CN1265847C - 矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料及其制备方法,属于生物医用材料领域。首先制备水溶性的脱胶丝蛋白,搅拌状态下向此溶液中加入含钙离子溶液,随后缓慢注入含磷酸根离子的溶液,调节反应体系pH值,维持搅拌一定时间后将体系静置,离心、洗涤,重复此过程使洗脱液至中性,将分离的沉淀真空干燥。将干燥的沉淀研磨后进一步和生物相容性较好的高分子复合,得到多孔框架材料。所用的高分子为聚乳酸、乳酸和羟基乙酸的共聚物、海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖、明胶。用本方法制备的框架材料,具有良好的生物相容性和生物降解性,可用于临床骨修复。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于骨修复的矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料及其制备方法,属于生物医用材料领域。
背景技术
天然骨是一个具有精密分级结构的复杂生物矿化系统,其有机成分主要是I型胶原纤维,其无机成分主要是钙磷盐和少量的碳酸磷灰石。胶原分子以相互错开四分之一的阵列规则排列构成胶原纤维,并形成孔区与重叠区相互交替的周期性结构,周期大约为67纳米。孔区提供矿物形核位点并规范矿物的取向。骨中的钙磷盐主要为形状不规则的片状纳米晶,晶体厚度为4-6纳米,宽度约30-45纳米,临近的片状纳米晶构成晶体层。
中国专利(申请号00107493.8)公开了一种纳米相钙磷盐/胶原/聚乳酸复合多孔材料的制备方法,该材料所使用的钙磷盐和胶原在纳米尺度上具有重复片层结构,周期为10-15纳米,由胶原层和钙磷盐层交替排列而成,该材料从成分和结构上仿天然骨。该多孔材料,具有良好的生物相容性,并已经取得良好的临床修复效果。该材料中含有胶原,目前国内医用胶原多依赖进口,再加上胶原蛋白提纯工艺复杂,成本较高;而国外所生产的胶原蛋白的来源主要是动物,如牛、猪等,存在一定的安全性问题。
本发明在已经制备矿化丝蛋白材料的基础上,进一步将其和高分子材料复合以制备骨修复用框架材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种成本低、制备工艺简单,可适合规模生产的可用于骨修复的矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料以及该多孔材料的制备方法。
本发明提出的生物矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料,其特征在于,该材料主要含有矿化丝蛋白和高分子材料,所述高分子材料为聚乳酸、乳酸和羟基乙酸的共聚物、海藻酸盐、透明质酸、壳聚糖、明胶或它们的衍生物中的任何一种。
在上述复合多孔材料中,所述材料中还包含一种或多种骨生长因子。
在上述复合多孔材料中,所述骨生长因子可以为骨形态发生蛋白、转化生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、生长激素中的任何一种或两种以上的组合。
本发明提出的生物矿化丝蛋白高分子复合多孔材料的制备方法,其特征在于,该方法依次包括以下步骤:
(1)在丝蛋白溶液中滴加含有钙离子的溶液,使溶液中丝蛋白的质量百分比浓度最终为0.3%-30%,钙离子的摩尔浓度最终为0.01~2mol/L,滴加过程中需要不断搅拌;在搅拌状态下继续向溶液按摩尔比Ca∶P=1~2∶1的量滴加加入磷酸根离子,最后调节至pH值为7.4~13;
(2)将上述溶液搅拌后静置,待沉淀与上清分层后,除去上清,离心分离出沉淀,用去离子水反复洗涤至中性,将沉淀放入冻干机内冷冻干燥,待干燥后研磨成粉;
(3)用溶剂溶解高分子,然后将上述步骤(2)中制备的干粉分散在高分子溶液中,得到混合溶液;
(4)将混合溶液倒入模具,处理后冷冻干燥;
(5)将上述步骤(4)中的成型材料脱模,将脱模后的材料经过水洗后,加入一种或多种生长因子,待材料干燥后用环氧乙烷蒸气消毒2~4小时,或用Co60辐照消毒,包装保存,即得矿化丝蛋白高分子复合多孔材料。
在上述制备方法中,所述在步骤(3)中,当选用的高分子为聚乳酸、乳酸和羟基乙酸的共聚物时,溶剂选用1,4-二氧六环、氯仿或二甲基亚砜中的任何一种。
在上述制备方法中,所述在步骤(3)中,当选用的高分子为海藻酸钠、透明质酸、明胶时,选用水做溶剂。
在上述制备方法中,所述在步骤(3)中,当选用的高分子为壳聚糖时,选用稀酸溶液作为溶剂。
在上述制备方法中,所述在步骤(4)中,当高分子选用壳聚糖、透明质酸、明胶时,可以交联,也可以不交联;选用的交联剂为甲醛、乙二醛和戊二醛、己二酸二酰肼、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺。
在上述制备方法中,所述在步骤(4)中,当高分子选用海藻酸盐时,用氯化钙作交联剂。
用本发明的方法制备的框架材料,具有良好的生物相容性和生物降解性,可用于临床骨修复。其成本低,工艺简单,适合于产业化生产。
附图说明
图1为本发明的多孔材料孔形态结构的SEM图。
图2为本发明的多孔材料孔壁的SEM图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明:
本发明中所用的丝蛋白来源可以为昆虫丝、蜘蛛丝或转基因丝,昆虫丝可以为家蚕、野蚕、柞蚕、天蚕、蓖麻蚕、樗蚕、蓑袋蛾昆虫丝等,使用前要将丝中的丝胶蛋白脱除,发明中优选家蚕丝和柞蚕丝。将脱胶的家蚕丝素蛋白溶于沸腾的质量浓度为40-50%的氯化钙溶液中或者将脱胶的柞蚕丝溶解于120℃的6-8mol/L的硝酸钙,都可以使丝素蛋白溶解,然后将溶解的丝素蛋白经过脱盐、浓缩处理。本发明所用的丝蛋白即经脱胶处理后的丝素蛋白。
本发明中所用的含磷酸根离子的溶液为磷酸和磷酸盐,所用的磷酸盐可以为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二氨、磷酸二氢氨;所用的含钙离子的溶液可以为氢氧化钙和钙盐,钙盐可以为硝酸钙、氯化钙;所用的碱液可以为碱金属氢氧化物或氢氧化铵,试验中一般选用氢氧化钠;冰醋酸;戊二醛;海藻酸钠(Acros Co.);聚乳酸(山东济南医疗器械研究所)、乳酸和羟基乙酸的共聚物(山东济南医疗器械研究所)、透明质酸(山东福瑞达生物化工有限公司或大连泛邦化工技术开发有限公司)、壳聚糖(山东青岛海普生物技术公司)、明胶。除标明来源的试剂,其余均购自北京化学试剂公司,分析纯。
本发明提出的框架材料的制备方法主要在矿化丝蛋白材料的基础上,进一步复合高分子材料以制备骨修复用框架材料。
主要包括下列步骤:
(1)在丝蛋白溶液中滴加含有钙离子的溶液,使溶液中丝蛋白的质量百分比浓度最终为0.3%-30%,钙离子的摩尔浓度最终为0.01~2mol/L,滴加过程中需要不断搅拌;在搅拌状态下继续向溶液按摩尔比Ca∶P=1~2∶1的量滴加加入磷酸根离子,最后调节至pH值为7.4~13;
(2)将上述溶液搅拌后静置,待沉淀与上清分层后,除去上清,离心分离出沉淀,用去离子水反复洗涤至中性,将沉淀放入冻干机内冷冻干燥,待干燥后研磨成干粉。
(3)用溶剂将高分子溶解,然后将上述步骤(2)中制备的干粉分散在高分子溶液中混匀,得到混合溶液。
(4)将上述步骤(3)中的混合溶液倒入模具,处理后冷冻干燥。
(5)将上述(4)中的成型材料脱模,将脱模后的材料经过水洗后,加入一种或多种骨生长因子。将材料干燥后或者直接用环氧乙烷蒸气消毒2~4小时,或用Co60辐照消毒,包装保存,即得本发明的丝蛋白/钙磷盐/高分子复合多孔材料。
现进一步对上述多孔材料的制备步骤加以说明。
步骤(3)中,当选用的高分子为聚乳酸(PLA)、乳酸和羟基乙酸的共聚物(PLGA)时,聚合物的分子量为5000~1500000,溶剂可以选用1,4-二氧六环、氯仿或二甲基亚砜中的任何一种,配制成的溶质质量体积浓度为0.02~0.15g/ml;当选用的高分子为海藻酸钠、透明质酸、明胶时,可以选用水等做溶剂,配制成的溶质浓度为0.01~5%;当选用的高分子为明胶时,选用水等做溶剂,配制成的溶质浓度为0.1~10%;当选用的高分子为壳聚糖时,可以选用2%醋酸作为溶剂,壳聚糖在醋酸中的浓度为0.2~5%。
步骤(4)中,模具在冷冻干燥前,可以在含有交联剂的溶液中浸泡,以交联其中的高分子。当高分子选用PLA、PLGA时,可以不用交联。当高分子选用壳聚糖、透明质酸、明胶时,可以交联,也可以不交联;海藻酸盐则用氯化钙进行交联,交联剂浓度为0.5%~10%;
实施例1
1)在调好的浓度为0.9%的500ml丝蛋白溶液中,滴加500ml浓度为0.25mol/L的Ca(OH)2溶液后,继续缓慢加入浓度为0.25mol/L的NaH2PO4溶液300ml,滴加过程中需要不断搅拌并调节pH为13。
2)将上述体系搅拌、静置,除去上清,离心分离出沉淀,用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后,放入冻于机内冷冻干燥,随后将干燥物研磨制得干粉。
3)称取1.0g PLA置于烧瓶中,加入10ml 1,4-二氧六环得到10%的溶液,混合物在常温下搅拌2小时,加入1.0g制得的矿化丝蛋白,然后混合均匀。
4)将混合液倒入模具,冷冻后,置于冷冻干燥机内冷冻干燥。
5)将上述成型材料脱模,将脱模后的材料经过水洗后,加入骨形态发生蛋白2,待材料干燥后,用环氧乙烷蒸气消毒2小时,包装保存。
实施例2
1)在调好的浓度为33%的900ml丝蛋白溶液中,加入50ml浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液后,继续缓慢滴加浓度为0.2mol/L的Na2HPO4溶液50ml,滴加的同时用搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液,直至pH值稳定为7.4。
2)将上述体系搅拌、静置,除去上清,离心分离出沉淀,用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后,放入冻干机内冷冻干燥,随后将干燥物研磨制得干粉。
3)称取1.5g海藻酸钠,加入1.0g制得的矿化丝蛋白,然后混合均匀。
4)将混合液倒入模具,将模具放入5%的氯化钙溶液中交联12小时,然后脱膜,在蒸馏水中浸泡24小时后,在其中加入成纤维细胞生长因子,将样品冷冻干燥。
5)干燥后的样品用Co60消毒,包装保存。
实施例3
1)在调好的浓度为10%的100ml丝蛋白溶液中,加入浓度为2mol/L的KH2PO4溶液500ml,继续缓慢滴加400ml浓度为5mol/L的Ca(NO3)2溶液后,滴加的同时用搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加KOH溶液,直至pH值为8.0。
2)将上述体系搅拌、静置,除去上清,离心分离出沉淀,用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后,放入冻干机内冷冻干燥,随后将干燥物研磨制得干粉。
3)称取1.0g PLGA置与烧瓶中,加入20ml氯仿得到10%的溶液,混合物在常温下搅拌4小时,加入2.0g制得的矿化丝蛋白,然后混合均匀。
4)将混合液倒入模具,在-4℃冷冻后,置于冷冻干燥机内冷冻干燥。
5)将上述成型材料脱模,用Co60消毒,包装保存。
实施例4
1)调好的浓度为25%的900ml丝蛋白溶液中,加入50ml浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液后,继续缓慢滴加浓度为0.2mol/L的NH3H2PO4溶液50ml,滴加的同时用搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液,直至pH值稳定为10.0。
2)将上述体系搅拌、静置,除去上清,离心分离出沉淀,用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后,放入冻干机内冷冻干燥,随后将干燥物研磨制得干粉。
3)称取1.0g PLGA置与烧瓶中,加入10ml二甲基亚砜得到10%的溶液,混合物在常温下搅拌8小时,得到均匀分散的溶液;加入0.5g制得的矿化丝蛋白,然后混合均匀。
4)将混合液倒入模具,在-4℃冷冻后,置于冷冻干燥机内冷冻干燥。
5)将上述成型材料脱模,将脱模后的材料经过水洗后,加入骨形态发生蛋白2,用Co60消毒,包装保存。
实施例5
1)调好的浓度为25%的200ml丝蛋白溶液中,加入浓度为2mol/L的K2HPO4溶液500ml,继续缓慢滴加300ml浓度为5mol/L的Ca(NO3)2溶液后,滴加的同时用搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加KOH溶液,直至pH值为9.0。
2)将上述体系搅拌、静置,除去上清,离心分离出沉淀,用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后,放入冻干机内冷冻干燥,随后将干燥物研磨制得干粉。
3)称取1.5g壳聚糖,用15ml 2%醋酸溶解后,加入1.0g制得的矿化丝蛋白,然后混合均匀。
4)将混合液倒入模具,在pH为12的NaOH溶液中浸泡24小时后,再在蒸馏水中浸泡48小时,冷冻后进行冷冻干燥,脱膜,将脱模后的材料经过水洗后,加入生长激素,将样品冷冻干燥。
5)干燥后的样品用Co60消毒,包装保存。
实施例6
1)在调好的浓度为15%的200ml丝蛋白溶液中,加入500ml浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液后,继续缓慢滴加浓度为0.2mol/L的H3PO4溶液300ml,滴加的同时用搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液,直至pH值达到9.0。
2)将上述体系搅拌、静置,除去上清,离心分离出沉淀,用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后,放入冻干机内冷冻干燥,随后将干燥物研磨制得干粉。
3)称取1.0g透明质酸,加40ml水溶解后,加入5.0g制得的矿化丝蛋白,混合均匀,加入5倍量己二酸二酰肼,混合液倒入模具,交联1小时后,加去离子水并超声清洗0.5小时。
4)加入骨形态发生蛋白和转化生长因子,将样品冷冻干燥。
5)干燥后的样品用Co60消毒,包装保存。
实施例7
1)调好的浓度为30%的200ml丝蛋白溶液中,加入500ml浓度为1mol/L的CaCl2溶液后,继续缓慢滴加浓度为0.7mol/L的NaH2PO4溶液300ml,滴加的同时用搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液,直至pH值达到12.0。
2)将上述体系搅拌、静置,除去上清,离心分离出沉淀,用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后,放入冻干机内冷冻干燥,随后将干燥物研磨制得干粉。
3)称取3.0g明胶,用20ml去离子水60℃溶解后,加入1.0g制得的矿化丝蛋白,得到混合溶液。
4)将混合液倒入模具,用浓度5%的戊二醛进行交联2小时后,将模具置入流动的蒸馏水中浸泡48小时,然后冷冻干燥,脱膜,加入骨形态发生蛋白和转化生长因子,将样品冷冻干燥。
5)干燥后的样品用Co60消毒,包装保存。
实施例8
1)调好的浓度为25%的450ml丝蛋白溶液中,加入25ml浓度为1mol/L的Ca(NO3)2溶液后,继续缓慢滴加浓度为1mol/L的KH2PO4溶液25ml,滴加的同时用磁力搅拌器混合均匀。在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液,直至pH值稳定为8.5。
2)将上述体系搅拌、静置,除去上清,离心分离出沉淀,用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后,放入冻干机内冷冻干燥,随后将干燥物研磨制得干粉。
6)称取3.0g明胶,用20ml去离子水60℃溶解后,加入1.0g制得的矿化丝蛋白,得到混合溶液。
7)将混合液倒入模具,用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺进行交联,交联后将模具置入流动的蒸馏水中浸泡48小时,然后冷冻干燥,脱膜,将样品冷冻干燥。
8)干燥后的样品用Co60消毒,包装保存。
Claims (9)
1、生物矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料,其特征在于,该材料主要含有生物矿化丝素蛋白和高分子材料,所述高分子材料为聚乳酸、乳酸和羟基乙酸的共聚物、海藻酸盐、透明质酸、壳聚糖、明胶或它们的衍生物中的任何一种。
2、根据权利要求1所述的复合多孔材料,其特征在于,所述材料中还可包含一种或多种骨生长因子。
3、根据权利要求1或2所述的复合多孔材料,所述骨生长因子可以为骨形态发生蛋白、转化生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、生长激素中的任何一种或两种以上的组合。
4、制备如权利要求1所述的生物矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料的方法,其特征在于,该方法依次包括以下步骤:
(1)在丝素蛋白溶液中滴加含有钙离子的溶液,使溶液中丝素蛋白的质量百分比浓度最终为0.3%-30%,钙离子的摩尔浓度最终为0.01~2mol/L,滴加过程中需要不断搅拌;在搅拌状态下继续向溶液按摩尔比Ca∶P=1~2∶1的量滴加加入磷酸根离子,最后调节至pH值为7.4~12;
(2)将上述溶液搅拌后静置,待沉淀与上清分层后,除去上清,离心分离出沉淀,用去离子水反复洗涤至中性,将沉淀放入冻干机内冷冻干燥,待干燥后研磨成粉;
(3)用溶剂溶解高分子,然后将上述步骤(2)中制备的干粉分散在高分子溶液中,得到混合溶液;
(4)将混合溶液倒入模具,处理后冷冻干燥;
(5)将上述步骤(4)中的成型材料脱模,将脱模后的材料经过水洗后,加入一种或多种生长因子,待材料干燥后用环氧乙烷蒸气消毒2~4小时,或用Co60辐照消毒,包装保存,即得矿化丝蛋白/高分子复合多孔材料。
5、根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,在所述步骤(3)中,当选用的高分子为聚乳酸、乳酸和羟基乙酸的共聚物时,溶剂选用1,4-二氧六环、氯仿或二甲基亚砜中的任何一种。
6、根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,在所述步骤(3)中,当选用的高分子为海藻酸钠、透明质酸、明胶时,选用水做溶剂。
7、根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,在所述步骤(3)中,当选用的高分子为壳聚糖时,选用稀酸溶液作为溶剂。
8、根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,在所述步骤(4)中,当高分子选用壳聚糖、透明质酸、明胶时,可以交联,也可以不交联;选用的交联剂为甲醛、乙二醛、戊二醛、己二酸二酰肼、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺或其混合物。
9、根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,在所述步骤(4)中,当高分子选用海藻酸盐时,用氯化钙作交联剂。
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