CN109289088A

CN109289088A - 一种负载鸡血藤的ⅰ型/ⅲ型胶原复合支架

Info

Publication number: CN109289088A
Application number: CN201811258469.XA
Authority: CN
Inventors: 王建华; 王营营; 黄晨光; 孙晓敏; 张其清
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2038-10-26
Also published as: CN109289088B

Abstract

本发明公开一种负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架。该支架以牛源型胶原蛋白、重组人源

Description

一种负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架

技术领域

本发明属于生物医用领域，具体涉及一种负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架及其制备方法。

背景技术

近年来，我国关节疾病的发病人数不断攀升。关节软骨是一种极复杂的表面光滑且富有光泽的透明样软骨结缔组织，其在关节活动中主要起负重和运动作用。当软骨发生损伤后，其营养汲取受限，组织缺乏血供，会导致损伤部位病情逐渐恶化，最终可发展为膝骨性关节炎（Knee osteoarthritis，KOA），其临床主要表现为膝骨关节持续性疼痛、肿胀、活动障碍、膝关节畸形严重甚至致残，严重影响了患者的生活和健康。虽然KOA发病原因很多，但软骨以及软骨下骨的缺损和退行性改变是引起KOA的一大原因。目前，KOA总体治疗原则是中西医结合以及药物治疗与非药物治疗相结合，必要时进行手术治疗。但手术治疗尚不能全面恢复软骨受损组织原有的健康形态和生理功能，且存在供体来源有限、供区继发病变和免疫排斥反应等不足。

随着科技进步，软骨组织工程的发展为软骨缺损修复提供了新的治疗策略。在软骨修复材料中，Ⅰ型胶原具有诱导软骨细胞合成Ⅱ型胶原的作用，其中Ⅰ型胶原的三维网状结构是其产生、分泌和储存Ⅱ型胶原蛋白以及新生软骨细胞外基质内矿物沉积的关键。Ⅰ型胶原支架材料被证明能加快细胞粘附、迁移，促进软骨损伤自我修复。此外，重组人源胶原蛋白（RHC）是一种利用基因工程技术，以人型胶原蛋白基因序列为模板，将其特征和主要功能序列重新优化设计，导入酵母细胞然后经过酵母菌发酵得出的产物，其在结构、特性等方面与人类自身胶原蛋白高度一致，并具有良好的生物相容性、细胞黏附性，可为细胞提供充足的养分促进新细胞的形成和止血功能，并且其促进上皮细胞生长作用更强。有研究表明在胎儿和损伤修复新生成的软骨样组织中均发现有大量Ⅲ型胶原蛋白生成。

在药理学上，中医认为KOA的发病之本是肝肾亏虚、精血不足，发病之标是经络血脉瘀阻，而在感受外邪或在跌扑闪挫诱因的作用下，气血运行不畅，导致瘀血痹阻经脉，不通则痛，则属于本虚标实。鸡血藤是常用活血化淤中药，鸡血藤性温味甘苦，具有补血养血，活血通经，舒筋活络的功效，常用于治疗腰膝酸痛，关节风湿痛症。现代药理研究证实，鸡血藤总黄酮有调节免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、升高一氧化氮合酶、激活酪氨酸酶等多种药理作用。体外鸡血藤总黄酮对一氧化氮( NO)、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素6 (IL-6)分泌水平的升高具有显著抑制作用(P＜0.05)。说明鸡血藤总黄酮在体内和体外均具有良好的抗炎效果。在临床上，应用鸡血藤合并多种中药进行中药离子导入治疗KOA已有大量报道，其治疗效果显著。

本发明综合天然胶原和重组人源胶原的优点，并结合鸡血藤对KOA的治疗作用，制备一种可用于KOA软骨缺损修复的复合支架。它通过释放所负载的鸡血藤以抑制炎症因子、并结合Ⅰ型/Ⅲ型胶原引导软骨组织再生修复作用从而达到缓解和治疗KOA的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架及其制备方法。所制备的复合支架，具有良好的生物相容性、可降解性和免疫原性低的特点，能有效促进KOA软骨的再生性修复，是一种较好的适用于中、早期骨关节炎治疗的医用材料。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架，以牛源型胶原蛋白和重组人源型胶原蛋白为原料制得。上述0.8 wt.%的牛源型胶原蛋白溶液、0.8 wt.%的重组人源型胶原蛋白溶液质量比分别为1-3:3-1。

上述型胶原蛋白源于牛腱，所述型胶原蛋白源于利用基因工程经过酵母菌发酵得出的产物。

所述一种负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架的制备方法包括如下步骤：

（1）分别将型胶原蛋白、型胶原蛋白溶于丙二酸中制备成一定浓度的型胶原蛋白溶液和型胶原蛋白溶液；

（2）将步骤（1）所得的型胶原蛋白溶液和型胶原蛋白溶液混合，搅拌均匀，冷冻干燥后浸泡在交联剂中进行交联，所述交联剂为1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺（EDC）、N-羟基丁二酰（NHS）溶于90%乙醇溶液中制得，其中EDC和NHS的最终浓度分别为20 mmol/L,50 mmol/L；

（3）交联后反复用去离子水清洗，二次冷冻干燥后即得到未负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架；

（4）制备包载鸡血藤的PLGA微球；

（5）将步骤（4）制备的包载鸡血藤的PLGA微球按1.5 mg/cm²的负载量用1 mL注射器均匀注射至步骤（3）制备的型/型胶原支架内部，再次冷冻干燥后即得到负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架。

步骤（1）所述型、型胶原蛋白溶液浓度均为0.8wt.%。

所述包载鸡血藤的PLGA微球制备方法如下：

（1）准确称取0.06 g PLGA（分子量为5万，比例为75:25），溶于1.2 mL 二氯甲烷中，置于4℃冰箱密封保存备用；

（2）准确称量0.5 mg鸡血藤置于10 mL超纯水中，在37℃下使其完全溶解；

（3）再准确称取0.09 g PVA 置于9 mL超纯水中，在60℃水浴中使其完全溶解；

（4）取步骤（2）所述鸡血藤溶液600 uL缓慢注入步骤（1）所述PLGA中；

（5）将步骤（4）所述的混合液体用探头振幅为35 %、3 mm形探头的细胞破碎仪（功率为200 W）于冰水浴中乳化2 min，形成初乳；

（6）将步骤（5）中形成的初乳立即倒入步骤（3）PVA溶液中，然后用步骤（5）中的细胞破碎仪于冰水浴中乳化2 min，形成复乳；

（7）将步骤（6）所述复乳充分离心，弃上清液，再用超纯水反复冲洗离心4次，冷冻干燥，在-20℃下避光保存。

本发明的优点在于：

本发明制备的负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架呈三维网状结构，具有良好的孔隙率和溶胀率，其孔隙率和溶胀率可分别高达84.9 %和40.6 %。该复合支架对所负载的鸡血藤控缓释放可长达12周，是一种较好的适用于中、早期骨关节炎软骨缺损修复的医用材料。

附图说明

图1是负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架的扫描电镜图。图中1:0、1:1、1:2、1:3、2:1、3:1分别代表复合支架中型:型胶原蛋白的质量比。

图2是实施例1制备的复合支架及其所负载鸡血藤PLGA微球的扫描电镜图。

图3 是负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架的吸水率测试图。

具体实施方式

一种负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架。

实施例1

（1）①准确称取0.06 g PLGA（分子量为5万，比例为75:25），溶于1.2 mL 二氯甲烷中，置于4℃冰箱密封保存备用；②准确称量0.5 mg鸡血藤置于10 mL超纯水中，在37℃下使其完全溶解；③再准确称取0.09 g PVA 置于9 mL超纯水中，在60℃水浴中使其完全溶解；取步骤②所述鸡血藤溶液600 uL缓慢注入步骤①所述PLGA溶液中；将步骤所述的混合液体用探头振幅为35 %、3 mm锥形探头的细胞破碎仪（功率为200 W）于冰水浴中乳化2min，形成初乳；将步骤中形成的初乳立即倒入步骤PVA溶液中，然后用步骤中的细胞破碎仪于冰水浴中乳化2 min，形成复乳；将步骤所述复乳充分离心，弃上清液，再用超纯水反复冲洗离心4次，冷冻干燥，在-20℃下避光保存。

（2）称取80 g，0.1%的牛腱型胶原溶液，加入20 mL浓度为0.1% 的冰乙酸溶液稀释成质量分数为0.8 %的型胶原溶液，放置在磁力搅拌器上搅拌溶解6小时。

（3）称取1.0 g重组人源型胶原蛋白，溶于80 mL浓度为0.1% 的冰乙酸溶液中，放置在磁力搅拌器上搅拌溶解6小时，制备质量分数为0.8 %的重组人源型胶原蛋白溶液。

（4）将0.8 %的牛腱型胶原蛋白溶液和0.8 %的重组人源型胶原蛋白溶液按1：1的质量比加入50 mL烧杯中，放在磁力搅拌器上搅拌过夜，然后将混合液加入到48孔板中进行冷冻干燥；用交联剂交联冻干的复合材料，用去离子水反复冲洗交联后的复合支架至中性，其交联剂由1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺（EDC）、N-羟基丁二酰（NHS）溶于90%乙醇溶液中制得，其中EDC和NHS的最终浓度分别为20 mmol/L, 50 mmol/L；然后二次冷冻干燥，得到未负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架。

（5）将步骤（1）制备的包载鸡血藤的PLGA微球按1.5 mg/cm²的负载量用1 mL注射器均匀注射至步骤（4）制备的复合支架内部，再次冷冻干燥后即得到负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架，记为A。其孔隙率和溶胀率可分别高达84.9 %和40.6 %。

实施例2

改变步骤4）中0.8 %的牛腱型胶原蛋白溶液、0.8 % 重组人源型胶原蛋白溶液的质量比为1：2，其他步骤与实施例1相同，制备复合材料B。其孔隙率和溶胀率可分别高达83.9%和40.1 %。

实施例3

改变步骤4）中0.8 %的牛腱型胶原蛋白溶液、0.8 % 重组人源型胶原蛋白溶液的质量比为1：3，其他步骤与实施例1相同，制备复合材料C。其孔隙率和溶胀率可分别高达84.1%和40.2 %。

实施例4

改变步骤4）中0.8 %的牛腱型胶原蛋白溶液、0.8 % 重组人源型胶原蛋白溶液的质量比为2：1，其他步骤与实施例1相同，制备复合材料D。其孔隙率和溶胀率可分别高达81.1%和39.6 %。

实施例5

改变步骤4）中0.8 %的牛腱型胶原蛋白溶液、0.8 % 重组人源型胶原蛋白溶液的质量比为3：1，其他步骤与实施例1相同，制备复合材料E。其孔隙率和溶胀率可分别高达83.1%和39.8 %。

实施例6

负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架的吸水率测试：

将实施例1-实施例5制备的干燥负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架分别用打孔器打孔，直径为5 mm，称其质量W1，浸入PBS (PH=7.4)，放在37 ℃水浴中溶胀，24 h后取出，吸干表面水分，称其重量W0，按下式计算吸水率，实验平行3次，取其平均值。

吸水溶胀率（%）=（W0- W1）/W1×100％

式中W1为材料干重(mg)，W0为溶胀后材料湿重(mg)。

结果如图3：上述5个实施例制备的负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架都具有较高的吸水性，其中A的吸水率最高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种用于骨关节炎软骨缺损修复的负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架，其特征在于：以牛源型胶原蛋白和重组人源型胶原蛋白为原料制得，上述0.8wt.%的牛源型胶原蛋白溶液、0.8wt.%的重组人源型胶原蛋白溶液质量比分别为1-3:3-1。

2.根据权利要求1所述的负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架，其特征在于：所述型胶原蛋白源于牛腱，所述型胶原蛋白源于利用基因工程经过酵母菌发酵得出的产物。

3.一种如权利要求1所述的负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（2）将步骤（1）所得的型胶原蛋白溶液和型胶原蛋白溶液混合，搅拌均匀，冷冻干燥后浸泡在交联剂中进行交联；

（3）交联后反复用去离子水清洗，二次冷冻干燥后得到未负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架；

（4）制备包载鸡血藤的PLGA微球；

（5）将步骤（4）制备的包载鸡血藤的PLGA微球按1.5 mg/cm²的负载量用1 mL注射器均匀注射至步骤（3）制备的支架内部，再次冷冻干燥后即得到负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架。

4.根据权利要求3所述的一种负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架制备方法，其特征在于：所述包载鸡血藤的PLGA微球制备方法如下：

（1）准确称取0.06 g PLGA，溶于1.2 mL二氯甲烷中，置于4℃冰箱密封保存备用；

（4）取步骤（2）所述鸡血藤溶液600 uL缓慢注入步骤（1）所述PLGA溶液中；

（5）将步骤（4）所述混合液体用探头振幅为35 %、3 mm锥形探头的细胞破碎仪于冰水浴中乳化2 min，形成初乳；

（7）将步骤（6）所述复乳充分离心，弃上清液，再用超纯水反复冲洗离心4次，冷冻干燥，于-20℃下避光保存。

5. 根据权利要求3所述的一种负载鸡血藤的Ⅰ型/Ⅲ型胶原复合支架制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述交联剂由1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺（EDC）、N-羟基丁二酰（NHS）溶于90%乙醇溶液中制得，其中EDC和NHS的最终浓度分别为20 mmol/L、50 mmol/L。