CN1241654C - 矿化丝蛋白材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种矿化丝蛋白材料及其制备方法，属于生物医用材料领域。本发明提出的矿化丝蛋白材料中含有机成分和矿物质，所述有机成分为脱胶丝蛋白，所述矿物质为钙磷盐晶体。所述材料的制备方法是首先制备水溶性的脱胶丝蛋白，搅拌状态下向此溶液中加入含钙离子溶液，随后缓慢注入含磷酸根离子的溶液，调节反应体系pH值，维持搅拌一定时间后将体系静置，离心、洗涤，重复此过程使洗脱液至中性，将分离的沉淀真空干燥，即可制得矿化丝蛋白材料。该材料生物相容性好，可诱导骨生长，低成本，其钙磷盐晶体尺寸在纳米量级。

Description

矿化丝蛋白材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种矿化丝蛋白材料及其制备方法，尤其是涉及一种可用于骨修复的矿化丝蛋白材料及其制备方法，属于生物医用材料领域。
背景技术
许多昆虫如家蚕、柞蚕等及许多种类的蜘蛛都能够生产大量丝蛋白。丝蛋白除了被用于传统的纺织原料外，在化妆品、食品、制药、化工、新材料等领域正被不断得到开发和利用。随着分子生物学和生物技术的进步，研究人员能够从分子水平上对丝蛋白进行研究，通过转基因方法经济、高效的生产丝蛋白成为许多科学家共同的奋斗目标。目前，对蚕丝和蜘蛛丝蛋白的转基因研究获得了长足进步，已经基本认识到不同丝蛋白的结构组成规律，性质和功能上的巨大差异，认识到丝蛋白从基因控制到自组装原理进行液晶纺丝，涉及了材料科学、生物物理学和分子生物学等众领域的科学知识，丝蛋白也成为研究分级结构和蛋白质材料的实用模型(David J.Kaplan，Spiderless spider webs.Nature Biotechnology，2002，20：239-240)。
丝蛋白是主要是由丝素和丝胶两种蛋白构成。丝胶蛋白具有较差的生物相容性，以及引发超敏反应。将丝蛋白在低浓度碳酸钠、氢氧化钠等溶液中水煮的方法将其和丝素蛋白分离，也可以在所述溶液中加入表面活性剂以去除丝蛋白中含有的少量蜡质。丝素蛋白则具有良好的生物相容性，同时还具有其它独特的优异性能，如可降解性、较高的机械强度、易加工性能等，这使它在生物医用材料领域的研究也引起了广泛的关注。迄今为止，丝素蛋白已经被用于固定化酶的载体、药物缓释载体、隐形眼镜、人工肌腱与韧带、人工皮肤、抗凝血材料等，部分研究成果已经进入临床应用。所以本发明中所用的丝蛋白材料为脱胶以后获得的丝素蛋白。
目前临床骨修复所用到的自体骨和异体骨存在来源短缺、免疫排斥和感染疾病的危险。生物骨组织的主要成分是胶原蛋白和羟基磷灰石。纯的羟基磷灰石具有优异的生物相容性、骨传导性和生物活性，已被广泛用于整形外科手术和齿科手术。但是纯的羟基磷灰石脆性大，韧性差，并且易从植入部位脱落，在临床上限制了它的使用。崔福斋等(纳米相钙磷盐/胶原/聚乳酸骨复合多孔材料的制备方法，申请号00107493.8，公开号CN 1272383A，授权)用仿生方法使胶原蛋白来改善羟基磷灰石的性质，取得了较好的医疗效果。但由于所用胶原蛋白提纯工艺复杂，成本高；由于目前所用胶原蛋白主要来源于动物，存在一定的安全性问题；目前基因工程法生产的重组人胶原蛋白已经问世，但其医用安全性、适用效果尚待检验。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于骨修复的丝蛋白/钙磷盐复合材料，该材料生物相容性好，可诱导骨生长，同时还有价格便宜的特点。
发明的另一目的是提供一种丝蛋白/钙磷盐复合材料的制备方法。
本发明提出的一种矿化丝蛋白材料，其特征在于：该材料中含有机成分和矿物质，所述有机成分为脱胶丝蛋白，所述矿物质为钙磷盐晶体。
在上述矿化丝蛋白材料中，所述材料中的丝蛋白来自昆虫丝、蜘蛛丝或转基因丝。
在上述矿化丝蛋白材料中，所述昆虫丝为家蚕丝、野蚕丝、柞蚕丝、天蚕丝、蓖麻蚕丝、樗蚕丝或蓑袋蛾昆虫丝。
在上述矿化丝蛋白材料中，所述丝蛋白为水溶性丝素蛋白。
在上述矿化丝蛋白材料中，所述钙磷盐晶体包含羟基磷灰石。
本发明提出的一种矿化丝蛋白材料的制备方法，其特征在于：所述方法依次包括下列步骤：
(1)在丝蛋白溶液中滴加含有钙离子的溶液，使溶液中丝蛋白的质量百分比浓度最终为0.3％-30％，钙离子的摩尔浓度最终为0.01～2mol/L，滴加过程中需要不断搅拌；
(2)在步骤(1)的溶液中边搅拌边缓慢滴加含有磷酸根离子的水溶液，加入的磷酸根离子与钙离子的摩尔比为Ca∶P＝1～2∶1；
(3)在步骤(2)的溶液中边搅拌边调节pH值为7.4～10.0；
(4)将上述溶液搅拌后静置，待沉淀与上清分层后，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉可溶性盐分，使洗涤液呈中性；
(5)将沉淀物放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨，即得矿化丝蛋白材料。
在上述制备方法中，所述步骤(1)、(2)中，先加入磷酸根离子，再加入钙离子。
本发明所制备的复合材料中的钙磷盐的成分主要是骨矿的主要成分羟基磷灰石，尺寸达到纳米量级，所制备的复合材料具有较好的生物相容性和生物活性。
附图说明
图1为本发明丝蛋白/钙磷盐复合材料的XRD图，其中a：商品化的羟基磷灰石；b：矿化丝蛋白材料。
图2为本发明丝蛋白/钙磷盐复合材料的FT-IR，其中图a：丝素蛋白；b：矿化丝蛋白材料；c：商品化的羟基磷灰石。
图3为本发明丝蛋白/钙磷盐复合材料的SEM图。
图4为本发明丝蛋白/钙磷盐复合材料的SEM图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明：
本发明中所用的丝蛋白来源可以为昆虫丝、蜘蛛丝或转基因丝，昆虫丝可以为家蚕、野蚕、柞蚕、天蚕、蓖麻蚕、樗蚕、蓑袋蛾昆虫丝等，使用前要将丝中的丝胶蛋白脱除，发明中优选家蚕丝和柞蚕丝。将脱胶的家蚕丝素蛋白溶于沸腾的质量浓度为40-50％的氯化钙溶液中或者将脱胶的柞蚕丝溶解于120℃的6-8mol/L的硝酸钙，都可以使丝素蛋白溶解，然后将溶解的丝素蛋白经过脱盐、浓缩处理。本发明所用的丝蛋白即经脱胶处理后的丝素蛋白。
本发明中所用的含磷酸根离子的溶液为磷酸和磷酸盐，所用的磷酸盐可以为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二氨、磷酸二氢氨；所用的含钙离子的溶液可以为氢氧化钙和钙盐，钙盐可以为硝酸钙、氯化钙；所用的碱液可以为碱金属氢氧化物或氢氧化铵，试验中一般选用氢氧化钠。所用试剂均为分析纯。
本发明提出的矿化丝蛋白材料的制备方法主要包括下列步骤：
(1)在丝蛋白溶液中滴加含有钙离子的溶液，使溶液中丝蛋白的质量百分比浓度最终为0.3％-20％，钙离子的摩尔浓度最终为0.01～2mol/L，滴加过程中需要不断搅拌；
(2)上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加含有磷酸根离子的水溶液，加入的磷酸根离子的量与加入的钙离子的量的摩尔比为Ca∶P＝1～2∶1；
(3)在上述第二步的溶液中边搅拌边缓慢调节pH值为7.4～10.0，
(4)将溶液搅拌后静置，待沉淀与上清分层后，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉可溶性盐分，并洗涤至中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉，即为骨修复材料。
实施例1
1)在调好的浓度为0.9％的500ml丝蛋白溶液中，滴加500ml浓度为0.25mol/L的Ca(0H)2溶液后，继续缓慢加入浓度为0.25mol/L的NaH2PO4溶液300ml，滴加的同时用磁力搅拌器混合均匀。
2)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。
实施例2
1)在调好的浓度为33％的450ml丝蛋白溶液中，加入25ml浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液后，继续缓慢滴加浓度为0.2mol/L的Na2HPO4溶液25ml，滴加的同时用磁力搅拌器混合均匀。
2)在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值稳定为7.4。
3)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。
实施例3
1)在调好的浓度为10％的100ml丝蛋白溶液中，加入浓度为2mol/L的KH2PO4溶液500ml，继续缓慢滴加400ml浓度为5mol/L的Ca(NO3)2溶液后，滴加的同时用磁力搅拌器混合均匀。
2)在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加KOH溶液，直至pH值为8.0。
3)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。
实施例4
1)在调好的浓度为25％的450ml丝蛋白溶液中，加入25ml浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液后，继续缓慢滴加浓度为0.2mol/L的NH3H2PO4溶液25ml，滴加的同时用磁力搅拌器混合均匀。
2)在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值稳定为10.0。
3)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。
实施例5
1)调好的浓度为25％的200ml丝蛋白溶液中，加入浓度为2mol/L的K2HPO4溶液500ml，继续缓慢滴加300ml浓度为5mol/L的Ca(NO3)2溶液后，滴加的同时用磁力搅拌器混合均匀。
2)在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加KOH溶液，直至pH值为9.0。
3)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。
实施例6
1)在调好的浓度为15％的200ml丝蛋白溶液中，加入500ml浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液后，继续缓慢滴加浓度为0.2mol/L的H3PO4溶液300ml，滴加的同时用磁力搅拌器混合均匀。
2)在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值达到8.5。
3)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。
实施例7
1)调好的浓度为30％的200ml丝蛋白溶液中，加入500ml浓度为1mol/L的CaCl2溶液后，继续缓慢滴加浓度为0.7mol/L的NaH2PO4溶液300ml，滴加的同时用磁力搅拌器混合均匀。
2)在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值达到9.0。
3)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。
实施例8
1)在调好的浓度为25％的450ml丝蛋白溶液中，加入25ml浓度为1mol/L的Ca(NO3)2溶液后，继续缓慢滴加浓度为1mol/L的KH2PO4溶液25ml，滴加的同时用磁力搅拌器混合均匀。
2)在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值稳定为9.5。
3)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。

Claims (7)

1、一种矿化丝蛋白材料，其特征在于：该材料中含有机成分和矿物质，所述有机成分为脱胶丝蛋白，所述矿物质为钙磷盐晶体。
2、根据权利要求1所述的矿化丝蛋白材料，其特征在于：所述材料中的丝蛋白来自昆虫丝、蜘蛛丝或转基因丝。
3、根据权利要求2所述的矿化丝蛋白材料，其特征在于：所述昆虫丝为家蚕丝、野蚕丝、柞蚕丝、天蚕丝、蓖麻蚕丝、樗蚕丝或蓑袋蛾昆虫丝。
4、根据权利要求1或2所述的矿化丝蛋白材料，其特征在于：所述丝蛋白为水溶性丝素蛋白。
5、根据权利要求1所述的矿化丝蛋白材料，其特征在于：所述钙磷盐晶体包含羟基磷灰石。
6、一种制备如权利要求1所述的矿化丝蛋白材料的方法，其特征在于：所述方法依次包括下列步骤：
(1)在丝蛋白溶液中滴加含有钙离子的溶液，使溶液中丝蛋白的质量百分比浓度最终为0.3％-30％，钙离子的摩尔浓度最终为0.01～2mol/L，滴加过程中需要不断搅拌；
(2)在步骤(1)的溶液中边搅拌边缓慢滴加含有磷酸根离子的水溶液，加入的磷酸根离子与钙离子的摩尔比为Ca∶P＝1～2∶1；
(3)在步骤(2)的溶液中边搅拌边调节pH值为7.4～10.0；
(4)将上述溶液搅拌后静置，待沉淀与上清分层后，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉可溶性盐分，使洗涤液呈中性；
(5)将沉淀物放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨，即得矿化丝蛋白材料。
7、根据权利要求6所述的矿化丝蛋白材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)、(2)中，向丝蛋白溶液离子滴加顺序可以改变为先加入磷酸根离子，再加入钙离子。
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