CN1562389A

CN1562389A - 矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料及其制备方法

Info

Publication number: CN1562389A
Application number: CN 200410003454
Authority: CN
Inventors: 崔福斋; 孔祥东; 张伟
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2004-03-19
Filing date: 2004-03-19
Publication date: 2005-01-12
Anticipated expiration: 2024-03-19
Also published as: CN1265847C

Abstract

本发明涉及生物矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料及其制备方法，属于生物医用材料领域。首先制备水溶性的脱胶丝蛋白，搅拌状态下向此溶液中加入含钙离子溶液，随后缓慢注入含磷酸根离子的溶液，调节反应体系pH值，维持搅拌一定时间后将体系静置，离心、洗涤，重复此过程使洗脱液至中性，将分离的沉淀真空干燥。将干燥的沉淀研磨后进一步和生物相容性较好的高分子复合，得到多孔框架材料。所用的高分子为聚乳酸、乳酸和羟基乙酸的共聚物、海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖、明胶。用本方法制备的框架材料，具有良好的生物相容性和生物降解性，可用于临床骨修复。

Description

矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于骨修复的矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料及其制备方法，属于生物医用材料领域。

背景技术

天然骨是一个具有精密分级结构的复杂生物矿化系统，其有机成分主要是I型胶原纤维，其无机成分主要是钙磷盐和少量的碳酸磷灰石。胶原分子以相互错开四分之一的阵列规则排列构成胶原纤维，并形成孔区与重叠区相互交替的周期性结构，周期大约为67纳米。孔区提供矿物形核位点并规范矿物的取向。骨中的钙磷盐主要为形状不规则的片状纳米晶，晶体厚度为4-6纳米，宽度约30-45纳米，临近的片状纳米晶构成晶体层。

中国专利(申请号01136246.4)公开了一种纳米相钙磷盐/胶原/聚乳酸复合多孔材料的制备方法，该材料所使用的钙磷盐和胶原在纳米尺度上具有重复片层结构，周期为10-15纳米，由胶原层和钙磷盐层交替排列而成，该材料从成分和结构上仿天然骨。该多孔材料，具有良好的生物相容性，并已经取得良好的临床修复效果。该材料中含有胶原，目前国内医用胶原多依赖进口，再加上胶原蛋白提纯工艺复杂，成本较高；而国外所生产的胶原蛋白的来源主要是动物，如牛、猪等，存在一定的安全性问题。

本发明在已经制备矿化丝蛋白材料的基础上，进一步将其和高分子材料复合以制备骨修复用框架材料。

发明内容

本发明的目的是提供一种成本低、制备工艺简单，可适合规模生产的可用于骨修复的矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料以及该多孔材料的制备方法。

本发明提出的生物矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料，其特征在于，该材料主要含有矿化丝蛋白和高分子材料，所述高分子材料为聚乳酸、乳酸和羟基乙酸的共聚物、海藻酸盐、透明质酸、壳聚糖、明胶或它们的衍生物中的任何一种。

在上述复合多孔材料中，所述材料中还包含一种或多种骨生长因子。

在上述复合多孔材料中，所述骨生长因子可以为骨形态发生蛋白、转化生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、生长激素中的任何一种或两种以上的组合。

本发明提出的生物矿化丝蛋白高分子复合多孔材料的制备方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤：

(1)在丝蛋白溶液中滴加含有钙离子的溶液，使溶液中丝蛋白的质量百分比浓度最终为0.3％-30％，钙离子的摩尔浓度最终为0.01～2mol/L，滴加过程中需要不断搅拌；在搅拌状态下继续向溶液按摩尔比Ca∶P＝1～2∶1的量滴加加入磷酸根离子，最后调节至pH值为7.4～13；

(2)将上述溶液搅拌后静置，待沉淀与上清分层后，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤至中性，将沉淀放入冻干机内冷冻干燥，待干燥后研磨成粉；

(3)用溶剂溶解高分子，然后将上述步骤(2)中制备的干粉分散在高分子溶液中，得到混合溶液；

(4)将混合溶液倒入模具，处理后冷冻干燥；

(5)将上述步骤(4)中的成型材料脱模，将脱模后的材料经过水洗后，加入一种或多种生长因子，待材料干燥后用环氧乙烷蒸气消毒2～4小时，或用Co60辐照消毒，包装保存，即得矿化丝蛋白高分子复合多孔材料。

在上述制备方法中，所述在步骤(3)中，当选用的高分子为聚乳酸、乳酸和羟基乙酸的共聚物时，溶剂选用1，4-二氧六环、氯仿或二甲基亚砜中的任何一种。

在上述制备方法中，所述在步骤(3)中，当选用的高分子为海藻酸钠、透明质酸、明胶时，选用水做溶剂。

在上述制备方法中，所述在步骤(3)中，当选用的高分子为壳聚糖时，选用稀酸溶液作为溶剂。

在上述制备方法中，所述在步骤(4)中，当高分子选用壳聚糖、透明质酸、明胶时，可以交联，也可以不交联；选用的交联剂为甲醛、乙二醛和戊二醛、己二酸二酰肼、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺。

在上述制备方法中，所述在步骤(4)中，当高分子选用海藻酸盐时，用氯化钙作交联剂。

用本发明的方法制备的框架材料，具有良好的生物相容性和生物降解性，可用于临床骨修复。其成本低，工艺简单，适合于产业化生产。

附图说明

图1为本发明的多孔材料孔形态结构的SEM图。

图2为本发明的多孔材料孔壁的SEM图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明：

本发明中所用的丝蛋白来源可以为昆虫丝、蜘蛛丝或转基因丝，昆虫丝可以为家蚕、野蚕、柞蚕、天蚕、蓖麻蚕、樗蚕、蓑袋蛾昆虫丝等，使用前要将丝中的丝胶蛋白脱除，发明中优选家蚕丝和柞蚕丝。将脱胶的家蚕丝素蛋白溶于沸腾的质量浓度为40-50％的氯化钙溶液中或者将脱胶的柞蚕丝溶解于120℃的6-8mol/L的硝酸钙，都可以使丝素蛋白溶解，然后将溶解的丝素蛋白经过脱盐、浓缩处理。本发明所用的丝蛋白即经脱胶处理后的丝素蛋白。

本发明中所用的含磷酸根离子的溶液为磷酸和磷酸盐，所用的磷酸盐可以为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二氨、磷酸二氢氨；所用的含钙离子的溶液可以为氢氧化钙和钙盐，钙盐可以为硝酸钙、氯化钙；所用的碱液可以为碱金属氢氧化物或氢氧化铵，试验中一般选用氢氧化钠；冰醋酸；戊二醛；海藻酸钠(Acros Co.)；聚乳酸(山东济南医疗器械研究所)、乳酸和羟基乙酸的共聚物(山东济南医疗器械研究所)、透明质酸(山东福瑞达生物化工有限公司或大连泛邦化工技术开发有限公司)、壳聚糖(山东青岛海普生物技术公司)、明胶。除标明来源的试剂，其余均购自北京化学试剂公司，分析纯。

本发明提出的框架材料的制备方法主要在矿化丝蛋白材料的基础上，进一步复合高分子材料以制备骨修复用框架材料。

主要包括下列步骤：

(2)将上述溶液搅拌后静置，待沉淀与上清分层后，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤至中性，将沉淀放入冻干机内冷冻干燥，待干燥后研磨成干粉。

(3)用溶剂将高分子溶解，然后将上述步骤(2)中制备的干粉分散在高分子溶液中混匀，得到混合溶液。

(4)将上述步骤(3)中的混合溶液倒入模具，处理后冷冻干燥。

(5)将上述(4)中的成型材料脱模，将脱模后的材料经过水洗后，加入一种或多种骨生长因子。将材料干燥后或者直接用环氧乙烷蒸气消毒2～4小时，或用Co60辐照消毒，包装保存，即得本发明的丝蛋白/钙磷盐/高分子复合多孔材料。

现进一步对上述多孔材料的制备步骤加以说明。

步骤(3)中，当选用的高分子为聚乳酸(PLA)、乳酸和羟基乙酸的共聚物(PLGA)时，聚合物的分子量为5000～1500000，溶剂可以选用1，4-二氧六环、氯仿或二甲基亚砜中的任何一种，配制成的溶质质量体积浓度为0.02～0.15g/ml；当选用的高分子为海藻酸钠、透明质酸、明胶时，可以选用水等做溶剂，配制成的溶质浓度为0.01～5％；当选用的高分子为明胶时，选用水等做溶剂，配制成的溶质浓度为0.1～10％；当选用的高分子为壳聚糖时，可以选用2％醋酸作为溶剂，壳聚糖在醋酸中的浓度为0.2～5％。

步骤(4)中，模具在冷冻干燥前，可以在含有交联剂的溶液中浸泡，以交联其中的高分子。当高分子选用PLA、PLGA时，可以不用交联。当高分子选用壳聚糖、透明质酸、明胶时，可以交联，也可以不交联；海藻酸盐则用氯化钙进行交联，交联剂浓度为0.5％～10％；

实施例1

1)在调好的浓度为0.9％的500ml丝蛋白溶液中，滴加500ml浓度为0.25mol/的Ca(OH)₂溶液后，继续缓慢加入浓度为0.25mol/L的NaH₂PO₄溶液300ml，滴加过程中需要不断搅拌并调节pH为13。

2)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。

3)称取1.0gPLA置于烧瓶中，加入10ml 1，4-二氧六环得到10％的溶液，混合物在常温下搅拌2小时，加入1.0g制得的矿化丝蛋白，然后混合均匀。

4)将混合液倒入模具，冷冻后，置于冷冻干燥机内冷冻干燥。

5)将上述成型材料脱模，将脱模后的材料经过水洗后，加入骨形态发生蛋白2，待材料干燥后，用环氧乙烷蒸气消毒2小时，包装保存。

实施例2

1)在调好的浓度为33％的900ml丝蛋白溶液中，加入50ml浓度为0.2mol/L的CaCl₂溶液后，继续缓慢滴加浓度为0.2mol/L的Na₂HPO₄溶液50ml，滴加的同时用搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值稳定为7.4。

3)称取1.5g海藻酸钠，加入1.0g制得的矿化丝蛋白，然后混合均匀。

4)将混合液倒入模具，将模具放入5％的氯化钙溶液中交联12小时，然后脱膜，在蒸馏水中浸泡24小时后，在其中加入成纤维细胞生长因子，将样品冷冻干燥。

5)干燥后的样品用Co60消毒，包装保存。

实施例3

1)在调好的浓度为10％的100ml丝蛋白溶液中，加入浓度为2mol/L的KH₂PO₄溶液500ml，继续缓慢滴加400ml浓度为5mol/L的Ca(NO₃)₂溶液后，滴加的同时用搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加KOH溶液，直至pH值为8.0。

3)称取1.0g PLGA置与烧瓶中，加入20ml氯仿得到10％的溶液，混合物在常温下搅拌4小时，加入2.0g制得的矿化丝蛋白，然后混合均匀。

4)将混合液倒入模具，在-4℃冷冻后，置于冷冻干燥机内冷冻干燥。

5)将上述成型材料脱模，用Co60消毒，包装保存。

实施例4

1)调好的浓度为25％的900ml丝蛋白溶液中，加入50ml浓度为0.2mol/L的CaCl₂溶液后，继续缓慢滴加浓度为0.2mol/L的NH₃H₂PO₄溶液50ml，滴加的同时用搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值稳定为10.0。

3)称取1.0gPLGA置与烧瓶中，加入10ml二甲基亚砜得到10％的溶液，混合物在常温下搅拌8小时，得到均匀分散的溶液；加入0.5g制得的矿化丝蛋白，然后混合均匀。

5)将上述成型材料脱模，将脱模后的材料经过水洗后，加入骨形态发生蛋白2，用Co60消毒，包装保存。

实施例5

1)调好的浓度为25％的200ml丝蛋白溶液中，加入浓度为2mol/L的K₂HPO₄溶液500ml，继续缓慢滴加300ml浓度为5mol/L的Ca(NO₃)₂溶液后，滴加的同时用搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加KOH溶液，直至pH值为9.0。

3)称取1.5g壳聚糖，用15ml 2％醋酸溶解后，加入1.0g制得的矿化丝蛋白，然后混合均匀。

4)将混合液倒入模具，在pH为12的NaOH溶液中浸泡24小时后，再在蒸馏水中浸泡48小时，冷冻后进行冷冻干燥，脱膜，将脱模后的材料经过水洗后，加入生长激素，将样品冷冻干燥。

5)干燥后的样品用Co60消毒，包装保存。

实施例6

1)在调好的浓度为15％的200ml丝蛋白溶液中，加入500ml浓度为0.2mol/L的CaCl₂溶液后，继续缓慢滴加浓度为0.2mol/L的H₃PO₄溶液300ml，滴加的同时用搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值达到9.0。

3)称取1.0g透明质酸，加40ml水溶解后，加入5.0g制得的矿化丝蛋白，混合均匀，加入5倍量己二酸二酰肼，混合液倒入模具，交联1小时后，加去离子水并超声清洗0.5小时。

4)加入骨形态发生蛋白和转化生长因子，将样品冷冻干燥。

5)干燥后的样品用Co60消毒，包装保存。

实施例7

1)调好的浓度为30％的200ml丝蛋白溶液中，加入500ml浓度为1mol/L的CaCl₂溶液后，继续缓慢滴加浓度为0.7mol/L的NaH₂PO₄溶液300ml，滴加的同时用搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值达到12.0。

3)称取3.0g明胶，用20ml去离子水60℃溶解后，加入1.0g制得的矿化丝蛋白，得到混合溶液。

4)将混合液倒入模具，用浓度5％的戊二醛进行交联2小时后，将模具置入流动的蒸馏水中浸泡48小时，然后冷冻干燥，脱膜，加入骨形态发生蛋白和转化生长因子，将样品冷冻干燥。

5)干燥后的样品用Co60消毒，包装保存。

实施例8

1)调好的浓度为25％的450ml丝蛋白溶液中，加入25ml浓度为1mol/L的Ca(NO₃)₂溶液后，继续缓慢滴加浓度为1mol/L的KH₂PO₄溶液25ml，滴加的同时用磁力搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值稳定为8.5。

6)称取3.0g明胶，用20ml去离子水60℃溶解后，加入1.0g制得的矿化丝蛋白，得到混合溶液。

7)将混合液倒入模具，用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺进行交联，交联后将模具置入流动的蒸馏水中浸泡48小时，然后冷冻干燥，脱膜，将样品冷冻干燥。

8)干燥后的样品用Co60消毒，包装保存。

Claims

1、生物矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料，其特征在于，该材料主要含有矿化丝蛋白和高分子材料，所述高分子材料为聚乳酸、乳酸和羟基乙酸的共聚物、海藻酸盐、透明质酸、壳聚糖、明胶或它们的衍生物中的任何一种。

2、根据权利要求1所述的复合多孔材料，其特征在于，所述材料中还可包含一种或多种骨生长因子。

3、根据权利要求1或2所述的复合多孔材料，所述骨生长因子可以为骨形态发生蛋白、转化生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、生长激素中的任何一种或两种以上的组合。

4、制备如权利要求1所述的生物矿化丝蛋白高分子复合多孔材料的方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤：

(1)在丝蛋白溶液中滴加含有钙离子的溶液，使溶液中丝蛋白的质量百分比浓度最终为0.3％-30％，钙离子的摩尔浓度最终为0.01～2mol/L，滴加过程中需要不断搅拌；在搅拌状态下继续向溶液按摩尔比Ca∶P＝1～2∶1的量滴加加入磷酸根离子，最后调节至pH值为7.4～12；

(4)将混合溶液倒入模具，处理后冷冻干燥；

5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述在步骤(3)中，当选用的高分子为聚乳酸、乳酸和羟基乙酸的共聚物时，溶剂选用1，4-二氧六环、氯仿或二甲基亚砜中的任何一种。

6、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述在步骤(3)中，当选用的高分子为海藻酸钠、透明质酸、明胶时，选用水做溶剂。

7、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述在步骤(3)中，当选用的高分子为壳聚糖时，选用稀酸溶液作为溶剂。

8、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述在步骤(4)中，当高分子选用壳聚糖、透明质酸、明胶时，可以交联，也可以不交联；选用的交联剂为甲醛、乙二醛和戊二醛、己二酸二酰肼、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺。

9、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述在步骤(4)中，当高分子选用海藻酸盐时，用氯化钙作交联剂。