发明内容
本发明的目的就是利用人角膜,提供一种建立人角膜内皮细胞系的技术——一种人角膜内皮细胞系的构建方法。
从眼库中取出人角膜,分别用氯化汞溶液和庆大霉素消毒15~35分钟;于超净工作台中,将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中,向凹陷区加入胰蛋白酶溶液消化数分钟后;把角膜平均剪成4片角膜片,按内皮面朝下的方向贴入24孔培养板的孔底,加入含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养液,置于5%二氧化碳培养箱中、37℃下进行贴板培养;再采用时间梯度连续揭膜培养法获得人角膜内皮细胞,收集所得细胞后集中于2个培养孔中,于培养箱中放置12~24小时,将每个培养孔中加入1毫升的人角膜内皮细胞专用培养液,置5%二氧化碳培养箱中于37℃培养;每间隔3~5天更换上述专用培养液1次,以去除未贴壁的死细胞。待人角膜内皮细胞长成单层后,用0.2~0.5%胰蛋白酶溶液消化制成细胞悬液,按1瓶传2瓶的方式进行传代培养;待人角膜内皮细胞再次长成单层后,仍以相同方法进行传代。
本发明采用的时间梯度连续揭膜培养法的具体操作为:当角膜片培养18~48小时后,取出角膜片转贴于另一新培养孔中,加入同样培养液继续培养;于培养箱中12~24小时后,取出角膜片再转贴于另一新培养孔中,加入同样培养液继续培养;6~12小时后,取出角膜片,于倒置光学显微镜下挑选出只含有人角膜内皮细胞的培养孔。
所用人角膜内皮细胞专用培养液的配方为:DMEM/F12培养液,20%胎牛血清,0.25‰~1‰硫酸软骨素,0.05‰~0.15‰羧甲基壳多糖;为了促进人角膜内皮细胞的分裂和快速增殖,本发明又添加了0.05‰~0.15‰的N-乙酰葡萄糖盐酸盐、0.05‰~0.15‰的氨基葡萄糖盐酸盐、0.01‰~0.02‰的人表皮细胞生长因子和0.01‰~0.02‰的人碱性成纤维细胞生长因子;为了获得细胞的最佳增殖效果,本发明又在上述专用培养液的基础上添加了0.0025‰~0.0075‰的牛眼生素。
经这种方法所获得的传代细胞可传60代以上,本发明所构建的角膜内皮细胞系现已传至第106代。该细胞建系技术的主要特点是:细胞系可以连续传代,能提供出大量的人角膜内皮细胞;细胞系细胞未经任何转染,没有致瘤性,可直接应用于人工角膜的研制和临床应用;应用于人工角膜生产和临床治疗的成本低。
具体实施方式
1、角膜片贴板培养的启动:从眼库中取出2个完整的人角膜,放入100毫升玻璃烧杯中,加入10~30毫升浓度为0.9%的生理盐水,清洗5~9分钟;吸出生理盐水后,加入10~30毫升的浓度为1/2000~1/6000的氯化汞溶液浸泡10~20分钟,进行首次消毒;然后,吸出氯化汞溶液,再加入10~30毫升的浓度为20%~70%的庆大霉素,浸泡15~35分钟,于超净工作台中进行二次消毒;以下操作均在超净工作台中进行,所有用品均是无菌的;用眼科镊从庆大霉素液中取出角膜,将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中,向凹陷区加入0.2~0.5%胰蛋白酶0.5~1毫升消化3~6分钟;去除胰蛋白酶液,用眼科剪沿角膜中心点把每个角膜平均剪成4片,用眼科镊将角膜内皮面朝下贴入24孔培养板的孔底,每孔贴入4块角膜片;向贴入角膜片的培养孔中加入0.1~0.3毫升含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养液;将培养板放入5%二氧化碳培养箱中,37℃进行培养;
2、然后以时间梯度连续揭膜培养:贴板培养24~48小时后,用眼科镊取出培养孔中的角膜片,再转贴于同一块24孔培养板的另一个新培养孔中,加入0.1~0.3毫升含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养液,于同样条件下继续培养;12~24小时后,用眼科镊取出培养孔中的角膜片,再转贴于同一块24孔培养板的另一个新培养孔中,再6~12小时后,用眼科镊取出培养孔中的角膜片,于倒置光学显微镜下观察各培养孔的细胞,挑选出只含有人角膜内皮细胞的培养孔;
3、人角膜内皮细胞原代培养的启动:用滴管轻轻吹下上述只含有人角膜内皮细胞培养孔中的细胞,收集后集中放入2~4个培养孔中,于5%二氧化碳培养箱中、37℃放置12~24小时;
4、人角膜内皮细胞专用培养液的配制:取常规配制的DMEM/F12培养液3.0毫升,然后依次加入硫酸软骨素1~4毫克和羧甲基壳多糖0.2~0.6毫克,完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌,加入0.8毫升胎牛血清,补加常规配制的DMEM/F12培养液至4.0毫升,即为本发明的人角膜内皮细胞专用培养液。
为了促进人角膜内皮细胞的分裂和快速增殖,在上述专用培养液的基础上又添加了0.05‰~0.15‰的N-乙酰葡萄糖盐酸盐、0.05‰~0.15‰的氨基葡萄糖盐酸盐、0.01‰~0.02‰的人表皮细胞生长因子和0.01‰~0.02‰的碱性成纤维细胞生长因子;为了建立人角膜内皮细胞的最佳增殖条件,本发明在上述专用培养液的基础上又添加了0.0025‰~0.0075‰的牛眼生素。
5、将每个培养孔中加入1毫升的上述专用培养液,于5%二氧化碳培养箱中、37℃培养;每间隔3~5天,除去旧培养液,以去除未贴壁的死细胞,加入1毫升新鲜的人角膜内皮细胞专用培养液;
6、人角膜内皮细胞的传代培养:待人角膜内皮细胞长成单层后,吸出培养孔中的培养液,向每个培养孔中加入0.1~0.5毫升浓度为0.2~0.5%的胰蛋白酶溶液,静置消化3~5分钟;吸去胰蛋白酶溶液,每培养孔中加入1毫升的上述专用培养液,用滴管吹打培养孔底3~5分钟制成人角膜内皮细胞悬液;从每培养孔中分别取出0.5毫升角膜内皮细胞悬液,分别加入到新的培养孔中,每个培养孔补加上述专用培养液0.5毫升,使之最终体积至1毫升;待人角膜内皮细胞再次长成单层后,仍以上述的相同方法进行传代培养。
实施例1
从眼库中取出2个完整的人角膜,放入100毫升玻璃烧杯中,加入10毫升浓度为0.9%的生理盐水,清洗5分钟;吸出生理盐水后,加入10毫升的浓度为1/6000的氯化汞溶液浸泡10分钟,进行首次消毒;然后,吸出氯化汞溶液,再加入10毫升的浓度为20%的庆大霉素,浸泡15分钟,于超净工作台中进行二次消毒;以下操作均在超净工作台中进行,所有用品均是无菌的;用眼科镊从庆大霉素液中取出角膜,将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中,向凹陷区加入0.2%胰蛋白酶0.5毫升消化3分钟;去除胰蛋白酶液,用眼科剪沿角膜中心点把每个角膜平均剪成4片,用眼科镊将角膜内皮面朝下贴入24孔培养板的孔底,每孔贴入4块角膜片;向贴入角膜片的培养孔中加入0.1毫升含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养液;将培养板放入5%二氧化碳培养箱中,37℃进行培养。贴板培养24小时后,用眼科镊取出培养孔中的角膜片,再转贴于同一块24孔培养板的另一个新培养孔中,加入0.1毫升含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养液,于同样条件下继续培养;1 2小时后,用眼科镊取出培养孔中的角膜片,再转贴于同一块24孔培养板的另一个新培养孔中,加入0.1毫升含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养液,于同样条件下继续培养;6小时后,用眼科镊取出培养孔中的角膜片,于倒置光学显微镜下观察各培养孔的细胞,挑选出只含有人角膜内皮细胞的培养孔。用滴管轻轻吹下只含有人角膜内皮细胞培养孔中的细胞,收集后集中放入2个培养孔中,于5%二氧化碳培养箱中、37℃放置12小时。取常规配制的DMEM/F12培养液3.0毫升,然后依次加入硫酸软骨素1毫克和羧甲基壳多糖0.2毫克,完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌,加入0.8毫升胎牛血清,补加常规配制的DMEM/F12培养液至4.0毫升,即为人角膜内皮细胞专用培养液。将每个培养孔中加入1毫升的上述专用培养液,于5%二氧化碳培养箱中、37℃培养;每间隔3天,除去旧培养液,以去除未贴壁的死细胞,加入1毫升新鲜的人角膜内皮细胞专用培养液。待人角膜内皮细胞长成单层后,吸出培养孔中的培养液,向每个培养孔中加入0.1毫升浓度为0.2%的胰蛋白酶溶液,静置消化3分钟;吸去胰蛋白酶溶液,每培养孔中加入1毫升的上述专用培养液,用滴管吹打培养孔底3分钟制成人角膜内皮细胞悬液;从每个培养孔中分别取出0.5毫升角膜内皮细胞悬液,分别加入到新的培养孔中,每培养孔补加上述专用培养液0.5毫升,使之最终体积至1毫升;待人角膜内皮细胞再次长成单层后,仍以上述的相同方法进行传代培养。
实施例2
从眼库中取出2个完整的人角膜,放入100毫升玻璃烧杯中,加入30毫升浓度为0.9%的生理盐水,清洗9分钟;吸出生理盐水后,加入30毫升的浓度 1/2000的氯化汞溶液浸泡20分钟,进行首次消毒;然后,吸出氯化汞溶液,再加入30毫升的浓度为70%的庆大霉素,浸泡35分钟,于超净工作台中进行二次消毒;以下操作均均为无菌状态;用眼科镊从庆大霉素液中取出角膜,将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中,向凹陷区加入0.5%胰蛋白酶1毫升消化6分钟;去除胰蛋白酶液,用眼科剪沿角膜中心点把每个角膜平均剪成4片,用眼科镊将角膜内皮面朝下贴入24孔培养板的孔底,每孔贴入4块角膜片;向贴入角膜片的培养孔中加入0.3毫升含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养液;将培养板放入5%二氧化碳培养箱中,37℃进行培养。贴板培养48小时后,用眼科镊取出培养孔中的角膜片,再转贴于同一块24孔培养板的另一个新培养孔中,加入0.3毫升含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养液,于同样条件下继续培养;24小时后,用眼科镊取出培养孔中的角膜片,再转贴于同一块24孔培养板的另一个新培养孔中,加入0.3毫升含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养液,于同样条件下继续培养;12小时后,用眼科镊取出培养孔中的角膜片,于倒置光学显微镜下观察各培养孔的细胞,挑选出只含有人角膜内皮细胞的培养孔。用滴管轻轻吹下只含有人角膜内皮细胞培养孔中的细胞,收集后集中放入4个培养孔中,于5%二氧化碳培养箱中、37℃放置24小时。在人角膜内皮细胞专用培养液中,又添加了0.15‰的N-乙酰葡萄糖盐酸盐、0.15‰的氨基葡萄糖盐酸盐、0.02‰的人表皮细胞生长因子和0.02‰的碱性成纤维细胞生长因子,更有利于人角膜内皮细胞的分裂和快速增殖。将每个培养孔中加入1毫升的上述培养液,于5%二氧化碳培养箱中、37℃培养;每间隔5天,除去旧培养液,以去除未贴壁的死细胞,加入1毫升新鲜的上述培养液。待人角膜内皮细胞长成单层后,吸出培养孔中的培养液,向每个培养孔中加入0.5毫升浓度为0.5%的胰蛋白酶溶液,静置消化5分钟;吸去胰蛋白酶溶液,每培养孔中加入1毫升的上述培养液,用滴管吹打培养孔底5分钟制成人角膜内皮细胞悬液;从每培养孔中分别取出0.5毫升角膜内皮细胞悬液,分别加入到新的培养孔中,每培养孔补加上述培养液0.5毫升,使之最终体积至1毫升;待人角膜内皮细胞再次长成单层后,仍以上述的相同方法进行传代培养。
实施例3
从眼库中取出2个完整的人角膜,放入100毫升玻璃烧杯中,加入20毫升浓度为0.9%的生理盐水,清洗7分钟;吸出生理盐水后,加入20毫升的浓度为1/4000的氯化汞溶液浸泡15分钟,进行首次消毒;然后,吸出氯化汞溶液,再加入20毫升的浓度为50%的庆大霉素,浸泡20分钟,于超净工作台中进行二次消毒;以下操作均为无菌状态;用眼科镊从庆大霉素液中取出角膜,将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中,向凹陷区加入0.4%胰蛋白酶0.7毫升消化5分钟;去除胰蛋白酶液,用眼科剪沿角膜中心点把每个角膜平均剪成4片,用眼科镊将角膜内皮面朝下贴入24孔培养板的孔底,每孔贴入4块角膜片;向贴入角膜片的培养孔中加入0.2毫升含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养液;将培养板放入5%二氧化碳培养箱中,37℃进行培养。贴板培养36小时后,用眼科镊取出培养孔中的角膜片,再转贴于同一块24孔培养板的另一个新培养孔中,加入0.2毫升含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养液,于同样条件下继续培养;18小时后,用眼科镊取出培养孔中的角膜片,再转贴于同一块24孔培养板的另一个新培养孔中,加入0.2毫升含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养液,于同样条件下继续培养;9小时后,用眼科镊取出培养孔中的角膜片,于倒置光学显微镜下观察各培养孔的细胞,挑选出只含有人角膜内皮细胞的培养孔。用滴管轻轻吹下只含有人角膜内皮细胞培养孔中的细胞,收集后集中放入3个培养孔中,于5%二氧化碳培养箱中、37℃放置18小时。在上述人角膜内皮细胞专用培养液中,又添加了0.15‰的N-乙酰葡萄糖盐酸盐、0.15‰的氨基葡萄糖盐酸盐、0.02‰的人表皮细胞生长因子、0.02‰的碱性成纤维细胞生长因子和0.005‰的牛眼生素,以满足人角膜内皮细胞的最佳增殖条件。将每个培养孔中加入1毫升的上述培养液,于5%二氧化碳培养箱中、37℃培养;每间隔4天,除去旧培养液,以去除未贴壁的死细胞,加入1毫升新鲜的上述培养液。待人角膜内皮细胞长成单层后,吸出培养孔中的培养液,向每个培养孔中加入0.3毫升浓度为0.2~0.5%的胰蛋白酶溶液,静置消化4分钟;吸去胰蛋白酶溶液,每培养孔中加入1毫升的上述培养液,用滴管吹打培养孔底4分钟制成人角膜内皮细胞悬液;从每培养孔中分别取出0.5毫升角膜内皮细胞悬液,分别加入到新的培养孔中,每培养孔补加上述培养液0.5毫升,使之最终体积至1毫升;待人角膜内皮细胞再次长成单层后,仍以上述的相同方法进行传代培养。