CN102580163A - 一次冻干制备交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种一次冻干制备交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的方法。本发明以天然生物材料胶原和壳聚糖为原料，在胶原/壳聚糖混合溶胀液中直接加入戊二醛溶液，通过一次冷冻-冻干过程制备交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架。采用该方法制备的胶原/壳聚糖支架具有力学性能可控、降解速率适宜、生物相容性好等优点，且该方法仅需经过一次冻干处理，有效避免了传统制备方法导致的支架塌陷和微结构破坏等问题。该制备方法简单易行、能耗低、节省时间和材料、重复性好，所构建的胶原/壳聚糖多孔支架可以广泛应用于组织工程领域，具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程多孔支架的制备方法，尤其涉及一种一次冻干制备交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的方法。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，由于其大面积暴露在外界环境中，不可避免地会受到各种各样的损伤如创伤、烧伤、烫伤等。皮肤损伤后自修复能力有限，临床常见的治疗手段包括自体皮移植和异体皮移植等，但由于供体不足和免疫排斥等问题，难以满足临床的需要。随着组织工程和再生医学的发展，组织工程皮肤得到广泛的关注与认可，其中如何构建一种具有可控组成和微结构，适宜的降解速率和机械性能，并可有效支持成纤维细胞粘附与增殖的组织工程多孔支架是关键。
胶原是哺乳动物结缔组织中的主要成分，构成人体约30%的蛋白质，在皮肤中的干重达72％。胶原有19种类型，最常见的是I型、II型和III型。其中I型最丰富，且性能优良，被广泛用于生物医用材料。胶原材料虽然具有无可比拟的生物相容性，但是纯胶原支架存在机械强度较低，降解速率过快等缺点，难以满足组织工程支架的要求。因此，交联处理是构建具有优异理化性能和生物学性能的胶原基组织工程支架的关键；其中戊二醛交联因其简单易操作，交联度可控等特点广泛应用于胶原基组织工程支架的交联处理。
壳聚糖是一种带有多氨基的多糖类物质，其结构和一些性质与细胞外基质的主要成分氨基葡聚糖类似，具有良好的生物相容性和适当的降解性能，无刺激性、无免疫原性、无热源反应，并具有促进创面愈合的功能，而且来源广泛、成本低廉。目前壳聚糖已广泛应用于医用缝合线、创面敷料以及组织工程多孔支架中。
传统的胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法往往采用先制备支架，再进行交联处理的工艺。该方法由于涉及两次冷冻干燥过程，易出现支架表面塌陷和内部微结构破坏等问题，而且传统制备方法还存在制备过程繁琐、能耗大、耗时长、批次质量差异性大等缺点，不利于实现胶原/壳聚糖多孔支架的大规模制备和制备工艺的稳定化，也不利于胶原/壳聚糖多孔支架的产业化生产。本发明公开的方法，以天然生物材料胶原和壳聚糖为原料，在胶原/壳聚糖混合溶胀液中直接加入戊二醛溶液，通过一次冷冻-冻干过程即可制备交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架。采用该方法制备的胶原/壳聚糖支架具有力学性能可控、降解速率适宜、生物相容性好等优点，且该方法仅需经过一次冻干处理，因而可有效避免传统制备方法导致的支架塌陷和微结构破坏等问题。该制备方法简单易行、能耗低、节省时间和材料、支架性能稳定，可满足胶原/壳聚糖多孔支架的产业化发展的需要。对推动胶原/壳聚糖多孔支架在组织工程领域的广泛应用具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种以来源广泛的天然生物材料—胶原和壳聚糖为原料，简便易行制备交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的方法，以获得具有可控力学性能、适宜降解速率、良好生物相容性的组织工程多孔支架。
本发明的一次冻干制备交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的方法，包括以下步骤：
（1）在酸性条件下分别配制质量浓度为0.5%的胶原溶液和壳聚糖溶液，将胶原溶液和壳聚糖溶液按体积比9:1混合，搅拌均匀，得到胶原/壳聚糖混合溶胀液，向该混合溶胀液中注入质量浓度为2.5%的戊二醛溶液，使溶液中戊二醛的最终浓度达到0.02%—0.5%，然后在37 oC下搅拌反应4小时，将反应后的胶原/壳聚糖混合溶胀液注射于模具中，在-20 oC冷冻0.5—3小时后，冻干，得到交联的胶原/壳聚糖多孔支架，所说的交联浓度是指戊二醛在混合溶胀液中的质量浓度，采用公式2.5% ×VGA = C×(VGA+ V1)计算，其中VGA代表起始加入的质量浓度为2.5%的戊二醛的体积，C代表交联浓度，V1代表起始的胶原/壳聚糖混合溶胀液的体积；
（2）将该胶原/壳聚糖多孔支架于20—50 oC真空干燥0.5—10小时，去除支架中残留的戊二醛，得到交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架。
本发明中，所说的胶原为牛腱胶原、鱼皮胶原、骨胶原、鼠尾胶原或猪皮胶原。步骤（1）中优选戊二醛的最终浓度为0.04%—0.25%；优选冷冻时间为1—2小时。步骤（2）中优选真空干燥的温度为25—37oC，真空干燥时间为1—5小时。
本发明中，所说的酸性条件可以是醋酸、甲酸或盐酸。
本发明是以胶原和壳聚糖为原料，通过简便易行的交联方法得到胶原/壳聚糖组织工程多孔支架。
本发明的优点
本发明以天然生物材料胶原和壳聚糖为原料，在胶原/壳聚糖混合溶胀液中直接加入戊二醛溶液，通过一次冷冻-冻干过程制备交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架。采用该方法制备的胶原/壳聚糖支架具有力学性能可控、降解速率适宜、生物相容性好等优点，且该方法仅需经过一次冻干处理，可有效避免传统制备方法导致的支架塌陷和微结构破坏等问题。该制备方法具有简单易行、能耗低、节省时间和材料、支架性能稳定等优点，可满足胶原/壳聚糖多孔支架的大规模制备的需要，对推动胶原/壳聚糖多孔支架在组织工程领域的广泛应用具有重要的意义。
附图说明
图1a是交联浓度为0.04%的牛腱胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的断面微观结构图。
图1b是交联浓度为0.1%的牛腱胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的断面微观结构图。
图1c是交联浓度为0.25%的牛腱胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的断面微观结构图。
图2是交联浓度为0.04%、0.1%、0.25%的牛腱胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的吸水率。
图3是交联浓度为0.04%、0.1%、0.25%的牛腱胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的交联度。
图4是交联浓度为0.04%、0.1%、0.25%的牛腱胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的降解度。
图5是交联浓度为0.04%的牛腱胶原/壳聚糖组织工程多孔支架中细胞的生长形貌。
图6是交联浓度为0.04%的牛腱胶原/壳聚糖组织工程多孔支架中戊二醛的残留量。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作详细说明。
实例1：
一次冻干制备交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的方法，包括以下步骤：
（1）在醋酸溶液中分别配制质量浓度为0.5%的牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液，将牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液按体积比9:1混合，搅拌均匀，得到牛腱胶原/壳聚糖混合溶胀液。向该混合溶胀液中注入质量浓度2.5%的戊二醛（GA）溶液，使交联浓度分别为0.04%、0.1%、0.25%，然后在37 oC下搅拌反应4小时。将反应后的牛腱胶原/壳聚糖混合溶胀液注射于模具中，在-20 oC冷冻2小时后，冻干，得到交联的牛腱胶原/壳聚糖多孔支架，所说的交联浓度是指戊二醛在混合溶胀液中的质量浓度，采用公式2.5% ×VGA = C×(VGA+ V1)计算，其中VGA代表起始加入的质量浓度为2.5%的戊二醛的体积，C代表交联浓度，V1代表起始的牛腱胶原/壳聚糖混合溶胀液的体积；
（2）将该胶原/壳聚糖多孔支架于50 oC真空干燥5小时，去除支架中残留的戊二醛，得到交联的牛腱胶原/壳聚糖组织工程多孔支架。
图1 a、图1 b、图1 c分别为交联浓度为0.04%、0.1%、0.25%的牛腱胶原/壳聚糖多孔支架的断面微观结构图。从图中可以看出，支架呈现疏松多孔的结构，且孔径分布均匀。
分别取0.2mg交联浓度为0.04%、0.1%、0.25%的牛腱胶原/壳聚糖多孔支架（W0），37 oC下分别于5ml三蒸水中浸泡3、6、9、12、24小时；取出后静置1分钟，待支架中无明显水滴流出，称其重量（W1），每个样品平行测定3次，支架吸水率通过公式(W1- W0)/ W0 × 100%计算，见图2。由图可知，交联浓度为0.1%的胶原/壳聚糖支架的吸水率最大，而交联浓度为0.25%支架的吸水率最小。
分别称取11mg交联浓度为0.04%、0.1%、0.25%的牛腱胶原/壳聚糖多孔支架于50ml离心管中，加人1ml 4% NaHCO3和1ml 0.5% 三硝基苯磺酸（TNBS），于40oC水浴中加热4h，再加入6mol/L 盐酸溶液3ml，于高压灭菌器内120oC加热1小时。向所得溶液中加人5ml水稀释，用20ml乙醚萃取，从水相中提取5ml液体，在37oC水浴中加热15分钟。将液体冷却至室温后，再用15ml水稀释，用紫外分光光度计在346nm测定吸光度值，见图3。从图中可发现，随着交联浓度的增大，支架的交联度逐渐增加。
分别称取2.5mg交联浓度为0.04%、0.1%、0.25%的牛腱支架于离心管中，加入3ml I 型胶原酶（265u/mg），于37oC恒温水浴槽中分别消化2、4、6、12、24、48小时；消化结束后取出离心管先在4oC水浴中冷却震荡终止胶原酶的消化，然后以1000转/分钟的速度离心10分钟。吸取上清液1ml，置于聚合管中，加入6mol/l盐酸，用液氮冷冻后在真空条件下封管，然后在120oC油浴中反应12小时。反应结束后割破聚合管并将液体倒出置于小烧杯中，于70oC水浴中蒸去盐酸，残渣用2ml 磷酸盐缓冲液（PBS，pH =7.4）溶解，并配成测试液。向2ml测试液中加入1ml、0.05mol/L 氯胺T溶液，25oC反应20分钟，再加入1ml、3.15mol/L过氯酸，放置5分钟后加入1ml、10%对二甲基苯甲醛溶液，60oC反应20分钟，待液体冷却后用紫外分光光度计在560nm处测定吸光度值，见图4。从图中可以看出交联浓度为0.1%的支架降解速率最快，而交联浓度为0.25%的支架降解速率最慢。
实例2：
一次冻干制备交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的方法，包括以下步骤：
（1）在醋酸溶液中分别配制质量浓度为0.5%的骨胶原溶液和壳聚糖溶液，将骨胶原溶液和壳聚糖溶液按体积比9:1混合，搅拌均匀，得到骨胶原/壳聚糖混合溶胀液。向该混合溶胀液中注入质量浓度2.5%的戊二醛溶液，使交联浓度为0.04%，然后在37 oC下搅拌反应4小时。将反应后的骨胶原/壳聚糖混合溶胀液注射于模具中，在-20 oC冷冻2小时后，冻干，得到交联的骨胶原/壳聚糖多孔支架，所说的交联浓度是指戊二醛在混合溶胀液中的质量浓度，采用公式2.5% ×VGA = C×(VGA+ V1)计算，其中VGA代表起始加入的质量浓度为2.5%的戊二醛的体积，C代表交联浓度，V1代表起始的骨胶原/壳聚糖混合溶胀液的体积；
（2）将该骨胶原/壳聚糖多孔支架于50 oC真空干燥5小时，去除支架中残留的戊二醛，得到交联的骨胶原/壳聚糖组织工程多孔支架。
实例3：
一次冻干制备交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的方法，包括以下步骤：
（1）在盐酸溶液中分别配制质量浓度为0.5%的鱼皮胶原溶液和壳聚糖溶液，将鱼皮胶原溶液和壳聚糖溶液按体积比9:1混合，搅拌均匀，得到鱼皮胶原/壳聚糖混合溶胀液。向该混合溶胀液中注入质量浓度2.5%的戊二醛溶液，使交联浓度为0.1%，然后在37 oC下搅拌反应4小时。将反应后的鱼皮胶原/壳聚糖混合溶胀液注射于模具中，在-20 oC冷冻3小时后，冻干，得到交联的鱼皮胶原/壳聚糖多孔支架，所说的交联浓度是指戊二醛在混合溶胀液中的质量浓度，采用公式2.5% ×VGA = C×(VGA+ V1)计算，其中VGA代表起始加入的质量浓度为2.5%的戊二醛的体积，C代表交联浓度，V1代表起始的鱼皮胶原/壳聚糖混合溶胀液的体积；
（2）将该鱼皮胶原/壳聚糖多孔支架于37 oC真空干燥4小时，去除支架中残留的戊二醛，得到交联的鱼皮胶原/壳聚糖组织工程多孔支架。
实例4：
（1）在甲酸溶液中分别配制质量浓度为0.5%的鼠尾胶原溶液和壳聚糖溶液，将牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液按体积比9:1混合，搅拌均匀，得到牛腱胶原/壳聚糖混合溶胀液。向该混合溶胀液中注入质量浓度2.5%的戊二醛溶液，使交联浓度为0.25%，然后在37 oC下搅拌反应4小时。将反应后的牛腱胶原/壳聚糖混合溶胀液注射于模具中，在-20 oC冷冻1小时后，冻干，得到交联的牛腱胶原/壳聚糖多孔支架，所说的交联浓度是指戊二醛在混合溶胀液中的质量浓度，采用公式2.5% ×VGA = C×(VGA+ V1)计算，其中VGA代表起始加入的质量浓度为2.5%的戊二醛的体积，C代表交联浓度，V1代表起始的鱼皮胶原/壳聚糖混合溶胀液的体积；
（2）将该牛腱胶原/壳聚糖多孔支架于30 oC真空干燥1小时，去除支架中残留的戊二醛，得到交联的牛腱胶原/壳聚糖组织工程多孔支架。
实例5：
（1）在醋酸溶液中分别配制质量浓度为0.5%的牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液，将牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液按体积比9:1混合，搅拌均匀，得到牛腱胶原/壳聚糖混合溶胀液。向该混合溶胀液中注入质量浓度2.5%的戊二醛溶液，使交联浓度为0.04%，然后在37 oC下搅拌反应4小时。将反应后的牛腱胶原/壳聚糖混合溶胀液注射于模具中，在-20 oC冷冻1小时后，冻干，得到交联的牛腱胶原/壳聚糖多孔支架，所说的交联浓度是指戊二醛在混合溶胀液中的质量浓度，采用公式2.5% ×VGA = C×(VGA+ V1)计算，其中VGA代表起始加入的质量浓度为2.5%的戊二醛的体积，C代表交联浓度，V1代表起始的鱼皮胶原/壳聚糖混合溶胀液的体积；
（2）将该牛腱胶原/壳聚糖多孔支架于50 oC真空干燥5小时，去除支架中残留的戊二醛，得到交联的牛腱胶原/壳聚糖组织工程多孔支架。
向该牛腱胶原/壳聚糖多孔支架中种植人成纤维细胞1ml（300万/ml），37oC、5% CO2 培养箱中培养10天，隔日换液，将支架用异硫氰酸荧光素（FITC）标记，将细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）标记，然后采用激光共聚焦显微镜（CLSM）观察，从图5发现，支架内有大量成纤维细胞，且细胞生长状态良好。
实例6：
一次冻干制备交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的方法，包括以下步骤：
（1）在醋酸溶液中分别配制质量浓度为0.5%的牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液，将牛腱胶原溶液和壳聚糖溶液按体积比9:1混合，搅拌均匀，得到牛腱胶原/壳聚糖混合溶胀液。向该混合溶胀液中注入质量浓度2.5%的戊二醛溶液，使交联浓度为0.04%，然后在37 oC下搅拌反应4小时。将反应后的牛腱胶原/壳聚糖混合溶胀液注射于模具中，在-20 oC冷冻1小时后，冻干，得到交联的牛腱胶原/壳聚糖多孔支架，所说的交联浓度是指戊二醛在混合溶胀液中的质量浓度，采用公式2.5% ×VGA = C×(VGA+ V1)计算，其中VGA代表起始加入的质量浓度为2.5%的戊二醛的体积，C代表交联浓度，V1代表起始的鱼皮胶原/壳聚糖混合溶胀液的体积；
（2）将该牛腱胶原/壳聚糖多孔支架于50 oC真空干燥0.5、1、2、3、4、5小时，去除支架中残留的戊二醛，得到交联的牛腱胶原/壳聚糖组织工程多孔支架。
将不同时间点真空干燥的支架于37 oC、100ml三蒸水中浸泡96小时，收集不同时间点的清洗液，采用高效液相色谱检测淋洗下来的戊二醛的量，见图6。由图6可知，随着干燥时间的延长，支架中残留的戊二醛的量逐渐减少。
Claims (6)
1. 一次冻干制备交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）在酸性条件下分别配制质量浓度为0.5%的胶原溶液和壳聚糖溶液，将胶原溶液和壳聚糖溶液按体积比9:1混合，搅拌均匀，得到胶原/壳聚糖混合溶胀液，向该混合溶胀液中注入质量浓度为2.5%的戊二醛溶液，使溶液中戊二醛的最终浓度达到0.02%—0.5%，然后在37 oC下搅拌反应4小时，将反应后的胶原/壳聚糖混合溶胀液注射于模具中，在-20 oC冷冻0.5—3小时后，冻干，得到交联的胶原/壳聚糖多孔支架，所说的交联浓度是指戊二醛在混合溶胀液中的质量浓度，采用公式2.5% ×VGA = C×(VGA+ V1)计算，其中VGA代表起始加入的质量浓度为2.5%的戊二醛的体积，C代表交联浓度，V1代表起始的胶原/壳聚糖混合溶胀液的体积；
（2）将该胶原/壳聚糖多孔支架于20—50 oC真空干燥0.5—10小时，去除支架中残留的戊二醛，得到交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架。
2. 根据权利要求书1所述的一次冻干制备交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的方法，其特征在于所说的酸性条件是使用醋酸、甲酸或盐酸。
3. 根据权利要求书1所述的一次冻干制备交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的方法，其特征在于所说的胶原为牛腱胶原、鱼皮胶原、骨胶原、鼠尾胶原或猪皮胶原。
4. 根据权利要求书1所述的一次冻干制备交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的方法，其特征在于戊二醛的最终浓度为0.04%—0.25%。
5. 根据权利要求书1所述的一次冻干制备交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的方法，其特征在于步骤（1）中冷冻时间为1—2小时。
6. 根据权利要求书1所述的一次冻干制备交联的胶原/壳聚糖组织工程多孔支架的方法，其特征在于步骤（2）中真空干燥的温度为25—37oC，真空干燥时间为1—5小时。
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