CN101152580A

CN101152580A - 用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法

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Publication number: CN101152580A
Application number: CNA2007102016771A
Authority: CN
Inventors: 陆洪光; 王新宇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-09-13
Filing date: 2007-09-13
Publication date: 2008-04-02

Abstract

本发明提供了一种用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，该方法包括(1)表皮干细胞的制备：表皮细胞制成细胞悬液经IV型胶原粘附筛选后用表皮干细胞培养基进行培养；(2)去表皮真皮的制备；(3)组织工程皮肤的构建：取培养2～5代的表皮干细胞用Dispase酶消化有米粒至黄豆大小的细胞膜片浮起，将膜片接种至去表皮真皮上，加入组织培养基，进行液下液面培养得组织工程皮肤。采用本发明方法构建的组织工程皮肤更加符合人皮肤生物学特点。

Description

用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法

技术领域

本发明涉及一种组织工程皮肤的制备方法，特别是涉及用表皮干细胞在体外制作组织工程皮肤的方法。

背景技术

近年来，随着体外种子细胞培养技术和真皮替代物的发展，人们开发出了具有各种同人类皮肤结构相似的人工皮肤，称为组织工程皮肤。组织工程皮肤不仅用于创伤(如烧伤)后皮肤的移植和修复，还可用于皮肤发育、皮肤病发病机理的研究以及对某些皮肤病的治疗等。因此，在医学领域有广阔的发展和应用前景。皮肤种子细胞和真皮替代物是构建组织工程皮肤的重要要素。由于表皮干细胞是多能干细胞，有潜在的增殖分化为表皮及皮肤附属器的能力，近年来成为研究热点之一。由于去表皮的真皮组织(De-epidermized Dermis，DED)为富含胶原的三维结构，其表面保留基底膜某些蛋白成分，在体外皮肤重建中具有较高的应用价值。

以前申请人曾报道用微小皮瓣结合DED体外构建人工皮肤(陆洪光，等，Fluorescenceimaging of reepithelialization from skin explant cultures on acellular dermis.Wound Rep Reg 2004；12：578-589)，该研究显示人的皮肤细胞可在去表皮真皮(DED)上再生并发育成符合人的生物学特征的人工皮肤。有人报道(陈钢泉等，江西医学院学报，2006年第1期)用体外培养的表皮细胞，接种在异种(猪)无细胞真皮支架上进行体外培养，构建组织工程皮肤。专利申请号为CN200310104830.0、发明名称为“人体组织工程皮肤的制备方法”的专利申请也公开了一种组织工程皮肤的制备方法，该方法将表皮角元细胞接种在基质凝胶上进行组织工程皮肤的培养，其中基质凝胶是由I型猪胶原蛋白添加F12培养液和含有成纤维细胞的F12培养液制备而成。近来有人(胡葵葵等，中华整形外科杂志，2007第1期)用表皮干细胞作为种子细胞接种在经冷冻干燥的用戊二醛交联的I型胶原基质网架的两侧，构建含表皮干细胞的复合皮肤。

尽管以往技术提供了体外建立人工皮肤的方法，但是仍然存在一些明显不足：

1、微小皮瓣结种法不能满足人们对人工皮肤种子细胞的需要。

2、用异种(猪)无细胞真皮作为真皮替代物支架来培养人工皮肤，是否完全符合人皮肤的生物学特点值得探讨。

3、I型胶原基质作为真皮替代物支架培养人工皮肤，缺乏人工真皮的结构和基底膜的其它必要成分(如Vimentin，IV型胶原，层粘蛋白等)，这对种子细胞的发育会有一定影响。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用表皮干细胞在体外构建组织工程皮肤的方法，该方法将表皮干细胞接种在经处理的人类真皮上，从而构建了更加符合人皮肤生物学特点的组织工程皮肤。

皮肤组织工程学的关键是种子细胞的选择和培养，表皮干细胞因具有较大的增殖和分化潜能成为近年来研究的重点之一。表皮中角质形成细胞主要由三种细胞组成：表皮干细胞(Epidermal stem cells，ESCs)、短暂扩增细胞(transit amplifying，TA)、有丝分裂后分化细胞(postmitotic differentiating cells，PMD cells)。其中表皮干细胞是增殖能力最强的细胞，是潜在的多能干细胞。ESCs最显著的两个特征是它的慢周期性(slowcyclying)与自我更新能力。慢周期性表现为ESCs的生长周期较长，自我更新能力表现为在体外培养的细胞呈克隆性生长。本发明利用IV型胶原快速粘附法筛选ESCs，并利用ESCs的慢周期性、克隆形成的特点结合角蛋白19(Keratin19，K19)、β1-整合素阳性表达对筛选的ESCs进行进一步鉴定。

除种子细胞外，细胞支架及基质(即真皮替代物)在体外组织或器官培养中对诱导细胞发育成完整的表皮起关重要作用。在真皮替代物上的细胞培养由以往的平面向立体发展，由细胞的单维向三维转变，并且结合气-液面培养技术，使人工皮肤培养技术成为可能。本实验选用的真皮替代物是生物相容性好，在组织成分上与自体皮肤最相近的天然真皮替代物去表皮的真皮组织(De-epidermized Dermis，DED)。由于DED保留了较完整的基底膜成份如胶原蛋白，板层素(laminin)等成分，保证了诱导表皮发育、增殖和分化的初始条件，有利于ESCs的生长。从本结果可以看出，用ESCs膜片在DED上构建的表皮更接近正常皮肤。而ESCs膜片本已是单层细胞的融合，且有较多ESCs克隆的融合，接种后不易滑落，从而保证足量细胞在DED上的增殖分化。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法包括如下步骤：

(1)表皮干细胞的制备：取皮肤组织，以酶消化法配制浓度为1×10⁶～2×10⁶个细胞/ml的表皮细胞悬液，将细胞悬液接种至预铺了IV型胶原液的六孔培养皿内，将六孔培养皿置于5％CO₂、37℃孵箱中培养10分钟使表皮干细胞贴壁，然后将液体和未贴壁的细胞吸出，在培养皿中加入表皮干细胞培养基继续培养，2～3天换液一次，待细胞长至70～80％融合时进行传代培养；

(2)去表皮的真皮的制备：取健康成人皮肤标本，用PBS清洗标本表面附着物，常规消毒，去除标本皮下脂肪组织层，制成1×1cm²的皮片，浸于56℃PBS中30分钟，然后去除标本表皮，将去除表皮的标本密封后迅速置入液氮中5分钟，取出后室温放置30分钟，依此连续10个循环后，即得去表皮的真皮；

(3)组织工程皮肤的构建：取培养2～5代的表皮干细胞用Dispase酶在37℃、5％CO₂孵箱中消化20分钟，有细胞膜片浮起，将膜片平展接种至步骤(2)制备好的去表皮的真皮上，加入组织培养基，使液面略高于去表皮的真皮进行浸没培养，3～4天换液一次，7天后进行气-液面培养，培养4周后即得组织工程皮肤。优选地，将表皮干细胞接种至去表皮的真皮上时，每块真皮上接种两个膜片，两个膜片并行排列，不要重叠。

步骤(1)中所述传代培养的具体操作为：将前代培养的表皮干细胞分成3份，分别接种至预铺了IV型胶原的六孔培养皿中，将六孔培养皿置于5％CO₂、37℃孵箱中培养10分钟使表皮干细胞贴壁，然后将液体和未贴壁的细胞吸出，在培养皿中加入表皮干细胞培养基继续培养，2～3天换液一次，待细胞长至70～80％融合时进行下代的传代培养。其中，IV型胶原液中IV型胶原的浓度为0.5mg/ml，IV型胶原为人胎盘IV型胶原。将获得的一代表皮干细胞进行传代培养，一方面是为了获得更多的表皮干细胞，另一方面还可以利用IV型胶原对表皮干细胞的粘附作用对表皮干细胞进行筛选。

步骤(1)中所述的用酶消化法制备细胞悬液的具体操作为：将皮肤组织剪成宽2～4mm的细长条，以Dispase酶在4℃下消化16～18小时，然后将表皮与真皮分离，将分离后的表皮剪碎，在剪碎的表皮中加入含胰酶0.125％、乙二胺四乙酸0.1％的PBS液进行消化、离心，用KC-SFM液重悬细胞配制细胞悬液。

在表皮干细胞的制备和传代培养中所用到的IV型胶原液的浓度为0.5mg/ml，IV型胶原可以选择人胚胎IV型胶原。

前述方法中，步骤(1)制备表皮干细胞和进行表皮干细胞的传代培养时所用到的表皮干细胞培养基为：以KC-SFM为基础培养基，添加牛垂体提取物25μg/ml、霍乱毒素20ng/ml、非必需氨基酸0.1mmol/ml、hEGF 10ng/ml、bFGF 4ng/ml、胰岛素0.1μmol/L、青霉素和链霉素100u/ml；步骤(3)所用到的组织培养基为：以DMEM∶F12为3∶1的体积比配制基础培养基，在基础培养基中添加牛垂体提取物25μg/ml、霍乱毒素20ng/ml、非必需氨基酸0.1mmol/ml、hEGF 10ng/ml、bFGF 4ng/ml、10％FBS、胰岛素0.1μmol/L、青霉素和链霉素100u/ml。

实验例一表皮干细胞的鉴定

1、形态观察

取原代培养的表皮干细胞于倒置显微镜下观察细胞生长形态，可以看到：细胞呈克隆状生长，表皮干细胞原代培养1天时呈特征性的铺路石样生长，细胞小而圆，细胞核较大，核质比较大，第3天即可见到2～3个细胞的小克隆，7～8天可见较大克隆的形成，细胞聚集在集落中心周围呈辐射状生长，且高倍镜下可见到多个双核的分裂细胞；原代细胞一般要培养14～16天才能长至70～80％融合，具有慢生长周期的特性。这些都是表皮干细胞的显著特征

2、免疫组化检测

在进行表皮干细胞的第二代传代培养时，在六孔培养皿的孔内放置10mm×10mm玻片做细胞爬片，用于免疫组化检测，对第二代表皮干细胞进行K19和β1-整合素的表达，并以培养的角质形成细胞做对照。结果表明第二代表皮干细胞的K19、β1-整合素的染色呈阳性，表现为细胞胞浆的棕黄染色，而对照组的K19及β1-整合素的表达都不明显。

实验例二组织工程皮肤构建方法的筛选和鉴定

1、方法

本实验中选择了两种方法来构建组织工程皮肤，A方法是取第2～5代传代培养的表皮干细胞用胰酶消化成单细胞，用表皮干细胞培养基重悬细胞，配制成浓度为10⁶个/ml的细胞悬液，将细胞悬液接种至去表皮真皮表面，缓缓加入组织培养基，使培养基液面略低于去表皮真皮表面，然后置于37℃、5％CO2孵箱中培养6～8h，待表皮干细胞贴壁后再添加组织培养基，液面下浸没培养，3～4天换液一次，培养7天后改为气-液面培养；B方法是取第2～5代传代培养的表皮干细胞用Dispase酶在37℃消化20分钟，可见有米粒至黄豆大小的细胞膜片浮起，用显微镊将膜片夹起接种至去表皮真皮上，缓缓加入组织培养基，使培养基液面略高于人工真皮表明，进行液面下浸没培养，3～4天换液一次，培养7天后改为气-液面培养。

2、肉眼观察

A方法和B方法培养4周后的组织工程皮肤可见薄层的乳白色皮肤类似物，皮纹清晰可见

3、组织学观察

气-液面培养4周的组织工程皮肤切片做HE染色和角蛋白免疫组化染色，角蛋白免疫组化染色的一抗为鼠抗人角蛋白CK单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，ABC法，DAB显色，苏木素复染，以PBS代替一抗做阴性对照。

A方法的新生表皮可见有3～5层细胞，细胞排列不整齐，有的聚集成巢状，角质层较薄；B方法的新生表皮结构清晰，层次分明，基底层的细胞排列整齐，角质层角化完全。两种方法的角蛋白免疫组化染色均呈阳性反应，表皮呈棕黄染色。

从两组结果可以看出，用表皮干细胞膜片比用表皮干细胞悬液接种至DED上构建的表皮更接近正常皮肤。主要的原因是细胞悬液接种至DED上后，部分细胞滑落，难以保证足够的接种细胞密度；而ESCs膜片本已是单层细胞的融合，且有较多ESCs克隆的融合，接种后不易滑落，从而保证足量细胞在DED上的增殖分化。由于B方法的新生表皮结构清晰，层次分明，基底层的细胞排列整齐，角质层角化完全，所以本发明选择B方法构建组织工程皮肤。

与现有技术相比，本发明选用表皮干细胞和经处理的人工真皮组织来构建组织工程皮肤，表皮干细胞经IV型胶原筛选，具有较高的纯度，而且表皮干细胞的增殖能力很强。经处理的人工真皮保留了较完整的基底膜成份如胶原蛋白、板层素(laminin)等，保证了诱导表皮发育、增殖和分化的初始条件，使用本发明方法构建的组织工程皮肤更加符合人皮肤生物学特点的组织工程皮肤。

具体实施方式

本发明实施例中所用试剂的来源：DMEM培养基、角质细胞无血清培养基(KC-SFM)、Ham’s F12营养液、牛垂体提取物、重组人表皮生长因子(hEGF)、非必需氨基酸、胰岛素均购自美国Gibco公司，人胎盘IV型胶原、Dispase酶、胰蛋白酶、霍乱毒素、青霉素和链霉素均购自美国Sigma公司，重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自珠海亿胜公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司，鼠抗人角蛋白19(K19)单抗、鼠抗人β1-整合素(Integrin-β1)单抗购自美国Antibody Diagnostica公司、鼠抗人角蛋白单抗购自丹麦Dako公司，免疫组化试剂盒购自晶美生物工程有限公司。

本发明的组织工程皮肤的制备方法包括如下步骤：

(1)表皮干细胞的制备：取6岁男孩包皮环切手术后的皮肤，剪成宽2～4mm的细长条，以0.25％的Dispase酶在4℃下消化16～18小时，然后将表皮与真皮分离，将分离后的表皮剪碎，在剪碎的表皮中加入含0.125％胰酶、0.1％乙二胺四乙酸的PBS液(胰酶和乙二胺四乙酸是用PBS溶解的)进行消化、离心，用KC-SFM液重悬细胞配制浓度为1×10⁶～2×10⁶个细胞/ml的表皮细胞悬液，将细胞悬液接种至预铺了浓度为0.5mg/ml的人胎盘IV型胶原液的六孔培养皿内，将六孔培养皿置于5％CO₂、37℃孵箱中培养10分钟使表皮干细胞贴壁，然后将液体和未贴壁的细胞吸出，在培养皿中加入表皮干细胞培养基继续培养，2～3天换液一次，待细胞长至70～80％融合时进行传代培养；

所述表皮干细胞培养基为：以KC-SFM为基础培养基，添加牛垂体提取物25μg/ml、霍乱毒素20ng/ml、非必需氨基酸0.1mmol/ml、hEGF 10ng/ml、bFGF 4ng/ml、胰岛素0.1μmol/L、青霉素和链霉素100u/ml；

(2)去表皮真皮的制备：取健康成人皮肤标本，用PBS清洗标本表面附着物，常规消毒，去除标本皮下脂肪组织层，制成1×1cm²的皮片，浸于56℃PBS中30分钟，然后去除标本表皮，将去除表皮的标本密封后迅速置入液氮中5分钟，取出后室温放置30分钟，依此连续10个循环后，即得去表皮真皮；

(3)组织工程皮肤的构建：取培养2～5代的表皮干细胞用0.25％的Dispase酶在5％CO₂、37℃条件下消化20分钟，会有米粒至黄豆大小的细胞膜片浮起，每块去表皮的真皮上接种两个表皮干细胞膜片，接种时，将膜片平展，两个膜片并行排列(不重叠)，然后加入组织培养基，使液面略高于去表皮真皮进行浸没培养，3～4天换液一次，7天后进行气-液面培养，培养4周后即得组织工程皮肤；

所述组织培养基为：以DMEM∶F12为3∶1的体积比配制基础培养基，在基础培养基中添加牛垂体提取物25μg/ml、霍乱毒素20ng/ml、非必需氨基酸0.1mmol/ml、hEGF 10ng/ml、bFGF 4ng/ml、10％FBS、胰岛素0.1μmol/L、青霉素和链霉素100u/ml。

其中，步骤(1)中所述传代培养具体操作为：将前代培养的表皮干细胞分成3份，分别接种至预铺了浓度为0.5mg/ml的人胎盘IV型胶原液的六孔培养皿中，将六孔培养皿置于5％CO₂、37℃孵箱中培养10分钟使表皮干细胞贴壁，然后将液体和未贴壁的细胞吸出，在培养皿中加入表皮干细胞培养基继续培养，2～3天换液一次，待细胞长至70～80％融合时进行细胞的下代传代培养。

Claims

1.一种用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，包括如下步骤

(1)表皮干细胞的制备：取皮肤组织，以酶消化法配制浓度为1×106～2×106个细胞/ml的表皮细胞悬液，将细胞悬液接种至预铺了IV型胶原液的六孔培养皿内，将六孔培养皿置于5％CO2、37℃孵箱中培养10分钟使表皮干细胞贴壁，然后将液体和未贴壁的细胞吸出，在培养皿中加入表皮干细胞培养基继续培养，2～3天换液一次，待细胞长至70～80％融合时进行传代培养；

(2)去表皮的真皮的制备：取健康成人皮肤标本，用PBS清洗标本表面附着物，常规消毒，去除标本皮下脂肪组织层，制成1×1cm2的皮片，浸于56℃PBS中30分钟，然后去除标本表皮，将去除表皮的标本密封后迅速置入液氮中5分钟，取出后室温放置30分钟，依此连续10个循环后，即得去表皮的真皮；

(3)组织工程皮肤的构建：取培养2～5代的表皮干细胞用Dispase酶在37℃、5％CO2孵箱中消化20分钟，有细胞膜片浮起，将膜片平展接种至步骤(2)制备好的去表皮的真皮上，加入组织培养基，使液面略高于去表皮的真皮进行浸没培养，3～4天换液一次，7天后进行气一液面培养，培养4周后即得组织工程皮肤。

2.按照权利要求1所述的用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，其特征在于：制作表皮干细胞的皮肤组织取自包皮环切术后的皮肤。

3.按照权利要求1所述的用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，其特征在于：步骤(1)中所述传代培养为将前代培养的表皮干细胞分成3份，分别接种至预铺了IV型胶原的六孔培养皿中，将六孔培养皿置于5％CO2、37℃孵箱中培养10分钟使表皮干细胞贴壁，然后将液体和未贴壁的细胞吸出，在培养皿中加入表皮干细胞培养基继续培养，2～3天换液一次，待细胞长至70～80％融合时进行下代的传代培养。

4.按照权利要求1或3所述的用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，其特征在于：所述IV型胶原液中IV型胶原的浓度为0.5mg/ml。

5.按照权利要求1或3所述的用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，其特征在于：所述IV型胶原为人胎盘IV型胶原。

6.按照权利要求1所述的用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的酶消化法为将皮肤组织剪成宽2～4mm的细长条，以Dispase酶在4℃下消化16～18小时，然后将表皮与真皮分离，将分离后的表皮剪碎，在剪碎的表皮中加入含胰酶0.125％、乙二胺四乙酸0.1％的PBS液进行消化、离心，用KC-SFM液重悬细胞配制细胞悬液。

7.按照权利要求1所述的用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，其特征在于：步骤(1)中所述表皮干细胞培养基为：以KC-SFM为基础培养基，添加牛垂体提取物25μg/ml、霍乱毒素20ng/ml、非必需氨基酸0.1mmol/ml、hEGF 10ng/ml、bFGF 4ng/ml、胰岛素0.1μmol/L、青霉素100u/ml和链霉素100u/ml。

8.按照权利要求1所述的用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，其特征在于：步骤(3)中所述组织培养基为：以DMEM：F12为3∶1的体积比配制基础培养基，在基础培养基中添加牛垂体提取物25μg/ml、霍乱毒素20ng/ml、非必需氨基酸0.1mmol/ml、hEGF 10ng/ml、bFGF 4ng/ml、10％FBS、胰岛素0.1μmol/L、青霉素100u/ml和链霉素100u/ml。

9.按照权利要求1所述的用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法，其特征在于：步骤(3)中每块真皮上接种两个表皮干细胞膜片，膜片并行排列。