CN102743795A

CN102743795A - 虎杖甙填充胶原支架及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102743795A
Application number: CN2012101461379A
Authority: CN
Inventors: 刘文广; 孙亮; 王玮
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2012-05-11
Filing date: 2012-05-11
Publication date: 2012-10-24

Abstract

本发明公开了虎杖甙填充胶原支架及其制备方法和应用，以胶原为原料通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联后冻干后得到胶原为主体的支架，以己二酸改性的葡聚糖修饰虎杖甙改善其溶解性，最后将胶原支架浸渍在改性后虎杖甙的溶液中，利用改性虎杖甙填充修饰胶原支架。本发明以组织工程的基本思想为指导，以生物相容性良好的胶原为主要组成，在体外培养供软骨细胞生长的三维胶原支架，并通过改性以改善虎杖甙的溶解性，为其修饰组织工程支架提供方便。

Description

虎杖甙填充胶原支架及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及组织工程支架领域，更具体地说，涉及一种胶原支架及其制备方法和应用。

背景技术

关节疾病和关节软骨损伤是人类面临的主要健康问题之一，会直接导致关节功能的障碍、劳动力的部分或全部丧失。关节疾病中最常见的是关节炎，根据最新统计数字显示美国关节炎患者达两千万之众，患病人群主要是65岁以上的老人。预计到2030年，美国社会65岁以上人口将超过七千万，占总人口的70％，而他们中的很多人都将面临患关节炎的危险。随着老龄化的加快，关节炎患者将逐年增加，治疗软骨疾病和关节软骨损伤成为临床上亟待解决的难题之一。至今为止，关节炎仍是无药可医，现在就常用的治疗方式是外科手术法。然而最近一项涉及到全球46个国家和285名知名的外科医生调查结果显示，82％的医生认为目前软骨治疗方法都是短期有效的。组织工程技术的出现及发展为软骨疾病的治疗带来了新的希望，可利用生物相容性良好的材料为主要成份，在体外培养供软骨细胞生长的三维支架。

研究表明一氧化氮(NO)是关节炎发病过程中的重要炎症介质，是一种新发现的生物信息递质，是软骨损伤的主要危害源之一，营养品中的透明质酸盐、皮质类固醇、虎杖甙对关节炎有延缓和减轻的作用，但是由于虎杖甙不溶于水，因此限制了其在组织工程支架领域的应用和发展。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，以组织工程的基本思想，基本理论为指导，提供一种虎杖甙填充胶原支架及其制备方法和应用，以生物相容性良好的胶原为主要组成，在体外培养供软骨细胞生长的三维胶原支架，并通过改性以改善虎杖甙的溶解性，为其修饰组织工程支架提供方便。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

虎杖甙填充胶原支架，以胶原为原料通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的交联后冻干后得到胶原为主体的支架，以己二酸改性的葡聚糖修饰虎杖甙改善其溶解性，最后将胶原支架浸渍在改性后虎杖甙的溶液中，利用改性虎杖甙填充胶原支架。

首先，即步骤1，选用胶原为原料通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的交联后冻干后得到胶原为主体的支架，具体反应原理如下(Liu Y，Griffith M，Matsky M.A，et al.Properties of porcine andrecombinant human collagen matrices for optically clear tissue engineeringapplications.Biomaromolecules，2006，7(6)：1819-1828.)：

其次，即步骤2，将N，N′-羰基二咪唑(CDI)活化的己二酸和葡聚糖混合反应，再将产物与N，N′-羰基二咪唑(CDI)活化的虎杖甙进行反应，得到改性的虎杖甙，具体反应原理如下：

将葡聚糖(DEX)倒入二甲基亚砜中，再将该烧瓶密封后置于80℃的油浴锅中，待DEX完全溶解，反应即可终止。

选用N，N′-羰基二咪唑(CDI)对己二酸进行活化，选用二甲基亚砜(DMSO)为溶剂，即将己二酸和CDI分别加入二甲基亚砜中(DMSO)溶解，然后混合倒入烧瓶中，置于常温20-25摄氏度下搅拌，由于该反应产生大量的气泡，故不需密封处理。待反应不再产生气泡后，将活化后的己二酸倒入上述装有DEX的容器中，常温20-25摄氏度下混合反应至少8小时，优选8-12小时，更加优选10-12小时。最后将产物装入透析袋(截留分子量为3500)，进行透析3-4天，用旋转蒸发仪蒸出已透析好的产物中的水分，进行冷冻干燥2-3天。

选用二甲基亚砜(DMSO)为溶剂，即将虎杖甙和N，N′-羰基二咪唑(CDI)分别加入二甲基亚砜中(DMSO)溶解，两者混合后在70-100℃，优选80-100℃油浴中反应至少3小时，优选5-10小时。待反应结束后，使用反应体系10倍体积的乙醚进行萃取，可以观察到溶液分别上下两层，将下层黄色透明油状物从分液漏斗下端倒入容器中待用。

称取己二酸-葡聚糖产物，用DMSO溶解后与上述待用溶液混和后，常温20-25摄氏度下反应至少12个小时，优选20-24小时。上述反应结束后，透析(截留分子量为3500)3-4天后，旋蒸。将产物置于冷冻干燥机中干燥即可的到最终产物。

最后，即步骤3，将步骤2制备的改性的虎杖甙溶于水，然后将步骤1制备的胶原支架浸渍其中，利用改性的虎杖甙对胶原支架进行填充或者修饰，可选用室温20-25摄氏度下浸泡至少8小时，优选8-12小时，更加优选10-12小时。

经美国FEI公司Nova NanoSEM高分辨扫描电子显微镜表征，如图1所示，可知支架形貌基本保持，并具有多孔结构；经500MHz高分辨超导核磁共振谱仪Varian INOVA，关国进行核磁共振的表征，如图2所示，选用二甲基亚砜作为溶剂，a为葡聚糖，b为虎杖甙，c为虎杖甙接枝葡聚糖，c综合反应了葡聚糖和虎杖甙的结构特点，化学位移9.5特征峰为虎杖甙上酚羟基特征峰，说明葡聚糖和虎杖甙实现反应目的。除此之外，可将透析后的产物用纯水溶解，检验其能使三氯化铁水溶液变色，说明截留的大分子中存在虎杖甙上酚羟基，进一步证明葡聚糖和虎杖甙实现反应目的。

一氧化氮(NO)是关节炎发病过程中的重要炎症介质，是一种新发现的生物信息递质，是软骨损伤的主要危害源之一。虎杖甙能抑制一氧化氮合成酶(NOS)的活性，从而减轻关节软骨的损伤。利用虎杖甙延缓关节炎发病过程的作用，将其添加到胶原支架中以帮助软骨修复。本发明的技术方案中，利用己二酸改性的葡聚糖修饰虎杖甙改善其溶解性，然后将胶原支架浸渍在改性后虎杖甙的溶液中，利用改性虎杖甙填充胶原支架，以生物相容性良好的胶原为主要组成，在体外培养供软骨细胞生长的三维胶原支架，为其修饰组织工程支架提供方便。

附图说明

图1支架的形貌SEM照片，其中a为放大50倍；b为放大100倍(美国FEI公司NovaNanoSEM高分辨扫描电子显微镜)。

图2虎杖甙接枝葡聚糖的核磁共振谱图，其中(a)葡聚糖在二甲基亚砜作溶剂时的核磁图；(b)虎杖甙在二甲基亚砜作溶剂时的核磁图；(c)虎杖甙接枝葡聚糖在二甲基亚砜作溶剂时的核磁图(500MHz高分辨超导核磁共振谱仪Varian INOVA，美国)。

图3骨细胞植入支架后第十四天的生长情况，其中a、c为空白胶原膜片，a为放大10倍，c为放大20倍；b、d为加入虎杖甙的胶原膜片，b为10倍，d为20倍。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。选用去端肽猪皮I型胶原，葡聚糖40000(DEXT40)进行实验。

选用胶原为原料通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的交联后冻干后得到胶原为主体的支架：称量0.18-0.2g的胶原，溶于超纯水中；称取3-6mgNHS，10mgEDC放入到1ml的离心管中，用50ml的超纯水溶解；将溶液混合均匀，并反应交联反应；可使用有机玻璃片(10cm*10cm*0.5mm)或模具(厚500μl，直径12mm)进行反应；然后将支架放在100％湿度的条件下室温反应16小时，移入37℃然后连续熟化5小时。打开模具取出支架样品，放入10mM磷酸盐缓冲液中(PBS pH＝7.4)浸泡，每隔一小时更换一次PBS，清洗7天后，然后将其分别装在扎有空洞的离心管中，放入冷冻干燥机中冻干，两三天后可以得到最终的产物胶原支架。

将N，N′-羰基二咪唑(CDI)活化的己二酸和葡聚糖混合反应，再将产物与N，N′-羰基二咪唑(CDI)活化的虎杖甙进行反应，得到改性的虎杖甙：

1.取两个25ml的烧瓶、2个塞子和2格磁子洗净吹干，放入烘箱。

2.称取3g左右的己二酸加入二甲基亚砜(DMSO)溶解。称取1g左右的N，N′-羰基二咪唑(CDI)，用DMSO溶解。待上述两种物质分别溶解后混和倒入烧瓶中，放入磁子，置于常温搅拌。由于该反应产生大量的气泡，故不需密封处理

3.用烧瓶称取1g的葡聚糖(DEX)，倒入6-15mlDMSO，将该烧瓶密封

4.观察己二酸的反应没有气泡溢出，便可将其倒入装有DEX的烧瓶中。以上溶液混合后室温反应10小时左右，将产物装入3500的透析袋，透析3-4天。

5.用旋转蒸发仪蒸出已透析好的产物中的水分，将蒸馏产物放入小碟子中等待冷冻干燥。冷冻干燥2-3天后，取出产物，计算产率。

6.称0.4g虎杖甙(PD)，用DMSO溶解。称取0.162gCDI，用DMSO溶解，将两者混和加入50ml干燥的烧瓶中，放入80℃油浴中反应3小时。

7.用反应物10倍体积的乙醚萃取上述产品，观察到溶液分为上下两层，将下层黄色透明油状物从分液漏斗下端倒出，放进50ml烧瓶中，得到活化的PD。

8.称取己二酸-葡聚糖产物，用DMSO溶解，然后与活化PD两者混和后继续反应12小时。

9.上述反应结束后，透析3-4天后，旋蒸。将产物置于冷冻干燥机中干燥即可的到最终产物。用纯水将产物溶解，检验其能使三氯化铁变色，说明达到反应目的。

最后将制备的改性的虎杖甙溶于水，然后将制备的胶原支架浸渍其中，利用改性的虎杖甙对胶原支架进行填充，室温下浸泡10小时。

通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的交联后冻干方法，分别制备纯胶原支架、上述制备的虎杖甙填充修饰胶原支架。两组各做五片厚500μm后的薄片，浸润在PBS中。3-4天后，用直径为12μm的打孔器处理上述支架，然后将其移至75wt％的酒精水溶液中进行消毒，浸泡1-2天后，放入细胞培养皿中。

将已知数量的软骨细胞离心分离后，用纤维蛋白原溶液将细胞分散，配制成50万/mL的纤维蛋白原溶液(20mg/mL)。将细胞纤维蛋白原溶液在负压的作用下导入多孔支架中。然后，在负压的作用下把凝血酶的氯化钙溶液(5U/mL)导入。用无菌纱布吸去支架表面液体，放入24孔培养板中；将培养板放入37摄氏度的恒温培养箱中，充分孵育30min，待纤维蛋白原完全凝胶后，每孔加入2mL DMEM培养基。

利用荧光显微镜(Olympus BX51荧光倒置显微镜)观测软骨细胞的生长状况，从14天后软骨细胞的荧光显微镜图(图3)可知，添加虎杖甙的实验组的软骨细胞的生长情况明显好于空白的胶原组。图中左侧的空白胶原组中软骨细胞数量继续增加，但是其呈现细长的纤维状，已失去了继续分化的能力，此种细胞不能对损伤的软骨部位进行修复。图中右侧的照片显示，在加入虎杖甙后，软骨细胞的数目继续增加，细胞密度大，但是细胞仍是圆形或多角形，说明这一组的软骨细胞生命活性强，生长状况良好，同时也证明虎杖甙确实具有激励软骨细胞生长的作用。

本申请中所述的“天”系指24小时。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims

1.虎杖甙填充胶原支架，以胶原为原料通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联后冻干后得到胶原为主体的支架，其特征在于，以己二酸改性的葡聚糖修饰虎杖甙改善其溶解性，最后将胶原支架浸渍在改性后虎杖甙的溶液中，利用改性虎杖甙填充胶原支架。

2.虎杖甙填充胶原支架的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：

首先，即步骤1，选用胶原为原料通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联后冻干后得到胶原为主体的支架

其次，即步骤2，将N，N′-羰基二咪唑活化的己二酸和葡聚糖混合反应，再将产物与N，N′-羰基二咪唑活化的虎杖甙进行反应，得到改性的虎杖甙

最后，即步骤3，将步骤2制备的改性的虎杖甙溶于水，然后将步骤1制备的胶原支架浸渍其中，利用改性的虎杖甙对胶原支架进行填充或者修饰。

3.根据权利要求2所述的虎杖甙填充胶原支架的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，选用N，N′-羰基二咪唑对己二酸进行活化，选用二甲基亚砜为溶剂，即将己二酸和N，N′-羰基二咪唑分别加入二甲基亚砜中溶解，然后混合倒入烧瓶中，置于常温20-25摄氏度下搅拌。

4.根据权利要求2所述的虎杖甙填充胶原支架的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，将活化后的己二酸倒入上述装有葡聚糖的容器中，常温20-25摄氏度下混合反应至少8小时；最后将产物装入透析袋进行透析3-4天，用旋转蒸发仪蒸出已透析好的产物中的水分，进行冷冻干燥2-3天。

5.根据权利要求4所述的虎杖甙填充胶原支架的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，常温20-25摄氏度下混合反应优选8-12小时，更加优选10-12小时。

6.根据权利要求2所述的虎杖甙填充胶原支架的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，将虎杖甙和N，N′-羰基二咪唑分别加入二甲基亚砜中溶解，两者混合后在70-100℃油浴中反应至少3小时；待反应结束后，使用反应体系10倍体积的乙醚进行萃取，将下层黄色透明油状物从分液漏斗下端倒入容器中待用。

7.根据权利要求6所述的虎杖甙填充胶原支架的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，将虎杖甙和N，N′-羰基二咪唑分别加入二甲基亚砜中溶解，两者混合后在80-100℃油浴中反应5-10小时。

8.根据权利要求2所述的虎杖甙填充胶原支架的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，称取己二酸-葡聚糖产物，用二甲基亚砜溶解后与N，N′-羰基二咪唑活化的虎杖甙混和后，常温20-25摄氏度下反应至少12个小时，优选20-24小时，上述反应结束后，透析(截留分子量为3500)3-4天后，旋蒸，将产物置于冷冻干燥机中干燥即可的到最终产物。

9.根据权利要求2所述的虎杖甙填充胶原支架的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，选用室温20-25摄氏度下浸泡至少8小时，优选8-12小时，更加优选10-12小时。

10.如权利要求1所述的虎杖甙填充胶原支架作为软骨组织支架的应用。