CN105985529A - 一种丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶及其制备方法，该方法包括：1)称取家蚕丝素缺失型突变品种蚕茧，使用LiBr或LiCl水溶液进行提取、然后透析纯化，浓缩得到非降解性的质量百分浓度为1.5～10％的丝胶蛋白水溶液；2)配制质量百分浓度为0.1～10％海藻酸盐水溶液；3)在交联剂存在的情况下使上述丝胶蛋白水溶液与海藻酸盐水溶液以100-0.01：1比例混合，形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶，所述交联剂包括离子交联剂和/或共价交联剂。本发明方案可获得互穿网络的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶，并且获得的复合水凝胶不仅具有优良的荧光特性，形变记忆性和弹性模量可调控性，而且还具有良好的生物相容性，细胞粘附性，能长期支持细胞的存活、增殖与迁移。

Description

一种丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用复合材料领域，尤其涉及一种丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶及其制备方法。

背景技术

丝胶蛋白(Silk Sericin)是包裹在丝素纤维表层的一种天然大分子粘性蛋白，约占蚕茧含量的20～30％，由分子量为24～400kDa的多肽组成，其分子由丝氨酸、天门冬氨酸和甘氨酸等18种氨基酸组成。长期以来由于人们对丝胶蛋白认识的不足和研究的局限性，导致丝胶在缫丝工业中被当作废物处理，浪费了大量宝贵的天然资源。近年来人们发现丝胶蛋白具有保湿、抗菌、抗氧化、抗凝血以及促进细胞粘附和增殖等生物特性，同时，丝胶具有亲水性和可降解性，可以用于生物医用材料领域。然而丝胶的稳定性及机械性能较差，大大制约了及在生物医用材料领域的应用。而现有的提高丝胶稳定性及机械性能的方法，往往会造成丝胶蛋白天然构象的改变，破坏天然丝胶蛋白的功能。

海藻酸(盐)(Sodium Alginate，SA)是从褐藻或细菌中提取的一种天然多糖。海藻酸具有良好的生物相容性，无毒，易与二价阳离子结合，形成凝胶，在凝胶过程无需使用任何有害的交联剂，其已被广泛地用于生物医学领域，海藻酸盐凝胶常被用于细胞培养，组织移植和药物释放等领域，但由于其缺少细胞粘附性能和可控的降解性，因此常需要将海藻酸(盐)进一步修饰(如采用RGD修饰提高材料对细胞的粘附性)方能满足实际需要，这大大提高了材料的制作成本和工作量。

如何将上述二者结合使用，在不影响天然丝胶蛋白的功能的情况下，获得具有良好的稳定性及机械性能、并且具有细胞粘附性能，可用于组织损伤修复和药物释放等领域的复合材料成为有待解决的问题。

发明内容

本发明提供一种丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的制备方法，该方法通过将由特定家蚕丝素缺失型突变品种的蚕茧提取获得的丝胶蛋白水溶液以特定比例和浓度与海藻酸盐水溶液混合，使用特定浓度和比例的交联剂，获得了互穿网络的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶。

本发明还提供了一种丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶，该复合水凝胶不仅具有优良的荧光特性，形变记忆性和弹性模量可调控性，而且还具有良好的生物相容性，细胞粘附性，能长期支持细胞的存活、增殖与迁移。

本发明还提供了一种丝胶蛋白-海藻酸盐复合材料冻干支架，可作为生物医用材料使用。

本发明提供的一种丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

1)称取家蚕丝素缺失型突变品种的蚕茧，使用LiBr或LiCl水溶液进行提取、然后经透析纯化，浓缩得到非降解性的质量百分浓度为1.5～10％的丝胶蛋白水溶液；

2)配制质量百分浓度为0.1～10％海藻酸盐水溶液；

3)在交联剂存在的情况下使上述丝胶蛋白水溶液与海藻酸盐水溶液以100-0.01∶1的体积比混合，形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶；

所述交联剂包括离子交联剂和/或共价交联剂，所述共价交联剂的使用量为1毫升丝胶蛋白水溶液加入2～500μL的共价交联剂，所述共价交联剂的浓度为0.1～50wt％；所述离子交联剂的使用量为1毫升海藻酸盐水溶液加入10～1000μL的离子交联剂，所述离子交联剂的浓度为0.1～50wt％。

在本发明的具体实施方式中，所述共价交联剂为戊二醛、丙二醛和京尼平中的一种或多种；所述离子交联剂为CaCl₂、Ca₂SO₄和CaCO₃中的一种。

在本发明的方案中，所述从家蚕丝素缺失型突变品种为185Nd-s，140Nd-s，139Nd-s，购自中国农业科学院蚕业研究所。

进一步在本申请的方案中，所述丝胶蛋白水溶液与海藻酸盐水溶液以8-0.125∶1的比例混合。

更进一步的，在交联剂存在的情况下使混合上述丝胶蛋白水溶液与海藻酸盐水溶液混合形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶包括：

a)先将丝胶蛋白水溶液与离子交联剂混合形成混合液A、海藻酸盐水溶 液与共价交联剂混合形成混合液B，然后将混合液A和混合液B混匀，在4～45℃下静置5秒～36小时以形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶；或者

b)将丝胶蛋白水溶液、海藻酸盐水溶液与共价交联剂混合，在4～50℃下静置5秒～36小时以形成第一水凝胶，然后将该第一水凝胶浸入离子交联剂中，4～60℃下静置1秒～36小时以形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶；或者

c)将丝胶蛋白水溶液、海藻酸盐水溶液与共价交联剂混合，在4～50℃下静置5秒～36小时以形成第一水凝胶，之后将所述第一水凝胶置于零度以下冷冻并真空干燥，然后将冷冻的第一水凝胶浸入离子交联剂中，4～60℃下静置1秒～36小时以形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶。

更进一步的，在交联剂存在的情况下使混合上述丝胶蛋白水溶液与海藻酸盐水溶液混合形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶包括：

a)先将丝胶蛋白水溶液与离子交联剂混合形成混合液A、海藻酸盐水溶液与共价交联剂混合形成混合液B，然后将混合液A和混合液B混匀，在37℃静置5分钟-0.5小时以形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶；或者

b)将丝胶蛋白水溶液、海藻酸盐水溶液与共价交联剂混合，在37℃下静置0.5小时～12小时以形成第一水凝胶，然后将该第一水凝胶浸入离子交联剂中，在37℃下静置1小时-5小时，以形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶；或者

c)将丝胶蛋白水溶液、海藻酸盐水溶液与共价交联剂混合，在37℃下静置0.5小时～12小时以形成第一水凝胶，将所述第一水凝胶在0℃以下冷冻24小时，再将冷冻后的第一水凝胶置于低温真空干燥，然后将该第一水凝胶浸入离子交联剂中，37℃下静置1-5小时，以形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶。

进一步的，对于a)-c)，所述共价交联剂为浓度为25wt％的戊二醛或2wt％的京尼平，并且所述离子交联剂为浓度为0.1～50wt％的CaCl₂水溶液，或者

对于a)-c)，所述共价交联剂为浓度为25wt％的戊二醛，并且所述离子交联剂为浓度为0.21g/mL的Ca₂SO₄水溶液；

按每毫升丝胶蛋白水溶液加入2～100μL所述戊二醛，每毫升海藻酸盐水溶液中加入10～500μL所述CaCl₂水溶液，按每毫升海藻酸盐水溶液加入20-50 μL所述Ca₂SO₄水溶液。

在本发明的方案中，所述丝胶蛋白水溶液通过以下步骤获得：

1)称取家蚕丝素缺失型突变品种蚕茧，并将其剪成碎片，用水清洗，去除水分；

2)将步骤1)的蚕茧碎片在25～50℃，浸泡于浓度为6～8mol/L的LiBr或LiCl水溶液中5～24小时，每克蚕茧碎片加入20～100mL所述6～8mol/L的LiBr或LiCl水溶液；

3)然后将步骤2)中得到的溶液离心，去除不溶性物质，得到澄清溶液；

4)向步骤3)得到的澄清溶液中加入四分之一体积的1mol/L、pH8.0～11.0的Tris-HCl缓冲液，并在超纯水中进行透析，得到丝胶蛋白水溶液；

5)将步骤4)得到丝胶蛋白水溶液离心去除沉淀，浓缩得到质量百分浓度为1.5～10％的丝胶蛋白水溶液。

在本发明的另一个方案中，所述丝胶蛋白水溶液还可以通过以下步骤获得：1)称取家蚕丝素缺失型突变品种蚕茧，并将其剪成1cm²碎片，清洗3次，去除水份，备用；

2)将步骤1)的蚕茧碎片浸于6mol/L的LiBr水溶液中，每克蚕茧碎片需40mL的所述LiBr水溶液，于35℃，溶解丝胶蛋白24小时；

3)然后将步骤2)中的溶液以3500rpm离心，去除不溶性物质，得到澄清溶液；

4)向步骤3)的澄清溶液中加入四分之一体积1mol/L，pH 9.0的Tris-HCl缓冲液，并将其进行透析，得到丝胶蛋白水溶液；

5)将步骤4)得到丝胶蛋白水溶液离心去除沉淀，再将丝胶液透析得到浓度为0.1～4wt％的丝胶蛋白水溶液，再浓缩至浓度为1.5～10wt％，置于4℃冰箱保存备用。

在本发明的方案中，所述海藻酸盐水溶液通过将0.01克海藻酸盐溶解于0.1～10ml超纯水中获得。制备好的海藻酸盐水溶液、丝胶蛋白水溶液 均可以置于4℃保存备用。

本发明提供的一种丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶，由所述制备方法获得。

本发明还提供了所述的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶在制备荧光标记探针中的应用。

本发明提供的一种丝胶蛋白-海藻酸盐复合材料冻干支架，通过将所述的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶置于零度以下冷冻、并真空干燥得到。

本发明还提供了所述的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶冻干支架在制备生物医用材料中的应用。

本发明的方案具有以下优点：

1)本发明首次采用多交联剂作用，采用非降解丝胶蛋白与海藻酸盐复合制备了双重互穿网络的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶及其冻干支架，同时也是首次制备了可注射型的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶(目前世界上仍无可注射丝胶蛋白-海藻酸盐复合三维水凝胶)，制备方法简便易行。

2)本发明丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶具有(I)具有良好的生物相容性，可以搭载细胞并支持细胞粘附和增殖；(II)可长期支持细胞的存活、增殖与迁移；(III)具有荧光特性，可以在体内被实时跟踪；(IV)具有弹性模量可调控性，可根据不同组织损伤的需要制备不同弹性模量的复合水凝胶；(V)具有形变记忆性；(VI)孔径具有可调控性；(VII)具有可注射性及原位成胶特性，选择特定的交联剂可实现可注射性及原位成胶，大大减少手术创伤；(VIII)具有良好的药物缓释能力，是良好的药物载体。

3)本发明提供的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的交联率、成胶速率以及弹性模量均可控(可根据需要实现原位成胶)，通过改变交联剂的用量、种类或丝胶蛋白水溶液的浓度和海藻酸盐水溶液的浓度以及丝胶蛋白水溶液和海藻酸盐水溶液的比例等条件调控水凝胶的交联率与成胶速率以及弹性模量。

4)本发明提供的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶有良好的生物相容性和细胞粘附性，对药物具有良好的控释作用；丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶及其经过冻干得到的三维多孔丝胶蛋白-海藻酸盐复合生物支架，可作为细胞外基质支持细胞生长和促进营养物质交换，可应用于多种组织损伤的修复和疾 病的治疗。

附图说明

图1A为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的图，图1B为制备例4获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的图。

图2A为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的冻干支架图。图2B为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的双网络结构图。

图3为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的冻干支架的孔率。

图4为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶在不同pH的PBS中的吸水膨胀率(37℃)曲线图。

图5为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶在不同pH的PBS中的降解(37℃)曲线图。

图6A为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶，在激光共聚焦显微镜观察复合水凝胶得到的荧光图片；图6B为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶在荧光显微镜观察复合水凝胶得到的图片；图6C为将制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶包埋于小鼠皮下利用小动物活体成像系统观测到的图片。

图7A为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶(水凝胶8S0A、8S2A、8S4A、8S8A)与纯海藻酸盐水凝胶(0S8A)红外光谱图，图7B为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶(水凝胶8S0A、8S2A、8S4A、8S8A)与纯海藻酸盐水凝胶(0S8A)的红外光谱图。

图8为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的弹性模量分析图。

图9A-9B为制备例4获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的(水凝胶8S8A)形变记忆检测。

图10A-图10B为通电子显微镜下观察到的小鼠肌细胞(C2C12)粘附增殖情况。图10A中的水凝胶为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶，图10B中的水凝胶为制备例4获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水 凝胶。

图11A为用激光共聚显微镜观察的细胞形态图。图11B在不同配比的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶组与对照组细胞粘附检测；图11C第3天为小鼠成肌细胞(C₂C₁₂)在不同配比的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶组与对照组细胞活力检测结果。图11D为小鼠成肌细胞(C2C12)在不同配比的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶组的细胞迁移结果。

具体实施方式

实施例1本发明提供的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的制备

一、蚕茧的选择：

选用家蚕丝素缺失突变品种的蚕茧(购于中国农业科学院蚕业研究所，该家蚕丝素缺失突变品种保存于中国农业科学院蚕业研究所国家蚕资源保存中心，保藏编号(或商品编号)185Nd-s，140Nd-s，139Nd-s)为原材料，主要的化学成分为：丝胶蛋白。

二、丝胶的提取与分离

1)称取家蚕突变品种蚕茧(购于中国农业科学院蚕业研究所)1g并剪成1cm²的碎片，后置于洁净的烧杯中，用超纯水清洗3次，3500rpm离心5分钟去除水份；

2)向步骤1)中得到的蚕茧碎片中加入30～60mL的浓度为6mol/L的LiBr水溶液，将该烧杯放入恒温水浴锅内35℃水浴24小时，溶解丝胶蛋白；

3)将步骤2)得到溶液转入离心管内3500rpm离心5分钟，去除不溶性物质，得到澄清的溶液；

4)向步骤3)得到的澄清溶液中加入四分之一体积的Tris-HCl缓冲液(1mol/L，pH 9.0)；

5)将步骤4)中的溶液转入到预处理好的透析袋(MWCO 3500)中，然后将透析袋两端用夹子夹紧，放置于含有超纯水的烧杯中；将该烧杯置于搅拌器上慢速搅拌透析，每隔3小时换一次水，共透析48小时；

6)将5)中透析后的丝胶蛋白水溶液转到离心管中，4000rpm离心5 分钟，去除沉淀；

7)将丝胶蛋白水溶液再装入到透析袋中并将透析袋两端用夹子夹紧，再将透析袋置于质量百分浓度为20％的PEG6000溶液中浓缩；将丝胶蛋白水溶液浓缩到需要的浓度为止(质量百分浓度为1.5-10％以上)；

8)蛋白浓度检测采用BSA法和丝胶蛋白水溶液干燥法；

9)蛋白质分子量检测(参照SDS-PAGE)。取10～15μL用于分子量检测，其余置于4℃冰箱保存备用。

三、海藻酸盐水溶液的配制

1)所述海藻酸盐水溶液通过将0.01克海藻酸盐溶解于0.1～10ml超纯水中，置于摇床上4℃轻摇溶解，然后再静置于4℃备用获得。

四、丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶、以及所述复合水凝胶冻干支架的制备

制备例1：

将丝胶蛋白水溶液与CaCl₂水溶液离子交联剂混合形成混合液A、海藻酸盐水溶液与戊二醛共价交联剂混合形成混合液B，然后将混合液A和混合液B混匀(例如，用分别装有混合液A和混合液B的两注射器用鲁尔连接好互推数十下充分混匀，在37℃静置5分钟，以形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶。

制备例2

将丝胶蛋白水溶液与Ca₂SO₄离子交联剂混合形成混合液A，将海藻酸盐水溶液与戊二醛共价交联剂混合形成混合液B，再将混合液A和混合液B等体积混合，充分混匀后置于37℃下0.5小时，得到丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶。

制备例3

将丝胶蛋白水溶液、海藻酸盐水溶液等体积混合，然后加入1％体积的所述戊二醛，混匀后，在37℃静置0.5小时以形成第一水凝胶，然后将该第一水凝胶浸入所述CaCl₂水溶液中，每克第一水凝胶浸入到5mL的CaCl₂水溶液，37℃静置2小时以形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶。

制备例4

将丝胶蛋白水溶液与所述京尼平水溶液混匀，充分搅拌后、加入等体积的海藻酸盐水溶液，然后在37℃静置12小时以形成第一水凝胶，然后将第一水凝胶浸入所述CaCl₂水溶液中，37℃静置1小时以形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶。

制备例5

将丝胶蛋白水溶液、海藻酸盐水溶液等体积混合，然后加入1％体积的所述戊二醛，在37℃静置12小时以形成第一水凝胶，之后将所述第一水凝胶置于-80℃冷冻12小时；并低温真空冻干，再将冻干的第一水凝胶浸入所述CaCl₂水溶液中，37℃静置5小时以形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶。

制备例6

将制备例1得到的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶(8S0A、8S2A、8S4A、8S8A)-80℃，冷冻24小时后取出；将样品置于低温真空干燥机中干燥(根据样品大小确定适宜的干燥时间)，得到四种不同丝胶蛋白-海藻酸盐配比的冻干支架(8S0A′、8S2A′、8S4A′、8S8A′)。

实施例2丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶、以及所述复合水凝胶冻干支架的性能分析

图1A为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的图。即丝胶蛋白水溶液和海藻酸盐水溶液在总体积一定的情况下按体积比8/0、8/2、8/4、8/8混合(上述比例对应水凝胶的编号为8S0A、8S2A、8S4A、8S8A)，使用交联剂戊二醛和氯化钙形成的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶图；

图1B为制备例4获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的图。即丝胶蛋白水溶液和海藻酸盐水溶液在总体积一定的情况下按体积比8/0、8/1、8/2、8/4、8/8、4/8、2/8、1/8、0/8混合，使用交联剂京尼平和氯化钙形成的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶；

由图1A和图1B可以看出，随着丝胶蛋白水溶液含量的减少，复合水凝胶的颜色由黄色变为白色或无色(即由颜色较深的丝胶蛋白水凝胶的颜色向无颜色的海藻酸盐水凝胶的颜色转变)，丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的颜色可以根据需要在本发明限定的丝胶蛋白-海藻酸盐的比例范围内进行调整，例如，在需要对水凝胶结构进行观察的情况下，则丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的颜色越浅越好。

图2A为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的冻干支架图；图2B为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的双网络结构。

图2A为通过将制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶在-80℃冷冻温度下处理后再冻干得到，复合水凝胶8S0A、8S2A、8S4A、8S8A的冻干支架的孔径分别约为138.66μm、105.23μm、98.57μm、79.82μm。

表明复合水凝胶随着丝胶所占比例的降低，水凝胶的孔径逐渐降低， 因此复合材料的孔径可以根据需要调节丝胶与海藻酸盐的比例得到相应孔径的三维多孔生物支架。

图2B为通过将制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶(8S0A、8S2A、8S4A、8S8A)在-80℃冷冻温度下处理后再冻干得到的支架在荧光和明场拍照得到的图片以及明场和荧光照片叠加后的照片。由叠加后的照片我们很容易看出复合水凝胶具有互穿的双网络结构，叠加后的图片断荧光部分是丝胶蛋白网络成份而不发光部分(黑色区域)为海藻酸盐网络成份。

图3为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的冻干支架的孔率

可以看出，水凝胶8S0A、8S2A、8S4A、8S8A冻干支架的孔率均在90％左右，可作为细胞外基质很好地支持细胞生长和促进营养物质交换。

图4为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶在不同pH的PBS中的吸水膨胀率(37℃)曲线图。

上述吸水膨胀率通过将丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶冻干、称重、浸泡于不同pH(pH3.0，pH7.4，pH11)的PBS溶液中，在不同时间点，取出按以下公式测定。(其中Ws为膨胀状态下的重量，Wd为干重)。

$\mathrm{swelling}(\%)=\frac{\mathrm{Ws}-\mathrm{Wd}}{\mathrm{Ws}}\×100$

由图4可以看出，在不同的pH情况下，相同配比的水凝胶的膨胀特性不同，在同一pH情况下，不同配比的水凝胶膨胀率也不同。在前3小时，水凝胶8S0A、8S2A、8S4A、8S8A的吸水膨胀后的重量是原来的13倍以上，之后吸水膨胀率仍一定程度的增加。表明本申请提供的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶具有良好的吸水膨胀率，通过改变丝胶蛋白水溶液与海藻酸盐水溶液的配比可以获得不同膨胀性的水凝胶。

图5为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶在不同pH的PBS中的降解(37℃)曲线图。。

对于测试不同pH环境对丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶降解的影响， 将丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶浸泡于不同pH值(pH 3.0、pH 7.4、pH11.0)的PBS溶液中，每日更换一次PBS溶液，在不同时间点，取出、干燥、称重。

从图5可以看出，以0S8A(纯海藻酸盐水凝胶)为对照，在pH为3和7.4的情况下，水凝胶8S0A、8S2A、8S4A、8S8A的降解速率随着海藻酸盐水溶液比例的增加，水凝胶的降解速率加快。表明可以能过调节丝胶蛋白水溶液与海藻酸盐水溶液的配比来改变材料的降解特性以满足不同组织损伤修复对不同降解速度的需要。而在pH为11的情况下，较在pH为3和7.4的情况降解速率快得多。

图6A为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶，在激光共聚焦显微镜观察复合水凝胶得到的荧光图片；图6B为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶在荧光显微镜观察复合水凝胶得到的图片；图6C为将制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶包埋于小鼠皮下利用小动物活体成像系统观测到的图片。

图6A和图6B分别利用激光共聚焦显微镜(Nikon AlSi，Japan)和荧光显微镜(Olympus IX71，Japan)观察丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶在不同的波长条件下的微观结构。图6A中，在采用波长为488nm激发光激发下，材料(即丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶)发绿色荧光；在波长为543.5nm激发光激发下，材料发红色荧光；在波长为404.3nm激发光激发下，材料发蓝色荧光；图6B中，在采用波长为460-495nm激发光激发下，材料(即丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶)发绿色荧光；在波长为530-550nm激发光激发下，材料发红色荧光；在波长为360-370nm激发光激发下，材料发蓝色荧光；材料的荧光特性有利于我们观察水凝胶的内部结构。

图6C中将丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶包埋于小鼠皮下，采用小动物活体成像系统在不同波长的激发光的激发下可以看到不同的荧光。图6C右为采用630nm激发光激发下，在700nm发射光下可看到很强的红色荧光；图6C左为在500nm波长的光激发下，在600nm发射光下也可见到红色荧光；图6C中为在470nm激发光激发下，在535nm发射光下可看到 很强绿色荧光。

由图6A-图6C说明本申请提供的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶具有优良的荧光特性，能在不同的激发光下丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶冻干支架发射不同的荧光(包括红色、绿色和蓝色荧光等)，将该丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶包埋于动物体内，可以实时跟踪；并能容易地观察该复合材料的微观结构；丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶和冻干支架可作为荧光标记探针的材料。

图7A为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶(水凝胶8S0A、8S2A、8S4A、8S8A)与纯海藻酸盐水凝胶(0S8A)红外光谱图，图7B为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶(水凝胶8S0A、8S2A、8S4A、8S8A)与纯海藻酸盐水凝胶(0S8A)的红外光谱图。

图7A-7B是利用傅里叶变换红外光谱仪(Nexus，Thermal Nicolet，USA)测定丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶在4000-450cm^-1的特征峰。

由图7A-7B可以看出，由水凝胶8S0A、8S2A、8S4A、8S8A在1600-1700cm^-1处的具有相似的特征峰，表明丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶中的多肽二级结构与纯丝胶蛋白中的相似，表明丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶能很好的维持丝胶蛋白的天然构象。

图8为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的弹性模量分析图。

图8的弹性模量通过以下方式测量：将制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶制作成一定规格的圆柱体水凝胶块，利用微型万能测试机(Instron5848MicroTester，Instron，USA))在常温下测试丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的力学性能。

由图8可以看出，随着丝胶蛋白水溶液含量的减少，复合水凝胶的弹性模量降低，丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的弹性模量可以根据需要在本发明限定的丝胶蛋白-海藻酸盐的比例范围内进行调整，例如，在需要高弹性模量水凝胶的情况下，则增加胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶中丝胶蛋白水 溶液的比例。

图9A-9B为制备例4获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的(水凝胶8S8A)形变记忆检测。

图9A-9B的形变记忆功能通过将丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶0℃以下冷冻24小时，再经低温真空干燥后浸入水中1小时，然后将样品取出，对样品施加外力进行测量，当外力存在时，样品在一定形变范围内，当将外力撤去后，样品仍可恢复原来的形状，图9A为样品在外力作用下发生形变，图9B为外力撤去后样品又恢复原来的形貌，表明制备例4获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶具有良好的形变记忆功能。

申请人还对制备例2-3，以及制备例5获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的性能进行了分析，其均具有与制备例1和4的复合水凝胶相似的性能分析结果。

实施例3丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶、以及所述复合水凝胶冻干支架的支持细胞粘附生长的能力分析

细胞的培养过程如下：

1)按照制备例1或制备例4获得丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶。待稳定成胶后，将铺有丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的细胞培养皿用无菌PBS洗三次，再用75％乙醇浸泡1小时，最后用已灭菌PBS冼一次，置于4℃冰箱备用；

2)将从细胞培养瓶收集的小鼠肌细胞C2C12细胞经悬浮，吹散，种植于1)中预处理好的培养皿中，未铺丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的培养皿作为对照。细胞培养采用DMEM高糖培养基，细胞在细胞培养箱中培养(37℃，CO₂浓度：5％，湿度：100％)；

3)在不同的时间点采用Olympus IX71显微镜在普光下对细胞进行拍照。

4)电子显微镜下观察到的小鼠肌细胞C2C12分别种于对照组和丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶组的粘附、增殖情况。

图10A-图10B为通电子显微镜下观察到的小鼠肌细胞(C2C12)粘附增殖情况。图10A中的水凝胶为制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶，图10B中的水凝胶为制备例4获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶。

其中图10A为小鼠肌细胞种于对照组(0-25天)和丝胶蛋白与海藻酸盐不同配比的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶组(交联剂为戊二醛和CaCl₂；0-25天)的普通电子显微图片；

图10B为小鼠肌细胞种于对照组(0天；1天)和丝胶蛋白与海藻酸盐不同配比的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶组(交联剂为京尼平和CaCl₂)的普通电子显微图片；实验结果表明丝胶水凝胶可以很好地支持小鼠肌细胞的粘附、存活和增殖，进一步证明该丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶可应用于肌肉等组织损伤修复。

另外表2为采用根据实施例1制备的复合水凝胶(8S0A、8S2A、8S4A、8S8A)培养小鼠肌细胞，细胞的存活/增殖时间。将未铺丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的培养皿作为对照，同时测量纯海藻酸盐水凝胶0S8A培养小鼠肌细胞，细胞的存活/增殖时间。

表2

可以看出，丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶8S4A和8S8A可以支持细胞存活/增殖达25天以上，远远长于纯丝胶水凝胶17天(8S0A)和海藻酸盐水凝胶(0S8A)1天。表明丝胶与海藻酸盐制作的复合水凝胶具有其他两种单一水凝胶(纯丝胶水凝胶和纯海藻酸盐水凝胶)无法比拟的优势。

在本申请的方案中，丝胶蛋白水溶液和海藻酸盐水溶液在总体积一定的情况下按不同的体积比混合；即本申请在用不能支持细胞生长的海藻酸盐凝胶以大比例代替支持细胞生长的丝胶蛋白的情况下，仍获得了相比于纯的丝胶蛋白水凝胶，显著延长的细胞存活/增殖时间，具有意料不到的效 果。

图11A为用激光共聚显微镜观察细胞形态图。图11B在不同配比的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶组与对照组细胞粘附检测；图11C第3天为小鼠成肌细胞(C₂C₁₂)在不同配比的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶组与对照组细胞活力检测结果。图11D为小鼠成肌细胞(C2C12)在不同配比的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶组的细胞迁移结果。

在种植后第3天对，对细胞骨架采用罗丹明-鬼笔环肽染色呈红色，细胞核采用DAPI染色呈蓝色，然后用激光共聚焦显微镜(iNikon AlSi，Japan)观察和拍照。由图11A可以看出，小鼠肌细胞C2C12能在根据制备例1获得的不同配比的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶生长，不同配比的水凝胶上的细胞形态不同，随着海藻酸盐比例的增加，细胞伸展的越小。

其中图11B和图11C可以看出，细胞在根据制备例1获得的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶组与对照组上在种植后4小时和8小时检测细胞的粘附情况良好，采用CCK8 Kit检测细胞在种植后3天的活力良好。图11D表明复合水凝胶可以长期支持细胞的迁移。

Claims (10)

1.一种丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)称取家蚕丝素缺失型突变品种的蚕茧，使用LiBr或LiCl水溶液进行提取、然后经透析纯化，浓缩得到非降解性的质量百分浓度为1.5～10％的丝胶蛋白水溶液；

2)配制质量百分浓度为0.1～10％海藻酸盐水溶液；

3)在交联剂存在的情况下使上述丝胶蛋白水溶液与海藻酸盐水溶液以100-0.01：1的体积比混合，形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶；

所述交联剂包括离子交联剂和/或共价交联剂，所述共价交联剂的使用量为1毫升丝胶蛋白水溶液加入2～500μL的共价交联剂，所述共价交联剂的浓度为0.1～50wt％；所述离子交联剂的使用量为1毫升海藻酸盐水溶液加入10～1000μL的离子交联剂，所述离子交联剂的浓度为0.1～50wt％。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述共价交联剂为戊二醛、丙二醛和京尼平中的一种或多种；所述离子交联剂为CaCl₂、Ca₂SO₄和CaCO₃中的一种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在交联剂存在的情况下使混合上述丝胶蛋白水溶液与海藻酸盐水溶液混合形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶包括：

a)先将丝胶蛋白水溶液与离子交联剂混合形成混合液A、海藻酸盐水溶液与共价交联剂混合形成混合液B，然后将混合液A和混合液B混匀，在4～45℃下静置5秒～36小时以形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶；或者

b)将丝胶蛋白水溶液、海藻酸盐水溶液与共价交联剂混合，在4～50℃下静置5秒～36小时以形成第一水凝胶，然后将该第一水凝胶浸入离子交联剂中，4～60℃下静置1秒～36小时以形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶；或者

c)将丝胶蛋白水溶液、海藻酸盐水溶液与共价交联剂混合，在4～50℃下静置5秒～36小时以形成第一水凝胶，之后将所述第一水凝胶置于零度以下冷冻并真空干燥，然后将冷冻干燥的第一水凝胶浸入离子交联剂中，4～60℃下静置1秒～36小时以形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在交联剂存在的情况下混合上述丝胶蛋白水溶液与海藻酸盐水溶液形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶包括：

a)先将丝胶蛋白水溶液与离子交联剂混合形成混合液A、海藻酸盐水溶液与共价交联剂混合形成混合液B，然后将混合液A和混合液B混匀，在37℃静置5分钟-0.5小时以形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶；或者

b)将丝胶蛋白水溶液、海藻酸盐水溶液与共价交联剂混合，在37℃下静置0.5小时～12小时以形成第一水凝胶，然后将该第一水凝胶浸入离子交联剂中，在37℃下静置1小时-5小时，以形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶；或者

c)将丝胶蛋白水溶液、海藻酸盐水溶液与共价交联剂混合，在37℃下静置0.5小时～12小时以形成第一水凝胶，将所述第一水凝胶在0℃以下冷冻24小时，再将冷冻后的第一水凝胶置于低温真空干燥，然后将冷冻干燥的第一水凝胶浸入离子交联剂中，37℃下静置1-5小时，以形成丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，对于a)-c),所述共价交联剂为浓度为25wt％的戊二醛或2wt％的京尼平，并且所述离子交联剂为浓度为0.1～50wt％的CaCl₂水溶液,或者

对于a)-c),所述共价交联剂为浓度为25wt％的戊二醛，并且所述离子交联剂为浓度为0.21g/mL的Ca₂SO₄水溶液；

按每毫升丝胶蛋白水溶液加入2～100μL所述戊二醛，每毫升海藻酸盐水溶液中加入10～500μL所述CaCl₂水溶液，按每毫升海藻酸盐水溶液加入20-50μL所述Ca₂SO₄水溶液。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述丝胶蛋白水溶液通过以下步骤获得：

1)称取家蚕丝素缺失型突变品种的蚕茧，并将其剪成碎片，用水清洗，去除水分；

2)将步骤1)的蚕茧碎片在25～50℃，浸泡于浓度为6～8mol/L的LiBr或LiCl水溶液中5～24小时，每克蚕茧碎片加入20～100mL所述6～8mol/L的LiBr或LiCl水溶液；

3)然后将步骤2)中得到的溶液离心，去除不溶性物质，得到澄清溶液；

4)向步骤3)得到的澄清溶液中加入四分之一体积的1mol/L、pH8.0～11.0的Tris-HCl缓冲液，并在超纯水中进行透析，得到丝胶蛋白水溶液；

5)将步骤4)得到丝胶蛋白水溶液离心去除沉淀，浓缩得到质量百分浓度为1.5～10％的丝胶蛋白水溶液。

7.一种丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶，其特征在于，由权利要求1-6任一项所述制备方法获得。

8.权利要求7所述的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶在制备荧光标记探针中的应用。

9.一种丝胶蛋白-海藻酸盐复合材料冻干支架，其特征在于，通过将根据权利要求7所述的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶置于零度以下冷冻、并真空干燥得到。

10.权利要求9所述的丝胶蛋白-海藻酸盐复合水凝胶冻干支架在制备生物医用材料中的应用。