CN101554490B

CN101554490B - 一种制备可生物降解的组织工程用血管中间层支架材料的方法

Info

Publication number: CN101554490B
Application number: CN2009100226149A
Authority: CN
Inventors: 范代娣; 朱晨辉; 马晓轩; 米钰; 骆艳娥; 马沛; 惠俊峰; 朱晓丽; 李万华; 梁丽华; 陈岚
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2009-05-21
Filing date: 2009-05-21
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2029-05-21
Also published as: CN101554490A

Abstract

本发明公开了一种制备可生物降解组织工程用血管中间层支架材料的方法，包括以下步骤：将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成质量百分比浓度为1％～3％的溶液；将脱胶丝素溶解于30％～50％的CaCl₂溶液中，透析后得浓度为2～4％的丝素蛋白溶液；将上述两种溶液混合均匀，加入质量百分比浓度为20％～50％的戊二醛水溶液，混合搅拌、过滤后真空脱泡；将上述混合液注入管状模具中，4℃交联2天后置入-80℃冰箱，冷冻干燥制成血管内层支架。与现有技术相比，所制备的支架材料机械性、生物相容性、血液相容性以及免疫相容性优异，该支架材料免疫排异反应更低，而且彻底杜绝了动物胶原蛋白所不可避免的病毒隐患，使用安金性大幅度提高。

Description

一种制备可生物降解的组织工程用血管中间层支架材料的方法

技术领域

本发明涉及一种制备可生物降解组织工程用血管中间层支架材料的方法，属于生物医用材料领域。

背景技术

血管中间层支架材料的制作是血管组织工程领域非常关键的一个环节。而作为血管平滑肌细胞种植的支架，不仅应具有良好的生物相容性和生物可降解性，适宜的孔隙结构，还应当具有一定的强度和可塑性，能够抗血流压力和剪切力，使接种细胞黏附、增殖、分化后，在支架空间内有序分布、排列，合成适当的细胞外基质(ECM)，分化成具有血管中间层特定功能的血管样三维结构组织。

胶原蛋白是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，是机体的主要结构蛋白，是支持组织和结缔组织的主要组分，它具有良好的生物相容性、促新细胞形成功能和细胞粘附性。类人胶原蛋白是将人体已知序列胶原蛋白的一段mRNA逆转录生成cDNA后，经过特定序列重复和修饰，转化于大肠杆菌中，并经过高密度发酵、分离提取及纯化而得，由西安巨子生物基因技术股份有限公司发明并独家生产。它从根本上解决了动物提取胶原蛋白的水不溶性和病毒隐患(疯牛病、猪瘟疫、禽流感)等问题，并且具有良好的生物学特性和功能，促新细胞形成和促上皮细胞成纤维细胞，生长功能相比动物体提取胶原蛋白优良，免疫排异反应低。

丝素蛋白(silk fibroin，SF)是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，含量约占蚕丝的70％-80％，富含18种氨基酸，尤其以甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸含量最高，超过90％。实验表明蚕丝丝素蛋白覆层能显著促使成纤维细胞在培养的初始阶段具有较高的葡萄糖摄入和较低的谷氨酸盐消耗，增加细胞外I型胶原蛋白的聚集，并且具有优良的机械性能和生物相容性，适合作为血管组织工程中血管中间层支架材料的原料。

虽然胶原蛋白和丝素蛋白都具有良好的生物相容性，但是单纯用胶原蛋白构建的支架材料机械性能较差，降解速率快；单纯用丝素蛋白构建的支架材料不太利于细胞的吸附生长，均不能满足组织工程的要求。体内血管的中间层富有大量弹性纤维、胶原蛋白极富弹性，因此可以对胶原蛋白与丝素蛋白进行交联和改性，使其具有较高的机械性能以及具有与组织再生相匹配的降解速率。

发明内容

本发明提供了一种可生物降解组织工程用血管中间层支架材料的制备方法，该方法工艺简单，所制备的支架材料机械性、生物相容性、血液相容性以及免疫相容性优异，彻底杜绝了动物胶原蛋白支架材料所不可避免的病毒隐患，使用安全性大幅度提高。

本发明内容如下：

一种制备可生物降解的组织工程用血管中间层支架材料的方法，包括以下步骤：

1)将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成质量百分比浓度为1％～3％的溶液；

2)将脱胶丝素溶解于30％～50％的CaCl₂溶液中，透析后得浓度为2～4％的丝素蛋白溶液；

3)将上述两种溶液混合均匀，加入质量百分比浓度为20％～50％的戊二醛水溶液，混合搅拌、过滤后真空脱泡；

4)将上述混合液注入管状模具中，4℃交联2天后置入-80℃冰箱，冷冻干燥制成血管内层支架；

5)蒸馏水洗涤，再次冷冻干燥成型，钴⁶⁰消毒即可。

上述步骤中，所用的类人胶原蛋白为使用基因重组大肠杆菌高密度发酵生产的一种人源型胶原蛋白，该蛋白与人体免疫排异反应更低，促进受损组织修复能力更强，而且不存在病毒隐患。

上述步骤3)中，类人胶原蛋白和丝素蛋白混合的质量比为(1～9)∶1，该质量比以纯类人胶原蛋白和丝素蛋白计算。

上述步骤3)中，在类人胶原蛋白和丝素蛋白混合溶液中还加入了质量百分比为0.1％～0.5％的增塑剂，增塑剂的重量百分比为增塑剂占类人胶原蛋白和丝素蛋白混合溶液的比例，所用的增塑剂为丙三醇或者1.3-丁二醇中的一种或两种。

上述步骤4)中，所用的管状模具内径为5mm，外径为7mm。

本发明提供的可生物降解组织工程用支架材料具有适宜的微观结构和空隙率，具有优良的机械强度和可控的降解速率，适于平滑肌细胞增殖分化形成血管中间层组织，可应用于血管组织的修复与重建。与现有技术相比，所制备的支架材料机械性、生物相容性、血液相容性以及免疫相容性优异，该支架材料又具有显著的优点：它的免疫排异反应更低，而且彻底杜绝了动物胶原蛋白所不可避免的病毒隐患，使用安全性大幅度提高。

具体实施方式

下面通过具体实施实例对本发明作进一步说明。

根据文献报道方法制备B.mori丝素蛋白。将蚕茧剪碎，用0.02M的Na₂CO₃溶液溶解约1h，脱去丝胶。然后将所得到的脱胶丝素蛋白用蒸馏水反复冲洗，再溶于40％的CaCl₂溶液中，水浴约40min，所得丝素溶液用透析袋(截留分子量3500)透析，当所测溶液的电导率小于4.0μs时中止透析。将所得丝素溶液干燥，称重，计算出丝素溶液的浓度为3-4.％。

实施例1：

将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成1.5％的溶液，将脱胶丝素在水浴条件下溶解于40％CaCl₂溶液中，透析后得浓度为3％的丝素溶液，然后将两者按质量比2∶1混合，搅拌均匀后，再加入40μL 25％戊二醛水溶液，轻轻搅拌30min，过滤后真空脱泡，注入管状模具中，4℃交联2天后置入-80℃冰箱冷冻5h成型，并于-10℃真空干燥制成血管内层支架，蒸馏水洗涤5次后，重新冷冻干燥成型，钴⁶⁰消毒后备用。

实施例2：

将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成2％的溶液，将脱胶丝素在水浴条件下溶解于45％CaCl₂溶液中，透析后得浓度为3％的丝素溶液，然后将两者按质量比5∶1混合，加入溶液总量的0.4％的丙三醇，搅拌均匀后，再加入40μL25％戊二醛水溶液，轻轻搅拌30min，过滤后真空脱泡，注入管状模具中，4℃交联2天后置入-80℃冰箱冷冻5h成型，并于-10℃真空干燥制成血管内层支架，蒸馏水洗涤5次后，重新冷冻干燥成型，钴⁶⁰消毒后备用。

实施例3：

将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成1.5％的溶液，将脱胶丝素在水浴条件下溶解于40％CaCl₂溶液中，透析后得浓度为3％的丝素溶液，然后将两者按质量比6∶1混合，加入溶液总量的0.4％的1.3-丁二醇，搅拌均匀后，再加入40μL 25％戊二醛水溶液，轻轻搅拌30min，过滤后真空脱泡，注入管状模具中，4℃交联2天后置入-80℃冰箱冷冻5h成型，并于-10℃真空干燥制成血管内层支架，蒸馏水洗涤5次后，重新冷冻干燥成型，钴⁶⁰消毒后备用。

实施例4：

将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成1％的溶液，将脱胶丝素在水浴条件下溶解于40％CaCl₂溶液中，透析后得浓度为2％的丝素溶液，然后将两者按质量比3∶1混合，加入溶液总量的0.4％的丙三醇，搅拌均匀后，再加入20μL50％戊二醛水溶液，轻轻搅拌30min，过滤后真空脱泡，注入管状模具中，4℃交联2天后置入-80℃冰箱冷冻5h成型，并于-10℃真空干燥制成血管内层支架，蒸馏水洗涤5次后，重新冷冻干燥成型，钴⁶⁰消毒后备用。

实施例5：

将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成3％的溶液，将脱胶丝素在水浴条件下溶解于40％CaCl₂溶液中，透析后得浓度为4％的丝素溶液，然后将两者按质量比4∶1混合，加入溶液总量的0.4％的丙三醇，搅拌均匀后，再加入40μL25％戊二醛水溶液，轻轻搅拌30min，过滤后真空脱泡，注入管状模具中，4℃交联2天后置入-80℃冰箱冷冻5h成型，并于-10℃真空干燥制成血管内层支架，蒸馏水洗涤5次后，重新冷冻干燥成型，钴⁶⁰消毒后备用。

实施例6：

将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成1.5％的溶液，将脱胶丝素在水浴条件下溶解于30％CaCl₂溶液中，透析后得浓度为4％的丝素溶液，然后将两者按质量比5∶1混合，加入溶液总量的0.2％的丙三醇，搅拌均匀后，再加入40μL25％戊二醛水溶液，轻轻搅拌30min，过滤后真空脱泡，注入管状模具中，4℃交联2天后置入-80℃冰箱冷冻5h成型，并于-10℃真空干燥制成血管内层支架，蒸馏水洗涤5次后，重新冷冻干燥成型，钴⁶⁰消毒后备用。

实施例7：

将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成2％的溶液，将脱胶丝素在水浴条件下溶解于40％CaCl₂溶液中，透析后得浓度为4％的丝素溶液，然后将两者按质量比6∶1混合，加入溶液总量的0.2％的丙三醇和0.2％的1.3-丁二醇，搅拌均匀后，再加入40μL 25％戊二醛水溶液，轻轻搅拌30min，过滤后真空脱泡，注入管状模具中，4℃交联2天后置入-80℃冰箱冷冻5h成型，并于-10℃真空干燥制成血管内层支架，蒸馏水洗涤5次后，重新冷冻干燥成型，钴⁶⁰消毒后备用。

实施例8：

将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成2％的溶液，将脱胶丝素在水浴条件下溶解于40％CaCl₂溶液中，透析后得浓度为4％的丝素溶液，然后将两者按质量比7∶1混合，加入溶液总量的0.3％的1.3-丁二醇，搅拌均匀后，再加入40μL 25％戊二醛水溶液，轻轻搅拌30min，过滤后真空脱泡，注入管状模具中，4℃交联2天后置入-80℃冰箱冷冻5h成型，并于-10℃真空干燥制成血管内层支架，蒸馏水洗涤5次后，重新冷冻干燥成型，钴⁶⁰消毒后备用。

制备得到的支架材料的性能测试实验

1、机械性能测试

支架的拉伸性能由Instron 5565型电子万能实验机检测(纯类人胶原蛋白HLC为对照)。将干样品制成直式片：15mm×6mm(厚200μm)，采用100N载荷传感器，横梁的位移速度为1mm/min，得到样品断裂时的应力与应变并计算出材料的杨氏模量。每种材料平行检测6个样品。测试结果表明：当类人胶原蛋白(HLC)与丝素蛋白(SF)以质量比7∶3，5∶5复合时，力学性能测试表明本发明5∶5，7∶3复合支架呈现出接近于SF的应力与应变。

5∶5H-S和7∶3H-S血管支架的应力分别达到378±23KPa和332±16KPa，通过LSD显著性分析，这两种支架的应力和丝素蛋白(356±9KPa)没有显著性差异，而和纯类人胶原蛋白相比(214±11KPa)，P＜0.05，差异显著。

5∶5H-S和7∶3H-S血管支架的应变均高于类人胶原蛋白，和丝素蛋白相当，达到50±5％。

2、降解实验

取一定质量的HLC-SF血管支架分别置于5u/mL胰蛋白酶XI V(5u/mg，Sigma)溶液和PBS溶液(对照组)中，37℃震荡孵育20天。分别于5，10，15，20天取样，蒸馏水冲洗，冷冻干燥，称重。计算支架降解后的剩余质量百分率。剩余的质量百分率＝W_t/W₀×100％。W_t为消化一定时间后，各时间点的剩余质量，W₀为胶原酶消化前的支架质量。体外酶降解实验证明5∶5，7∶3H-S支架较慢的降解速率。

3、生物相容性实验

7∶3H-S支架具有良好的促细胞黏附、增殖的作用；体内的动物学实验更进一步验证了7∶3H-S支架良好的生物相容性。

Claims

1.一种制备可生物降解的组织工程用血管中间层支架材料的方法，其特征在于包括以下步骤：

1) 将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解成质量百分比浓度为1%～3%的溶液；

2) 将脱胶丝素溶解于30%～50% 的CaCl₂溶液中，透析后得浓度为2~4%的丝素蛋白溶液；

3) 将上述两种溶液混合均匀，加入戊二醛水溶液，混合搅拌、过滤后真空脱泡；

4) 将上述混合液注入管状模具中，4℃交联1-3天后置入-80℃冰箱，冷冻干燥制成血管中间层支架材料。

2.根据权利要求1所述制备可生物降解的组织工程用血管中间层支架材料的方法，其特征在于：所用的类人胶原蛋白为使用基因重组大肠杆菌高密度发酵生产的一种人源型胶原蛋白。

3.根据权利要求1所述制备可生物降解的组织工程用血管中间层支架材料的方法，其特征在于：类人胶原蛋白和丝素蛋白混合过程中质量比为(1~9):1。

4.根据权利要求1所述制备可生物降解的组织工程用血管中间层支架材料的方法，其特征在于：戊二醛水溶液中戊二醛的质量百分比浓度为20%～50%。

5.根据权利要求1所述制备可生物降解的组织工程用血管中间层支架材料的方法，其特征在于：步骤3）中，在类人胶原蛋白和丝素蛋白混合溶液中还加入了重量百分比为0.1%~0.5%的增塑剂。

6.根据权利要求5所述制备可生物降解的组织工程用血管中间层支架材料的方法，其特征在于：所用的增塑剂为丙三醇或1,3-丁二醇中的一种或两种。

7.根据权利要求1至6任意之一所述制备可生物降解的组织工程用血管中间层支架材料的方法，其特征在于：步骤4）中，所用的管状模具内径为5mm，外径为7mm。