CN109517786A - 一种具有修复功能的多能干细胞制剂及其应用 - Google Patents

一种具有修复功能的多能干细胞制剂及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109517786A
CN109517786A CN201811213759.2A CN201811213759A CN109517786A CN 109517786 A CN109517786 A CN 109517786A CN 201811213759 A CN201811213759 A CN 201811213759A CN 109517786 A CN109517786 A CN 109517786A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cell
multipotential stem
cartilage
peripheral blood
culture medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811213759.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109517786B (zh
Inventor
麦锦连
殷香丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Marshal Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Guangzhou Marshal Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Marshal Biotechnology Co Ltd filed Critical Guangzhou Marshal Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201811213759.2A priority Critical patent/CN109517786B/zh
Publication of CN109517786A publication Critical patent/CN109517786A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109517786B publication Critical patent/CN109517786B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明公开了一种具有修复功能的多能干细胞制剂及其应用，属于再生医学和生物技术领域。本发明的多能干细胞制剂包括外周血来源多能干细胞、透明质酸钠、富血小板血浆和抗坏血酸。所述制剂可用于修复缺损软骨。本发明证实该制剂具有良好的生物相容性，缺损软骨修复效果优于多能干细胞与单一组分或其他两两或三三组合的复配，且大大缩短修复时间。本发明利用复合制剂注射到软骨缺损部位来修复软骨的方法，大大缩短了修复周期，适应范围广，实用价值大。相比之前构建组织工程化软骨的方法，本发明方法避免了填充物固定困难的问题，具有广阔的市场前景。

Description

一种具有修复功能的多能干细胞制剂及其应用
技术领域
本发明属于再生医学和生物技术领域，主要涉及一种具有修复功能的外周血来源的多能干细胞制剂及其应用。
背景技术
由于创伤、感染、肿瘤、外科手术和各种先天性骨骼畸形导致的软骨缺损修复问题一直以来是困扰临床医师的难题。关节软骨缺损是临床常见疾病，由于软骨组织内没有血管供应、神经支配和淋巴回流，加之细胞成分单一，其自身修复能力非常有限。在软骨发生缺损后，病人出现关节疼痛以及运动障碍，最终导致骨性关节炎，造成恶性循环，严重影响患者的生活质量。生物材料、种子细胞、生物活性的因子的不同组合在软骨缺损的修复中展现了不同的修复能力。
关节软骨缺损临床上较为常见，其修复治疗是骨科领域的棘手问题，成熟的关节软骨没有神经和血管，其营养主要从滑膜分泌的关节滑液中摄取，损伤后很难自身修复。当前治疗方法众多，包括手术与非手术治疗。如一般修复软骨缺损所采用的修复方法是体外构建组织工程化软骨后再植入缺损区，这种方法不仅适应范围窄，且填充物的固定困难，其实用价值较小。除了手术与非手术治疗，近些年还出现了生物治疗如自体软骨细胞移植、骨膜移植、骨软骨移植。但尚没有一种方法可以使修复组织恢复到受损前透明软骨的水平。
多能干细胞是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种多能细胞。正因为多能干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能，是软骨修复的理想种子细胞。多能干细胞广泛存在于骨髓、滑膜、脂肪、外周血、脐带血。国内外研究并应用于软骨修复最多的是骨髓来源的多能干细胞，较为成熟，但其取材受限且患者较难接受。外周血具有取材方便，来源广的优点，早已被国外学者重视，国内学者近年来也开始进行该方面的研究。然而，外周血中虽已被证实存在多能干细胞，但应用它进行软骨修复的文献鲜有报道，所以本领域技术人员也无法知晓外周血中的多能干细胞是否能用于软骨缺损的修复，以及如何进行向软骨分化的培养和修复应用，且效果如何。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有修复功能的外周血来源多能干细胞制剂及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种用于培养向软骨分化的多能干细胞的培养基，所述培养基为基础培养基中添加终浓度为10-100ug/mL的有抗坏血酸。
优选的，所述培养基为基础培养基中添加有终浓度为10-50ug/mL的抗坏血酸。
本发明的培养基中所添加的抗坏血酸有助于多能干细胞向成软骨分化。
事实上，一般来说，抗坏血酸并不适合用于干细胞的培养，因为它可能影响干细胞的干性(即干细胞没有了多向分化的能力)。而本发明中所制备的多能干细胞以及相关制剂主要用于修复缺损软骨，所以发明人在经过研发后，选择了合适的培养基，并添加了适量的抗坏血酸，可以避免抗坏血酸影响干细胞的干性，在保证质量的前提下，原代细胞可以在较短时间出现贴壁生长，传代后较短时间就可以获得P3代，且纯度较高。同时所得干细胞及相关制剂在体内培养时更容易向软骨分化。当然，在培养干细胞过程中，干细胞并未马上向软骨分化，但是这样处理后的干细胞，被注入动物体内以后，软骨修复效果更佳。
如果抗坏血酸的浓度太高或太低，会影响培养基的pH值及培养效果，并干细胞的干性。
本发明的培养基除了可以用于培养外周血来源的多能干细胞，还可以培养其他组织来源的多能干细胞。只是相对于其他组织(如骨髓、脂肪)来源，外周血来源多能干细胞取材广泛且易于获取，疼痛感小，患者较易接受。
优选的，所述培养基为本领域技术人员培养多能干细胞的常规培养基。如：DMEM、DMEM-F12、αMEM等。
优选的，所述培养基为低糖DEME培养基。
低糖DMEM培养基为常规的培养基，各个厂家均有生产，且成分一致。具体成分见表1。
表1低糖DMEM培养基成分
本发明实施例中所用的为GIBCO公司生产的低糖DEME培养基，货号为C11885500BT。
本发明通过在低糖DEME培养基中添加适量的抗坏血酸获得抗坏血酸培养基培养PB-MCS，原代细胞4天左右就可出现贴壁生长，经过传代13天左右获得P3代，纯度较高，而不加抗坏血酸的低糖DEME培养基培养原代细胞10天左右出现贴壁生长，20天左右到P3代，耗时长，效率低，所以抗坏血酸培养基培养PB-MCS在保证质量的前提下，缩短了时间，大大提高了效率。本发明证实本发明的复合抗坏血酸培养基不影响干细胞的干性，有利于多能干细胞(间充质干细胞)的增殖，较普通单一培养基增值效率高。
优选的，所述多能干细胞的来源包括外周血、骨髓、脂肪。
优选的，所述多能干细胞的来源为外周血。
一种外周血来源多能干细胞，所述外周血来源多能干细胞是由上述任一项所述培养基培养得到。
一种外周血来源多能干细胞制剂，所述外周血来源多能干细胞制剂包括上述外周血来源多能干细胞、透明质酸钠、富血小板血浆和抗坏血酸。
研究发现：抗坏血酸能促进胶原蛋白的合成，此外，在体内抗坏血酸有利于多能干细胞向成软骨分化，更好地修复软骨组织。透明质酸钠起润滑关节作用，富血小板血浆(PRP)+多能干细胞起修复作用。四者协同作用，有利于软骨缺损部位的修复，且恢复效果更佳，恢复时间更短。
本发明证实外周血来源的多能干细胞、透明质酸钠、富血小板血浆以及抗坏血酸的混合制剂有良好的生物相容性，软骨缺损修复效果优于多能干细胞与单一组分(如透明质酸钠或富血小板血浆)的复配，且大大缩短修复时间。
优选的，外周血来源多能干细胞制剂中抗坏血酸的浓度为10-150ug/mL。
本发明中实施例中设置的外周血来源多能干细胞制剂每0.3-1mL中包含外周血来源多能干细胞2-8×106个、富血小板血浆的添加量为10-30％v/v、抗坏血酸的浓度为10-150ug/mL、10mg/mL医用透明质酸钠凝胶70-90％v/v(余量)。由于制剂是直接注射到需要修复的部位，所以制剂中的抗坏血酸的浓度可以稍高于培养基中的抗坏血酸浓度。
一般来说，关节腔注射剂的常用规格是1mL。其中，外周血来源多能干细胞可以稍微多一点，但是容易造成成本的上升，所以可以根据需要来调整。发明人研究发现，外周血来源多能干细胞如果超过107个，不容易在制剂中混合均匀。富血小板血浆PRP(plateletrich plasma)，通常浓度在正常血小板浓度的五倍以上。本发明所用的方法是制备富血小板血浆的常规方法。此外，也可以购买商品化的富血小板血浆。制剂中富血小板血浆充当溶剂的角色，使得外周血来源多能干细胞混合在其中，所以富血小板血浆的含量可以根据需要调整。抗坏血酸的浓度为10-150ug/mL，浓度太高或太低，会影响pH值及培养诱导效果。制剂的余量为透明质酸钠凝胶。一般来说，用于关节腔注射的医用透明质酸钠规格为10-15mg/mL。
所以本发明外周血来源多能干细胞制剂中外周血来源多能干细胞、富血小板血浆、以及透明质酸钠的添加量按照本领域技术人员的公知常识去调整即可，或根据产品的成本预算来进行调整。
上述任一项所述的外周血多能干细胞制剂在制备修复缺损软骨的药剂中的应用。
一种修复缺损软骨的药剂，所述修复缺损软骨的药剂中包含有上述任一项所述的外周血来源多能干细胞制剂。
所述药剂还可以包括与修复缺损软骨有关的其他营养物质。
一种修复缺损软骨的方法，将上述任一项所述的外周血间充质干细胞制剂注射于软骨缺损部位。
一般来说，修复缺损软骨所采用的修复方法是体外构建组织工程化软骨后再植入缺损区，这种方法不仅适应范围窄，且填充物固定困难，其实用价值较小。而注射复合制剂避免了这一问题，并且大大缩短修复周期。本发明利用注射复合制剂(外周血来源多能干细胞结合透明质酸钠、富血小板血浆和抗坏血酸注射用细胞制剂)避免了这一问题，且大大缩短修复周期，适应范围广，实用价值大。相比之前构建组织工程化软骨的方法，本发明方法避免了填充物固定困难的缺陷，有广阔的市场前景。
国内外研究并应用于软骨修复最多的是骨髓多能干细胞，所述技术已较为成熟，但其取材受限且患者较难接受。而外周血来源广泛且较易获取，疼痛感小，患者较易接受。
本发明的有益效果是：
本发明通过在低糖DEME培养基中添加适量的抗坏血酸获得抗坏血酸培养基培养PB-MCS，可以避免抗坏血酸影响干细胞干性的问题，在保证质量的前提下，原代细胞4天左右就可出现贴壁生长，经过传代13天左右获得P3代，纯度较高；而不加抗坏血酸的低糖DEME培养基培养原代细胞10天左右出现贴壁生长，20天左右到P3代，耗时长，效率低，所以抗坏血酸培养基培养PB-MCS在保证质量的前提下，缩短了时间，大大提高了效率。
本发明实验证实，在培养基中加入抗坏血酸，有利于多能干细胞向成软骨分化，更好地修复软骨组织。
本发明证实外周血来源的多能干细胞、透明质酸钠、富血小板血浆以及抗坏血酸的混合制剂具有良好的生物相容性，缺损软骨修复效果优于多能干细胞与单一组分(如透明质酸钠或富血小板血浆)或其他两两或三三组合的复配，且大大缩短修复时间。
本发明利用复合制剂(外周血来源多能干细胞结合透明质酸钠、富血小板血浆和抗坏血酸注射用细胞制剂)注射到缺损软骨部位来修复软骨的方法，大大缩短了修复周期，适应范围广，实用价值大。相比之前构建组织工程化软骨的方法，本发明方法避免了填充物固定困难的问题，有广阔的市场前景。
外周血来源多能干细胞取材广泛且较易获取，比骨髓、脂肪等来源更加方便，疼痛感小，患者较易接受。
附图说明
图1为P3细胞表型检测结果；
图2为P3代冻存前细胞效果图；
图3为HYP含量分泌测定结果。
具体实施方式
实施例中所涉及到的英文简写，如下所示：
HYP：羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)是亚氨基酸之一，是一种非必需氨基酸，是胶原组织的主要成分之一，且为胶原中特有的氨基酸，尿羟脯氨酸(HYP)是骨吸收的主要生化指标。
HS：透明质酸钠；AA：抗坏血酸；MSC：多能干细胞。
下面结合具体实施例，对本发明做进一步的说明，但不限于此。
实施例一：外周血来源多能干细胞的分离培养
8只新西兰大白兔由广东省实验动物中心提供。
分批按SCF(10μg/kg.d)和G-CSF(10μg/kg.d)剂量连续五天背部皮下注射。白兔分别于动员后第六天以35mg/kg戊巴比妥钠耳缘静脉全麻。麻醉生效后每只心脏取血约50ml，注入预先肝素化抗凝的干燥试管中备用，另取一离心管，管内注入1.073g/L的Percoll分离液，将血液缓慢沿试管壁加在Percoll分离液上。以2500r/min速度离心20min，取上层血浆备用，后吸取云雾状的白膜层(单个核细胞层)，取另一干燥离心管，加入等量不含血清的低糖DEME培养液，1500r/min，5min洗涤两次。用低糖DMEM+10％v/v兔血浆以1×106/mL密度接种于25cm2塑料培养瓶中，5％CO2饱和湿度的CO2培养箱中，5天后首次换液，待细胞贴壁融合达到80％左右时0.25％胰酶消化，1传5传代培养。取P3细胞，待细胞贴壁融合达到80％左右时，消化收集细胞将之冻存，待动物模型建造前复苏细胞。
取第三代细胞进行表面标志物检测，细胞表型检测结果如图1。图1结果显示：培养的多能干细胞CD29、CD44为阳性，CD34、CD45为阴性。
P3代冻存前细胞如图2所示，其中图2中左图为10倍放大图，右图为40倍放大图。
实验结果：原代培养前3天细胞多处于悬浮状态，贴壁细胞少，形态以圆形或椭圆形为主。之后开始出现部分贴壁细胞，成短梭形，分布不均，同时夹杂较多的椭圆形单核细胞。4天后贴壁细胞逐渐增多，部分开始伸展成长梭形，悬浮细胞出现凋亡。13天后细胞传代到P3代，表面标记物检测显示P3代。
从上述结果可见，无论表型还是形态，分离所得细胞均符合外周血来源干细胞的特征。
实施例二抗坏血酸复合培养液对外周血来源多能干细胞培养的影响
复苏实施例一的细胞，以5×104个细胞/T25培养瓶进行接种，实验组的培养液为含有50ug/mL抗坏血酸的低糖DEME培养液，对照组的培养液为单一的低糖DEME培养液，置37℃，5％CO2饱和湿度的CO2培养箱中。于1、3、7、10天检测HYP分泌量，作三个重复，结果见图3和表2。
表2 HYP分泌量
表2和图3结果显示：虽然单纯培养液组HYP分泌水平随培养时间延长，分泌量不断增加，但都低于实验组分泌量。实验组在第1，3，7，10天HYP分泌量都高于单纯培养液组。由于HYP是胶原组织的主要成分之一，且为胶原中特有的氨基酸，胶原蛋白可分布于软骨中。因此，得出结论：添加抗坏血酸，更加有利于软骨细胞的增殖。
实施例三：兔关节软骨缺损模型的建立
健康3月龄兔35只，体重2.7±0.3kg，以2％戊巴比妥钠35mg/kg耳缘静脉注射全麻动物后加用1％利多卡因局麻，双膝关节备皮，仰卧，固定，消毒铺无菌单。取膝关节内侧切口，逐层切开至显露关节，髌骨外侧脱位，屈膝暴露股骨内外侧髁负重区，手摇钻低速垂直钻取一约直径4.0mm、深3.0mm的软骨缺损，深达软骨下骨，以缺损区微见红为好，造成全层关节软骨缺损模型。术毕冲洗逐层缝合关节。术后笼中自由活动，肌注抗生素3天。观察活动及切口情况。
实施例四：制剂的制备及效果验证
1、PRP(富血小板血浆)制备：用5mL肝素钠采血管采集5mL兔子耳缘外周血，800g离心10分钟，取除红细胞外的上层血浆及富集的血小板。1200g离心5分钟，去上层血浆，保留底部1mL液体即为富(集)血小板血浆。
PRP(platelet rich plasma)富血小板血浆，通常浓度在正常血小板浓度的五倍以上。本发明所用的方法是制备富血小板血浆的常规方法。
2、多能干细胞的制备：多能干细胞细胞复苏后，培养至细胞贴壁融合达到80％左右时，消化离心，细胞计数，根据表3调整细胞数量，400g离心后，去上清，用制备的富血小板血浆重悬多能干细胞，根据表3加入透明质酸钠和抗坏血酸。
3、按表3制备制剂，总体积均为0.5mL。
表3制剂成分
4、效果验证：于动物模型制作一周后开始关节内注射。
实验一：随机选取5只兔子，左膝注射表3中本发明制剂组2的制剂，右膝注射表3中对照组1的制剂。
实验二：随机选取5只兔子，左膝注射表3中本发明制剂组2的制剂，右膝注射表3中对照组2的制剂。
实验三：随机选取5只兔子，左膝注射表3中本发明制剂组2的制剂，右膝注射表3中对照组3的制剂。
实验四：随机选取5只兔子，左膝注射表3中本发明制剂组2的制剂，右膝注射表3中对照组4的制剂。
实验五：随机选取5只兔子，左膝注射表3中本发明制剂组2的制剂，右膝注射表3中对照组5的制剂。
实验六：随机选取5只兔子，左膝注射表3中本发明制剂组2的制剂，右膝注射表3中对照组6的制剂。
实验七：随机选取3只兔子，左膝注射表3中本发明制剂组1的制剂，右膝不注射任何制剂。
实验八：随机选取3只兔子，左膝注射表3中本发明制剂组3的制剂，右膝不注射任何制剂。
所有实验组每侧关节每周注射一次，连续三次，每次每只关节内注射0.5ml，注射完后笼中饲养，自由活动。分组情况见表4。
表4实验分组情况
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八
数量 5 5 5 5 5 5 3 3
左膝 制剂组2 制剂组2 制剂组2 制剂组2 制剂组2 制剂组2 制剂组1 制剂组3
右膝 对照组1 对照组2 对照组3 对照组4 对照组5 对照组6 阴性对照 阴性对照
5、取材及标本处理
于治疗后12周时气栓处死动物取材，观察缺损修复情况、新生组织类型及有无免疫反应
(1)大体观察：关节软骨修复组织表面、周围软骨改变、滑膜改变。
(2)组织学：取软骨缺损处组织及滑膜组织，10％福尔马林液固定，10％硝酸脱钙，石蜡切片，HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化。
6、结果
所有兔子均发现左膝(本发明)修复情况优于右膝(对照组)。实验一二三证实：本发明组合效果优于传统的方法，添加抗坏血酸更利于关节软骨的修复。实验四五六及七八证实：不同配方的制剂均能起到软骨修复的功效，但是均不及本发明细胞制剂的效果。具体结果如下：
本发明制剂组(所有兔子的左膝)大部分缺损修复良好，缺损区被修复组织填满，基本齐平、稍低或稍高于周围软骨面，表面较光滑，边界模糊但尚可见，颜色较正常，软骨发暗，透亮度较正常略差，质地较韧。HE染色显示为软骨样组织修复，可见软骨细胞存在，但细胞形态欠规则；浅层修复组织细胞无明显陷窝结构，排列较紊乱，纤维组织形成较明显；基质染色较正常减弱；修复组织与周围软骨未完全融合，界限可辨，部分存在浅层的空隙。关节内滑膜无明显增厚，HE染色未见到淋巴细胞聚集现象；滑膜光滑无颗粒感。
对照组：各对照组修复程度不同，但均明显次于本发明。大部分缺损修复表面不平整，色白，缺损区内组织填充不完全，边界可辨且较试验组清晰。组织学观察可见基质染色明显减弱，可见空白点，表面纤维化明显，修复细胞类似纤维细胞，修复组织同周边软骨的结合较差，且缺损周边组织出现软骨细胞凋亡的现象。
采用改良Pineda法进行评分，结果见表5。
表5组织学评分
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八
数量 5 5 5 5 5 5 3 3
左膝 4.90±2.48 5.21±1.72 4.88±1.04 4.63±2.11 5.06±1.73 4.94±1.29 5.71±0.84 4.36±1.32
右膝 9.26±1.22 10.62±1.02 11.80±0.67 8.89±2.03 9.87±0.97 9.08±1.34 13.10±0.72 13.10±0.72
注：采用Pineda改良组织学分级的方法，通过组间t'检验比较。最高分14分，正常关节软骨0分，得分越高修复质量越差。左膝(本发明)和右膝(对照组)相比，有显著差异(P<0.01)。
实施例五抗坏血酸复合培养液对外周血来源多能干细胞培养的影响
复苏实施例一的细胞，以5×104个细胞/T25培养瓶进行接种，实验组的培养液为含有1-150ug/mL抗坏血酸的低糖DEME培养液，对照组的培养液为单一的低糖DEME培养液，置37℃，5％CO2饱和湿度的CO2培养箱中。于1、3、7、10天检测HYP分泌量，作三个重复，结果见表6。
表6 HYP分泌量
表6结果显示：抗坏血酸浓度为10-100ug/mL时候，复合抗坏血酸培养基不影响干细胞的干性，且HYP分泌量都大于对照组。当抗坏血酸浓度为10-50ug/mL时候，HYP分泌量最大，更加有利于软骨细胞的增殖。
实施例六抗坏血酸复合培养液促进多能干细胞向成软骨分化
同实施例四的方法制备细胞制剂，所用干细胞为实施例五的组3和对照组1获得的干细胞。制剂配方见表7。
表7制剂配方
随机选取12只兔子，左膝注射组3的制剂，右膝注射对照组1的制剂。于治疗后8周、10周、12周、14周时随机气栓处死3只动物取材，观察缺损修复情况、新生组织类型及有无免疫反应。组织学评分结果如下：
表8组织学评分
注：采用Pineda改良组织学分级的方法，通过组间t'检验比较。最高分14分，正常关节软骨0分，得分越高修复质量越差。左膝(本发明)和右膝(对照组)相比，有显著差异(P<0.01)。
从表8结果可知，经抗坏血酸培养的多能干细胞做成的制剂更有利于软骨的修复，所用时间更短。

Claims (10)

1.一种用于培养向软骨分化的多能干细胞的培养基，其特征在于：所述培养基为基础培养基中添加有终浓度为10-100ug/mL的抗坏血酸。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基为基础培养基中添加有终浓度为10-50ug/mL的抗坏血酸。
3.根据权利要1所述的培养基，其特征在于：所述培养基为本领域技术人员培养多能干细胞的常规培养基。
4.根据权利要求1-3任一项所述的培养基，其特征在于：所述多能干细胞的来源包括外周血、骨髓，脂肪。
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于：所述多能干细胞的来源为外周血。
6.一种外周血来源多能干细胞，其特征在于：所述外周血来源多能干细胞是由权利要求1-5任一项所述培养基培养得到。
7.一种外周血来源多能干细胞制剂，其特征在于：所述外周血来源多能干细胞制剂包括权利要求6所述的外周血来源多能干细胞、透明质酸钠、富血小板血浆和抗坏血酸。
8.根据权利要求7所述的细胞制剂，其特征在于：外周血来源多能干细胞制剂中抗坏血酸的浓度为10-150ug/mL。
9.权利要求7-8任一项所述的外周血多能干细胞制剂在制备修复缺损软骨的药剂中的应用。
10.一种修复缺损软骨的药剂，其特征在于：所述修复缺损软骨的药剂中包含有权利要求7-8任一项所述的外周血来源多能干细胞制剂。
CN201811213759.2A 2018-10-18 2018-10-18 一种具有修复功能的多能干细胞制剂及其应用 Active CN109517786B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811213759.2A CN109517786B (zh) 2018-10-18 2018-10-18 一种具有修复功能的多能干细胞制剂及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811213759.2A CN109517786B (zh) 2018-10-18 2018-10-18 一种具有修复功能的多能干细胞制剂及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109517786A true CN109517786A (zh) 2019-03-26
CN109517786B CN109517786B (zh) 2022-06-17

Family

ID=65772663

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811213759.2A Active CN109517786B (zh) 2018-10-18 2018-10-18 一种具有修复功能的多能干细胞制剂及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109517786B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110433283A (zh) * 2019-08-04 2019-11-12 丰泽康生物医药（深圳）有限公司 一种外周血多潜能细胞活性物联合富血小板血浆制备用于糖皮质激素依赖性皮炎的药物及其制备方法和应用
US20220175832A1 (en) * 2020-12-08 2022-06-09 Todd Frank Ovokaitys Methods and Systems for Increased Production of Stem Cells
US20240262731A1 (en) * 2021-06-24 2024-08-08 Process Limited A System And Method For Recovering Ammonia From an Ammonia-Containing Liquid

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102026546A (zh) * 2008-03-14 2011-04-20 再生科学有限责任公司 软骨修复的合成物和方法
CN104524636A (zh) * 2014-12-19 2015-04-22 中国人民解放军第四军医大学 通过定向诱导骨髓间充质干细胞获得组织工程软骨的方法
CN104958320A (zh) * 2015-07-29 2015-10-07 西安芙金细胞科技有限公司 一种治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备方法
US20150284686A1 (en) * 2012-09-03 2015-10-08 Medipost Co., Ltd. Method for Culturing Mesenchymal Stem Cells

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102026546A (zh) * 2008-03-14 2011-04-20 再生科学有限责任公司 软骨修复的合成物和方法
US20150284686A1 (en) * 2012-09-03 2015-10-08 Medipost Co., Ltd. Method for Culturing Mesenchymal Stem Cells
CN104524636A (zh) * 2014-12-19 2015-04-22 中国人民解放军第四军医大学 通过定向诱导骨髓间充质干细胞获得组织工程软骨的方法
CN104958320A (zh) * 2015-07-29 2015-10-07 西安芙金细胞科技有限公司 一种治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
顾其胜等: "《透明质酸与医学》", 30 November 2002 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110433283A (zh) * 2019-08-04 2019-11-12 丰泽康生物医药（深圳）有限公司 一种外周血多潜能细胞活性物联合富血小板血浆制备用于糖皮质激素依赖性皮炎的药物及其制备方法和应用
CN110433283B (zh) * 2019-08-04 2023-12-26 丰泽康生物医药（深圳）有限公司 一种外周血多潜能细胞活性物联合富血小板血浆制备用于糖皮质激素依赖性皮炎的药物及其制备方法和应用
US20220175832A1 (en) * 2020-12-08 2022-06-09 Todd Frank Ovokaitys Methods and Systems for Increased Production of Stem Cells
US20240262731A1 (en) * 2021-06-24 2024-08-08 Process Limited A System And Method For Recovering Ammonia From an Ammonia-Containing Liquid

Also Published As

Publication number Publication date
CN109517786B (zh) 2022-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Human urine‐derived stem cells: potential for cell‐based therapy of cartilage defects
JP5928961B2 (ja) 滑膜由来間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）の軟骨・半月板再生への応用
CN106754668B (zh) 一种干细胞培养液及注射液
CN104958320A (zh) 一种治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备方法
CN104988117A (zh) 从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法
CN107338218A (zh) 一种诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的诱导剂和方法
CN108865986B (zh) 用于修复关节软骨损伤/缺损的间充质干细胞制剂及其制备方法和应用
CN109517786A (zh) 一种具有修复功能的多能干细胞制剂及其应用
CN113244272B (zh) 用于改善卵巢早衰的组合物及其制备方法和应用
CN110438072A (zh) 脂肪间充质干细胞的制备方法
Burdis et al. Spatial patterning of phenotypically distinct microtissues to engineer osteochondral grafts for biological joint resurfacing
CN103100112A (zh) 一种双膜结构移植材料的制备方法及用途
Bahrani et al. Differentiation of adipose-derived stem cells into ear auricle cartilage in rabbits
CN108670946A (zh) 治疗关节软骨损伤的细胞凝胶制剂及其用途和所用的保持冻存细胞活性的凝胶溶液
CN104962517A (zh) 自组装间充质干细胞团块的制备、诱导分化及应用
Jin et al. Implantation of bone marrow-derived buffy coat can supplement bone marrow stimulation for articular cartilage repair
CN112294845A (zh) 一种修复关节软骨损伤的滑膜间充质干细胞联合prp制剂及其制备方法和应用
Dai et al. In vivo studies of mesenchymal stem cells in the treatment of meniscus injury
CN110124107B (zh) 一种用于关节软骨修复的plga细胞支架及其制备方法和应用
CN110935010A (zh) 一种干细胞制剂和生长因子组合物及其制备方法和应用
EP2582410B1 (en) Methods for complex tissue engineering
Huh et al. The effect of platelet rich plasma combined with microfracture for the treatment of chondral defect in a rabbit knee
CN106474156A (zh) 组合物在制备药物中的用途
CN107693844A (zh) 一种组合物凝胶与应用
CN109999185B (zh) 一种用于修复损伤的组合物及其制备方法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant