胞活力和功能状态的影响；阿利新蓝染色结合分光光度法分析软骨基质分泌情况，real-time PCR结合western blot检测细胞内Sox-9、COL-2A1、osteonectin、osteoponin(OPN)、osteocalcin(OCN)的表达；

-在交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片上构建软骨组织，SEM观察形貌，TEM观察内部结构，测试孔隙率、吸水率、降解率、表面接触角等物理性能，及细胞粘附率、增殖率、形成的软骨的功能等生物学性能；

在体实验：

-外科手术致新生鸡股骨外侧髁表面软骨损伤，将交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片移植至软骨损伤处8周后，通过足迹示踪、运动轨迹示踪等行为学评估、MRI超短波UTE序列观察、ELISA试剂检测关节腔积液、取材后番红O-固绿形态学染色观察关节软骨结构、PCR结合免疫荧光、Western Blot等手段，综合评估关节软骨的改变和修复。

3、结果与结论：

①通过离体实验，在细胞水平上证实了CGA促进软骨细胞增殖、增强活性的功效(图2-3)；相比contol组，CGA组pH₃表达增强，见E₂、F₂且CGA组F-actin相比于control组也增强。

②摸索了构建交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜的条件及相关测试实验，并证实CGA增强了鸡胚软骨干细胞的增殖和功能活性(图5-6)；H&E染色中，Contro组和CGA组相比于Alginate组中，海藻酸钠支架中有细胞存活，且CGA组活细胞数目多余Control组，Safranin-O染色中，CGA组表达高于Control组。

体外构建海藻酸钠-明胶共混膜作为3D支架，复合CGA和鸡胚软骨干细胞构建组织工程软骨，结果如图6所示，形态学染色后观察可见CGA促进软骨干细胞的增殖并上调软骨细胞活力，番红O染色明显强于对照组，表明软骨细胞分泌软骨基质的功能增强(unpublished data)。

③进一步在模型动物上观察了生物活性工程材料(即海藻酸钠-明胶共混膜)，交联CGA，术后8周CGA组雏鸡足迹较模型组清晰均匀，提示关节损伤修复效果良好(图7)。不同治疗方法对关节软骨损伤雏鸡修复后的关节组织学评估，H&E和Safranin-O染色中AddMaterial有同源细胞群及新生软骨产生；Sirius Red染色中Injury组中纤维化增强。

术后8周取动物膝关节切片，观察组织工程软骨的生长及损伤修复情况，结果如图7所示，结果显示移植物可形成组织块，部分填补关节面缺损，番红O染色提示移植物分化为软骨组织并分泌相应的基质。天狼星红染色后偏光显微镜观察，结果显示该移植物具有抑制软骨关节面纤维化的作用(unpublished data)。

足迹示踪实验显示与模型对照组相比，结果如图8所示，CGA组雏鸡足迹清晰均匀，提示关节损伤修复效果良好(unpublished data)。应用不同复合组合对软骨损伤雏鸡修复后的关节功能评估。B：描述孵化后14天雏鸡膝关节损伤模型和随后的治疗(B)的草图。C：步态分析的一个例子，其中蓝色脚印(左)是正常的，红色(右)的是来自损伤的一边。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

选取鸡胚软骨干细胞胰酶消化后，海藻酸钠溶液重悬并在细胞悬液中添加CGA，吹打均匀后取少量添加在CaCl₂溶液中，待海藻酸钠与鸡胚软骨干细胞聚合成形状稳定的3D复合物后，换软骨诱导培养基，体外培养14天后，备用，得到交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述的海藻酸钠溶液的浓度是2％；

所述的CGA的浓度是60μM；

所述的CaCl₂溶液的浓度是102mM；

所述的软骨诱导培养基为：含有10％胎牛血清的DMEM培养基。

3.一种交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片，其特征在于通过权利要求1或2所述的制备方法制备得到。

4.权利要求3所述的交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片在软骨建模中的应用。

5.一种鸡股骨外侧髁软骨损伤修复模型的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

新生鸡股骨外侧髁表面软骨损伤为模型，将交联CGA的海藻酸钠-明胶共混膜关节补片移植至软骨损伤处，得到鸡股骨外侧髁软骨损伤修复模型。