CN102552975B - 一种组织工程人角膜基质载体支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用海水鱼类胶原蛋白制备组织工程人角膜基质载体支架的方法，是采用非酶解鳕鱼皮胶原蛋白冻干粉充分溶解于盐酸中，离心去除沉淀后将上清液分装入培养板孔中冻干，加入含硫酸软骨素的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺交联剂进行交联，用碱性Na2HPO4溶液稳定交联效果后，先后用2M NaCl、1M NaCl和蒸馏水清洗，冻干后即可作为组织工程人角膜基质的载体支架使用。本发明工艺科学合理，所制备的载体支架可用于批量生产，满足组织工程人工角膜基质规模化重建对载体支架的大量需求，为人角膜基质病盲通过临床角膜移植和重见光明创造条件，且此载体支架制备以及应用于组织工程人工角膜基质体外重建和临床治疗的成本低。
Description
技术领域
本发明属于人角膜培养技术领域，具体涉及一种组织工程人角膜基质载体支架，即利用海水鱼类胶原蛋白制备的组织工程人角膜基质载体支架。
背景技术
人角膜基质层占角膜厚度的90％，主要由角膜基质细胞和胶原纤维等细胞外基质成分规则排列而成，透明且具有一定的曲率半径，有利于光线通过和折曲，在维持整个角膜的透明度和曲光率等方面具有至关重要的作用。角膜基质层一旦受到任何外伤或炎症破坏，通常会导致角膜水肿、不透明和瘢痕形成，由于角膜基质层中没有血管故而代谢缓慢，病理代谢产物很难完全去除，即使愈合后也会留下不同程度的混浊从而使视力受损，即角膜翳(corneal nebula)。绝大多数角膜基质病盲患者均可以通过角膜移植手术来治愈，但由于捐献角膜的高度匮乏致使绝大部分患者得不到供体角膜而无法复明。近年来，角膜组织工程的兴起及其快速发展，使组织工程人角膜基质的体外重建及其临床应用成为可能，也为角膜基质病盲患者通过组织工程人角膜基质的移植和重见光明创造了条件。
对组织工程人角膜基质的体外重建研究开始于上个世纪末，如何获得足量的人角膜基质细胞和生物相容性理想的载体支架是目前组织工程人角膜基质体外重建的研究热点。国内外学者们分别利用癌基因转染的永生化人角膜基质细胞和体外培养的人角膜基质细胞作为种子细胞，分别利用胶原蛋白-硫酸软骨素凝胶、胶原蛋白-聚N-异丙基丙烯酰胺共混聚合物、胶原蛋白-糖胺聚糖-壳聚糖泡沫、聚羟基乙酸未拆解纤维、水凝胶移植用透明人角膜片、多层胶原纤维、人角膜基质细胞分泌的细胞外基质和脱细胞猪角膜基质等作为载体支架，在体外成功重建出形态结构和透明度与正常角膜基质相似的人角膜基质类似物，为组织工程人角膜基质的体外重建开辟了道路。但由于所用种子细胞具有潜在致瘤性或数量有限，且所用载体支架与人角膜基质细胞的生物相容性不够理想，故而限制了组织工程人角膜基质的规模化体外重建及其临床应用，目前仍局限于实验研究，根本无法满足众多角膜基质病盲患者临床移植的需要。
2009年，樊廷俊等首次成功建立了1个未经任何癌基因转染、无致瘤的人角膜基质细胞系，成功解决了组织工程人角膜基质规模化体外重建缺乏足量种子细胞的问题。因此，尽早建立与人角膜基质种子细胞具有理想生物相容性的载体支架的规模化制备技术，已成为国内外学者开展组织工程人角膜基质体外重建研究的主攻目标，是全世界各种角膜基质异常相关患者重见光明的希望。
发明内容
本发明的目的是提供一种组织工程人角膜基质载体支架，即一种海水鱼类胶原蛋白复合以硫酸软骨素制备出的与人角膜基质细胞生物相容性理想的载体支架，以及该支架的制备方法。
申请人在长期的研究中发现，以鱼类胶原蛋白为主要原料所制备出的胶原蛋白支架，更有利于人角膜基质细胞迁入且体内降解速率快，适于组织工程人角膜基质载体支架的规模化制备及其应用，从而促成了本发明。
本发明的组织工程人角膜基质载体支架，是以鱼皮胶原蛋白复合硫酸软骨素制备出的。
上述的组织工程人角膜基质载体支架中包含有质量百分比为20％-40％鱼皮胶原蛋白和60％-80％的硫酸软骨素。
上述支架的具体制备方法，包括如下的步骤：
1)将海水鱼类非酶解鱼皮胶原蛋白冻干粉溶解于盐酸中制成干粉溶液，离心过滤后加入到培养孔中冷冻干燥冻干；
2)将N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶解于2-吗啉乙磺酸-40％乙醇溶液中，制成NHS溶液，再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液混匀制成交联剂溶液，最后加入硫酸软骨素，制成含硫酸软骨素的交联剂溶液；
3)向含有海水鱼类非酶解鱼皮胶原蛋白冻干粉的培养孔中加入含硫酸软骨素的交联剂溶液，于室温下交联处理后，用Na2HPO4溶液清洗稳定交联效果；再用NaCl溶液清洗去除交联剂；最后，用蒸馏水清洗冻干后完成支架的制备。
上述步骤1)中盐酸浓度为0.01M-0.02M，制成的干粉溶液的浓度为5mg/ml-10mg/ml。
为了提高胶原蛋白复合载体支架的韧性，在步骤1)的干粉溶液中又添加了质量百分比为0.05％-0.1％的IV型胶原蛋白。
为了进一步提高人角膜基质细胞在胶原蛋白复合载体支架上的贴附效果，步骤1)的干粉溶液中又添加了质量百分比0.05‰-0.1‰的纤连蛋白。
上述步骤2)中的N-羟基琥珀酰亚胺溶解于50mM的2-吗啉乙磺酸-40％乙醇溶液中，制成6mM的N-羟基琥珀酰亚胺溶液；硫酸软骨素在含硫酸软骨素的交联剂溶液中的终浓度为2.4％-2.5％。
为了提高胶原蛋白复合载体支架的韧性，本发明又添加了0.05％-0.1％的IV型胶原蛋白。
为了提高人角膜基质细胞在胶原蛋白复合载体支架上的贴附效果，本发明又添加了0.05‰-0.1‰纤连蛋白。
上述的海水鱼类非酶解鱼皮胶原蛋白冻干粉为鳕鱼等深海鱼皮非酶解胶原蛋白冻干粉。
本发明的方法所制备出的组织工程人角膜基质载体支架具有透明性好、机械性强、通透性好、可降解性好、细胞易迁入且与人角膜基质细胞生物相容性好等特点。本发明的主要特点是：利用海水鱼类胶原蛋白复合以硫酸软骨素制备的胶原蛋白复合材料，经修饰后便可直接用作组织工程人角膜基质的载体支架，从而满足组织工程人角膜基质批量生产对载体支架的大量需求，而且抗原性小、易于人角膜基质细胞贴附和生长；且其生产和用作组织工程人角膜基质载体支架的成本低。到目前为止，仍未见有关利用海水鱼类胶原蛋白制备组织工程人角膜基质载体支架的研究报道，本发明首次提供出一种利用海水鱼类胶原蛋白为主要原料制备组织工程人角膜基质载体支架的方法。
具体实施方式
本发明支架的制备方法的步骤如下：
1)鱼皮胶原蛋白的处理：首先称取鳕鱼皮非酶解胶原蛋白冻干粉100-120毫克，溶解于12-20毫升0.01M-0.02M盐酸中，充分溶解后9000转/分钟离心40-50分钟，将所得上清液用0.22微米滤膜过滤后，按每孔0.5-0.6毫升的量加入到20个48孔板孔中，经-80℃冷冻40-60分钟后，用冷冻干燥机冻干10-12小时。
为了提高胶原蛋白复合载体支架的韧性，本发明又添加了0.05％-0.1％的IV型胶原蛋白。
为了进一步提高人角膜基质细胞在胶原蛋白复合载体支架上的贴附效果，本发明又添加了0.05‰-0.1‰纤连蛋白。
2、交联剂溶液的配制：称取2-吗啉乙磺酸97.6毫克加入到10毫升40％乙醇中，充分溶解后加入6.91毫克N-羟基琥珀酰亚胺，充分溶解后再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液50-60微升，最后加入硫酸软骨素240-250毫克，制成含2.4％-2.5％硫酸软骨素的交联剂溶液。
3、胶原蛋白复合支架材料的制备：向含有鱼皮胶原蛋白冻干粉的48孔板孔中，按每孔0.4-0.6毫升的量加入含2.4％-2.5％硫酸软骨素的交联剂溶液，于室温下交联处理5-7小时后，用pH9.1的0.1M Na2HPO4溶液(称取7.1克的无水Na2HPO4充分溶于400毫升蒸馏水中，用0.1M NaOH调pH值至9.1后用蒸馏水定容至500毫升)清洗1-2小时，以稳定交联效果。再用2M NaCl清洗1小时后，再用1M NaCl清洗10-12小时，每1-2小时换液1次，充分去除交联剂。最后，用蒸馏水清洗5-6次，每次30-40分钟，用冷冻干燥机冻干10-12小时后，即可作为组织工程人角膜基质的载体支架使用。
实施例1
称取鳕鱼皮非酶解胶原蛋白冻干粉120毫克，溶解于12毫升0.01M-0.02M盐酸中，充分溶解后9000转/分钟离心50分钟，将所得上清液用0.22微米滤膜过滤后，按每孔0.6毫升的量加入到20个48孔板孔中，经-80℃冷冻40分钟后，用冷冻干燥机冻干10小时。
称取2-吗啉乙磺酸97.6毫克加入到10毫升40％乙醇中，充分溶解后加入6.91毫克N-羟基琥珀酰亚胺，充分溶解后再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液50微升，最后加入硫酸软骨素240毫克，充分溶解后制成含2.4％硫酸软骨素的交联剂溶液。
向含有鱼皮胶原蛋白冻干粉的48孔板孔中，按每孔0.5毫升的量加入含2.4％硫酸软骨素的交联剂溶液，于室温下交联处理6小时后，用pH9.1的0.1M Na2HPO4溶液清洗2小时，以稳定交联效果。用2M NaCl清洗1小时后，再用1M NaCl清洗12小时，每2小时换液1次，充分去除交联剂。最后，用蒸馏水清洗5次，每次40分钟，用冷冻干燥机冻干10小时后，即可作为组织工程人角膜基质的载体支架使用。
实施例2
称取鳕鱼皮非酶解胶原蛋白冻干粉100毫克，溶解于20毫升0.01M-0.02M盐酸中，充分溶解后9000转/分钟离心40分钟，将所得上清液用0.22微米滤膜过滤后，按每孔0.55毫升的量加入到20个48孔板孔中，经-80℃冷冻60分钟后，用冷冻干燥机冻干11小时。
称取2-吗啉乙磺酸97.6毫克加入到10毫升40％乙醇中，充分溶解后加入6.91毫克N-羟基琥珀酰亚胺，充分溶解后再加入33mM的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液60微升，最后加入硫酸软骨素240毫克，充分溶解后制成含2.4％硫酸软骨素的交联剂溶液。
向含有鱼皮胶原蛋白冻干粉的48孔板孔中，按每孔0.5毫升的量加入含2.4％硫酸软骨素的交联剂溶液，于室温下交联处理7小时后，用pH9.1的0.1M Na2HPO4溶液清洗1.5小时，以稳定交联效果。用2M NaCl清洗1小时后，再用1M NaCl清洗10小时，每1.5小时换液1次，充分去除交联剂。最后，用蒸馏水清洗6次，每次30分钟，用冷冻干燥机冻干11小时后，即可作为组织工程人角膜基质的载体支架使用。
实施例3
称取鳕鱼皮非酶解胶原蛋白冻干粉110毫克，溶解于15毫升0.01M-0.02M盐酸中，充分溶解后9000转/分钟离心50分钟，将所得上清液用0.22微米滤膜过滤后，按每孔0.55毫升的量加入到20个48孔板孔中，经-80℃冷冻50分钟后，用冷冻干燥机冻干12小时。
称取2-吗啉乙磺酸97.6毫克加入到10毫升40％乙醇中，充分溶解后加入6.91毫克N-羟基琥珀酰亚胺，充分溶解后再加入33mM的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液60微升，最后加入硫酸软骨素250毫克，充分溶解后制成含2.5％硫酸软骨素的交联剂溶液。
向含有鱼皮胶原蛋白冻干粉的48孔板孔中，按每孔0.45毫升的量加入含2.5％硫酸软骨素的交联剂溶液，于室温下交联处理6小时后，用pH9.1的0.1M Na2HPO4溶液清洗1小时，以稳定交联效果。用2M NaCl清洗1小时后，再用1M NaCl清洗11小时，每2小时换液1次，充分去除交联剂。最后，用蒸馏水清洗5次，每次40分钟，用冷冻干燥机冻干12小时后，即可作为组织工程人角膜基质的载体支架使用。
本发明所制备载体支架与人角膜基质种子细胞所重建的组织工程人角膜基质移植到新西兰大白兔角膜中可使角膜保持透明100天以上，没有出现明显的免疫排斥反应，角膜水肿逐渐消失，角膜厚度逐渐恢复正常。
Claims (5)
1.一种组织工程人角膜基质载体支架，其特征在于所述的载体支架是以鱼皮胶原蛋白复合硫酸软骨素制备出的，其中鱼皮胶原蛋白的质量百分比为20%-40%，硫酸软骨素的含量为60%-80%；所述的载体支架的制备方法包括如下步骤：
1）将海水鱼类非酶解鱼皮胶原蛋白冻干粉溶解于盐酸中制成干粉溶液，离心过滤后加入到培养孔中冷冻干燥冻干；
步骤1）的干粉溶液中又添加了质量百分比为0.05%-0.1%的IV型胶原蛋白和质量百分比0.05‰-0.1‰的纤连蛋白；
2）将N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶解于2-吗啉乙磺酸-40%乙醇溶液中，制成 NHS溶液，再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液混匀制成交联剂溶液，最后加入硫酸软骨素，制成含硫酸软骨素的交联剂溶液；
3）向含有海水鱼类非酶解鱼皮胶原蛋白冻干粉的培养孔中加入含硫酸软骨素的交联剂溶液，于室温下交联处理后，用Na2HPO4溶液清洗稳定交联效果；再用NaCl溶液清洗去除交联剂；最后，用蒸馏水清洗冻干后完成支架的制备。
2.如权利要求1所述的载体支架，其特征在于所述的步骤1）中盐酸浓度为0.01M-0.02M，制成的干粉溶液的浓度为5mg/ml-10mg/ml。
3.如权利要求1所述的载体支架，其特征在于所述的步骤2）中的N-羟基琥珀酰亚胺溶解于50mM的 2-吗啉乙磺酸-40%乙醇溶液中，制成6mM的N-羟基琥珀酰亚胺溶液。
4.如权利要求1所述的载体支架，其特征在于所述的步骤2）中的硫酸软骨素在含硫酸软骨素的交联剂溶液中的终浓度为2.4%-2.5%。
5.如权利要求1所述的载体支架，其特征在于所述的海水鱼类非酶解鱼皮胶原蛋白冻干粉为鳕鱼深海鱼皮非酶解胶原蛋白冻干粉。
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