CN104225667A

CN104225667A - 一种促血管生成的温敏性水凝胶粉及用其制备的温敏性水凝胶

Info

Publication number: CN104225667A
Application number: CN201410496074.9A
Authority: CN
Inventors: 罗静聪; 晁宁宁; 解慧琪
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: Hangzhou Beirong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2014-09-24
Filing date: 2014-09-24
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2034-09-24
Also published as: CN104225667B

Abstract

本发明公开了一种促血管生成的温敏性水凝胶制备方法，它是以本发明温敏性水凝胶粉为原料，在冰浴条件下加入预冷的PBS溶液、蒸馏水或DMEM培养基中，二者的比例为30mg：1ml，搅拌均匀后，置于37℃下，即得。本发明还公开了一种新的温敏性水凝胶粉及其制备方法。本发明温敏性水凝胶粉可以长期室温存放，灭菌方法简单，方便大规模生产和投入市场使用，由其制备的温敏性水凝胶具有良好的温敏特性、生物相容性，在体内可降解，具有促进血管化的作用，在再生医学及临床治疗中应用前景良好。

Description

一种促血管生成的温敏性水凝胶粉及用其制备的温敏性水凝胶

技术领域

本发明涉及一种温敏性水凝胶粉及用其制备的温敏性水凝胶，属于生物材料领域。

背景技术

水凝胶(Hydrogel)是以水为分散介质的凝胶，具有接近正常组织的含水量及良好的生物相容性，理化性质可控，具有多孔结构，其立体多孔结构跟细胞外基质很相似，有利于细胞生长增殖分化，也有利于生物活性因子活性的保持，可微创植入，在组织工程中具有广泛应用前景。

温敏性水凝胶可在体温范围内从液态转变为凝胶态，不需其他催化剂及剧烈的反应条件，能修复各种不规则形状的组织缺损，能将细胞或者活性物质均匀的分布在缺损部位，促进细胞生长、胞外基质的分泌和组织的自我修复，在组织工程应用中具有突出的优势。

细胞外基质凝胶制备方法包括尿素抽提法和酶(通常为胃蛋白酶)消化法。尿素抽提法在尿素抽提之前，通常用酶(如中性酶)处理新鲜组织块以去除组织中的细胞成分，然后加入蛋白酶抑制剂匀浆，离心去上清，重悬于尿素缓冲液中，过夜处理，离心去上清，将pH值由7.4降为4.0或在37℃孵育，均可形成凝胶，但是pH诱导凝胶化要比温度诱导凝胶化迅速。酶消化法一般是用胃蛋白酶在盐酸(0.1N或者0.01N)酸性条件下消化ECM或dECM干粉末，使其成无可见微粒的均一粘稠的液状物体，然后于冰上加等摩尔量的NaOH碱液中和，然后加九分之一的10×PBS，即成液态的原凝胶(pre-gel)，37℃孵育后形成固态的凝胶(gel)。酶消化法相比尿素抽提法，省去了纯化步骤，避免对细胞外基质成分过多的损失，是目前应用比较多的制备细胞外基质水凝胶的方法。

现有的细胞外基质制备技术，是以细胞外基质制备成碱液中和前的酸性消化液作为成品，临用前，将酸性消化液与碱液中和使用，如市售I型胶原温敏凝胶成品即为鼠尾I型胶原醋酸溶液。然而，因消化液为液体，保存困难，必须-20℃存放，在4℃仅可保存两个月，储存条件苛刻，运输成本高，难以大规模生产和投入市场大量使用。另外，因为消化液为液体形式，较为粘稠，因此其灭菌困难，通常采用有机溶剂进行灭菌。如制备猪、人去细胞的温敏凝胶，将中合后的溶液对氯仿透析过夜，然后透析去除氯仿，灭菌过程费时费力【Poon,C.J.；Pereira,E.C.M.；Sinha,S.,et al.Preparation of an adipogenic hydrogel from subcutaneous adipose tissue.Acta Biomater,2013,9(3): 5609-5620】。

需要提供一种新的制备水凝胶的方法，克服前述消化液存放难，灭菌难的问题。

人胎盘富含细胞外基质及基底膜，通常于产妇分娩后丢弃，易于获得对供体无损伤。胎盘含有丰富的各种生物学成分，包括激素、细胞因子、趋化因子及生长因子(如肝细胞生长因子、表皮生长因子、TGF-α、TGF-β等)，这些因子大多以自分泌或旁分泌形式发挥作用，调节其他生物活性物质的产生，已有研究表明胎盘提取物刺激组织修复过程，可能具有治疗潜力。胎盘被用于促进伤口愈合，补充生命体质，协助治疗皮肤癣、类风湿关节炎及其他疾病。人胎盘提取物含有丰富的活性生物因子。水溶性人胎盘提取物在许多国家被批准术后敷料、烧伤及慢性溃疡，甚至被批准用于肝病治疗。但其确切机制尚未完全阐明。动物实验表明：人胎盘提取物通过降低肝纤维化，诱导肝再生，调节炎性反应，从而可能用于治疗肝脏疾病。2006年Tae-beom SEO等报道人胎盘提取物通过上调神经再生相关蛋白如轴突生长相关蛋白GAP-43和细胞骨架相关蛋白Cdc2而促进SD大鼠坐骨神经损伤的轴突再生。

将胎盘脱细胞并作为生物材料的研究极少。2002年，美国华盛顿大学修复外科Richard A.Hopper和加拿大多伦多大学化学工程及应用化学系K.Woodhouse等报道采用灌注方法对新鲜人胎盘进行了脱细胞处理。2006年-2009年，加拿大多伦多大学Lauren Flynn等报道人胎盘脱细胞基质能促进前体脂肪细胞的黏附。其进一步研究表明：将脱细胞人胎盘基质与透明质酸构建复合材料促进人脂肪干细胞向脂肪细胞分化。动物实验结果表明单纯胎盘脱细胞基质、透明质酸及其复合支架材料均促进脂肪组织再生，胎盘脱细胞基质有助于维持其植入后体积。Ji Suk Choi等将冷冻干燥的脱细胞人胎盘海绵用于治疗大鼠全层皮肤缺损，结果表明该材料可促进血管内皮细胞、角质细胞的迁移及血管化，进而促进创面修复。上述研究均采用新鲜人胎盘作为原料，但临床使用的胎盘均需要进行系列血清学检测以排除疾病传染的风险，在此过程中，胎盘需冷冻保存。国内外均无冷冻后人胎盘脱细胞用于制备水凝胶的研究。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种可以在室温长期保存的温敏性水凝胶粉及用其制备的温敏性水凝胶。

本发明温敏性水凝胶粉，它由如下方法制备：

(1)取去羊膜胎盘，清洗，脱细胞处理，得脱细胞胎盘，冻干，粉碎，得脱细胞胎盘粉；

(2)将脱细胞胎盘粉与胃蛋白酶酸溶液按(10mg～30mg)：1ml的比例混合，所述胃蛋白酶酸溶液是胃蛋白酶醋酸溶液或胃蛋白酶盐酸溶液，其中，胃蛋白酶浓度为1mg/ml，醋酸浓度为3％(v/v)，盐酸浓度0.01-0.5mol/L，，室温搅拌，得均一粘稠的液状物体；

(3)在冰浴下，加入强碱溶液至pH 6.5-7.2，冻干，即可。

室温：25℃±5℃。

步骤(1)中，所述脱细胞处理的步骤如下：

a、将胎盘用0.5～1％(w/v)SDS溶液浸泡8-15h，用去离子水洗净；

b、0.1％(v/v)的过氧乙酸和20％(v/v)乙醇混合溶液处理30min，用去离子水洗净，即可。

步骤a中，所述SDS溶液的浓度为0.5％(w/v)；所述SDS溶液为含有SDS的生理盐水溶液；所述浸泡为震荡浸泡，震荡的频率为100rpm；所述浸泡的时间为8h。

步骤(1)中，所述脱细胞胎盘粉的粒径不大于60目。

步骤(1)和步骤(4)中，所述冻干的温度为-50℃～-80℃，真空度为0.1mbar～0.2mbar，时间为24h～48h。优选地，所述冻干的温度为-80℃，真空度为0.12mbar，时间为24h。

步骤(2)中，所述脱细胞胎盘粉与胃蛋白酶酸溶液按20mg：1ml的比例混合；所述胃蛋白酶酸溶液中，酸为0.1mol/L的盐酸；所述搅拌的时间为48h；所述搅拌的频率为100-300rpm。

步骤(3)中，所述强碱溶液为氢氧化钠溶液，优选其浓度为1mol/L。

本发明制备温敏性水凝胶粉的方法，它包括如下步骤：

(2)将脱细胞胎盘粉与胃蛋白酶酸溶液按(10mg～30mg)：1ml的比例混合所述胃蛋白酶酸溶液是胃蛋白酶醋酸溶液或胃蛋白酶盐酸溶液，其中，胃蛋白酶浓度为1mg/ml，醋酸浓度为3％(v/v)，盐酸浓度0.01-0.5mol/L，室温搅拌，得均一粘稠的液状物体；

(3)在冰浴下，加入强碱溶液至pH 6.5-7.2，冻干，即可。

步骤(1)中，所述脱细胞处理的步骤如下：

a、将胎盘用0.5～1％(w/v)SDS溶液浸泡8-15h，去离子水洗净；

b、0.1％(v/v)的过氧乙酸和20％(v/v)乙醇混合溶液处理30min，去离子水洗净，即可。

步骤(1)中，所述脱细胞胎盘粉的粒径不大于60目。

本发明温敏性水凝胶，其特征在于：它是由前述的温敏性凝胶粉制备而成，制备方法为：称前述的温敏性凝胶粉，在冰浴条件下加入预冷的PBS溶液、蒸馏水或DMEM培养基中，二者的比例为30mg：1ml，搅拌均匀后，置于37℃下，即得。

预冷是指在操作前先将温度控制到一定范围。本发明预冷是冰浴预冷。

本发明制备温敏性水凝胶的方法，步骤如下：称取前述的温敏性凝胶粉，在冰浴条件下加入预冷的PBS溶液、蒸馏水或DMEM培养基中，二者的比例为二者的比例为30mg：1ml，搅拌均匀后，置于37℃条件下，即可形成温敏性凝胶。

为了克服消化液存放难，灭菌难的问题。发明人对凝胶做了大量研究，发现采用目前常用的细胞外基质，如，水不溶牛跟腱I型胶原，制备温敏性凝胶时，将原凝胶进行冷冻干燥后，难以复溶得温敏性水凝胶。

然而，本发明采用羊膜胎盘作为原料制备温敏性凝胶时，将原凝胶进行冷冻干燥得到温敏性水凝胶粉后，可以复溶得温敏性水凝胶。因此，本发明制备温敏性水凝胶的方法，以温敏性水凝胶粉为成品。

本发明水凝胶粉为固体颗粒，可以长期室温存放，所占体积小，方便大规模生产和投入市场使用，也可以采用环氧乙烷或辐照灭菌，对生产制备的环境要求低，操作简便，成本低廉，制备得到的温敏性凝胶具有良好的温敏特性、生物相容性，在体内可降解，具有促进血管化的作用，工业应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1脱细胞效果的组织学评价。A、B：H&E染色，标尺为200μm；C、D：DAPI染色，标尺为100μm；A、C：正常胎盘组织；B、D：脱细胞胎盘组织。

图2 dsDNA定量检测结果(n＝6)。P为正常胎盘基质，DPM为脱细胞胎盘基质，D-gel为胎盘来源水凝胶。*表示P<0.05，两者比较，差异具有统计学意义。

图3鼠尾I型胶原凝胶和胎盘来源凝胶成胶。A，B为I型胶原水凝胶；C、D为胎盘来源水凝胶。

图4D-gel的微观结构(SEM)。A：D-gel形成凝胶后的大体图片；B、C：D-gel凝胶的微观结构，标尺分别为1mm和200μm。

图5傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图谱。

图6胎盘来源水凝胶的相变温度。

图7不同浓度胎盘源性水凝胶的溶胀率，无统计学差异(p>0.05，n＝4)

图8死活细胞染色(第1天)。A、B和C分别为HUVEC表面接种于胎盘水凝胶、I型胶原水凝胶和孔板表面，放大倍数为200×。D、E和F分别为A、B、C的局部放大效果图。

图9死活细胞染色(第3天)。A、B和C分别为HUVEC表面接种于胎盘水凝胶、I型胶原水凝胶和孔板表面，放大倍数为200×。D、E和F分别为A、B、C的局部放大效果图。

图10死活细胞染色(第9天)。A、B和C分别为HUVEC表面接种于胎盘水凝胶、I型胶原水凝胶和孔板表面，放大倍数为200×。D、E和F

分别为A、B、C的局部放大效果图。

图11死活细胞染色(NIH 3T3成纤维细胞)。A、C和为细胞接种于胎盘水凝胶表面，B、D和F为细胞接种于I型胶原水凝胶面；A和B、C和D、E和F分别为接种后1天、3天和5天行死活细胞染色并用荧光显微镜采图。放大倍数为200×。

图12死活细胞染色(SD大鼠BMSC)。A、C和为细胞接种于胎盘水凝胶表面，B、D和F为细胞接种于I型胶原水凝胶面；A和B、C和D、E和F分别为接种后1天、3天和5天行死活细胞染色并用荧光显微镜采图。放大倍数为100×。

图13细胞毒性实验，各时间点组间无统计学差异(p>0.05，n＝5)

图14胎盘来源水凝胶和鼠尾I型胶原水凝胶植入大鼠皮下H&E染色。A、C和E为胎盘水凝胶植入1周、2周和4周；B、D和F为I型胶原水凝胶植入1周、2周和4周。放大倍数为400X。

图15 7胎盘来源水凝胶和鼠尾I型胶原水凝胶植入大鼠皮下日本Masson染色。A、C和E为胎盘水凝胶植入1周、2周和4周；B、D和F为I型胶原水凝胶植入1周、2周和4周。放大倍数为200X。

图16胎盘来源水凝胶和鼠尾I型胶原水凝胶植入大鼠皮下CD68免疫组化染色。A、C和E为胎盘水凝胶植入1周、2周和4周；B、D和F为I型胶原水凝胶植入1周、2周和4周。放大倍数为400X。

图17 HUVEC在D-gel和C-gel两种材料上的成管情况。镜下观察，A和C：D-gel，B和D：C-gel；A和B：12h，C和D：24h；放大倍数为100X。

图18对24h时管腔数目进行计数分析，在胎盘源性水凝胶上的血管个数显著高于I型胶原水凝胶上的(n＝6，*表示p<0.05，差异具有统计学意义)。

图19胎盘源性水凝胶和I型胶原水凝胶三维培养大鼠主动脉环实验。

图20 D-gel和C-gel大鼠皮下植入3天、7天行CD31免疫组化染色。两种材料上的成管情况。镜下观察，A和C：胎盘源性水凝胶，B和D：I型胶原水凝胶；A和B：3天，C和D：7天；放大倍数为400X。对CD31阳性血管进行计数分析，(n＝5，*表示p<0.05，差异具有统计学意义)。

具体实施方式

实验材料、试剂与仪器：

1、试剂

DMEM培养基(GIBCO公司，美国)；

胎牛血清(GIBCO公司，美国)

Quant-iTTMPicoGreends DNA Assay Kit(Invitrogen公司，美国)

Ⅰ型胶原酶(GIBCO公司，美国)

胃蛋白酶(Sigma公司，美国)

钙黄绿素(Sigma公司，美国)

PI(Sigma公司，美国)

DAPI(Vector公司，美国)

Ⅰ型胶原水凝胶(Advanced BioMatrix公司，美国)

十二烷基磺酸钠(Sigma公司，美国)

CD68抗体(Abcam，美国)

CD31抗体(Abcam，美国)

EBM-2培养基(Lonza公司，瑞士)

2、仪器

低温球磨仪

扫描电镜(日立S-520,日本)

石蜡组织切片机(Leica公司，德国)

微型台式离心机(SANYO公司,日本)

显微镜(Nikon公司，日本)

CO2细胞培养箱(SANYO公司，日本)

超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司，中国)

倒置相差显微镜(Olympus公司，日本)

荧光显微镜(Olympus公司，日本)

激光共聚焦显微镜(Nikon公司，日本)

冷冻干燥机(Christ公司，德国)

红外光谱仪(Thermo公司，美国)

流变仪(Thermo，RS6000，美国)

荧光酶标仪(Leica公司，德国)

3、实验动物

实验动物：SPF清洁级雄性SD大鼠，2月龄，体重250～300g，购自成都达硕生物科技有限公司；上述动物由持国家一级动物饲养许可证的四川大学华西医学实验动物中心饲养。

实施例1本发明温敏性水凝胶粉的制备

1、人胎盘脱细胞处理

(1)取正常分娩、经过血清学检测、去除羊膜的人胎盘(新鲜或者冷冻的)，-40℃以下预冻，切成约1mm厚度的薄片(约2cm×2cm)，大量生理盐水冲洗至溶液无血红色；

(2)用0.5％SDS生理盐水溶液震荡浸泡8h(中间换液4次)，去离子水冲洗干净；

(3)0.1％过氧乙酸和20％乙醇混合溶液处理30分钟后，去离子水冲洗干净；

(4)冻干(冻干的温度为-80℃，真空度为0.12mbar，时间为24h)，即得脱细胞人胎盘组织，即DPM。

将上步处理得到的材料密封保存。

2、本发明温敏性水凝胶粉的制备

(1)将前述DPM低温球磨为微粉，并用60目筛子去除大颗粒；

(2)将DPM微粉与胃蛋白酶酸溶液(胃蛋白酶1mg/ml，0.1mol/L盐酸)按20mg：1ml混合，室温搅拌48h使其成无可见微粒的均一粘稠的液状物体(搅拌的频率为100rpm)；

(3)于冰浴下加入1mol/L NaOH溶液中和至pH为6.5-7.2，冻干(冻干的温度为-80℃，真空度为0.12mbar，时间为24h)，即得到温敏性水凝胶粉。

实施例2本发明温敏性水凝胶粉的制备

1、人胎盘脱细胞处理

(2)用1％SDS生理盐水溶液震荡浸泡8h(中间换液4次，震荡的频率为100rpm)，去离子水冲洗干净；

(4)冻干(冻干的温度为-50℃，真空度为0.1mbar，时间为48h)，即得脱细胞人胎盘组织，即DPM。

将上步处理得到的材料密封保存。

2、本发明温敏性水凝胶粉的制备

(1)将前述DPM低温球磨为微粉，并用60目筛子去除大颗粒；

(2)将DPM微粉与胃蛋白酶酸溶液(胃蛋白酶1mg/ml，0.01mol/L盐酸)按10mg：1ml混合，室温搅拌48h使其成无可见微粒的均一粘稠的液状物体(搅拌的频率为200rpm)；

(3)于冰浴下加入1mol/L NaOH溶液中和至pH为6.5-7.2，冻干(冻干的温度为-50℃，真空度为0.1mbar，时间为48h)，即得到温敏性水凝胶粉。

实施例3本发明温敏性水凝胶粉的制备

1、人胎盘脱细胞处理

(2)用0.5％SDS生理盐水溶液震荡浸泡15h(中间换液4次，震荡的频率为100rpm)，去离子水冲洗干净；

(4)冻干(冻干的温度为-60℃，真空度为0.2mbar，时间为36h)，即得脱细胞人胎盘组织，即DPM。

将上步处理得到的材料密封保存。

2、本发明温敏性水凝胶粉的制备

(1)将前述DPM低温球磨为微粉，并用60目筛子去除大颗粒；

(2)将DPM微粉与胃蛋白酶酸溶液(胃蛋白酶1mg/ml，0.5mol/L盐酸) 按30mg：1ml混合，室温搅拌48h使其成无可见微粒的均一粘稠的液状物体(搅拌的频率为300rpm)；

(3)于冰浴下加入1mol/L NaOH溶液中和至pH为6.5-7.2，冻干(冻干的温度为-60℃，真空度为0.2mbar，时间为36h)，即得到温敏性水凝胶粉。

实施例4本发明温敏性水凝胶粉的制备

1、人胎盘脱细胞处理

(2)用0.8％SDS生理盐水溶液震荡浸泡12h(中间换液4次，震荡的频率为100rpm)，去离子水冲洗干净；

将上步处理得到的材料密封保存。

2、本发明温敏性水凝胶粉的制备

(1)将前述DPM低温球磨为微粉，并用60目筛子去除大颗粒；

(2)将DPM微粉与胃蛋白酶酸溶液(胃蛋白酶1mg/ml，3％的醋酸)按20mg：1ml混合，室温搅拌48h使其成无可见微粒的均一粘稠的液状物体(搅拌的频率为100rpm)；

实施例5本发明温敏性水凝胶的制备

称取前述任意一个实施例(实施例1～4)制备的温敏性水凝胶粉30mg，在冰浴条件下加入1ml预冷的无菌PBS，搅拌均匀后置于37℃恒温孵箱中形成凝胶，即得温敏性水凝胶。

以下通过实验例的方式说明本发明优点：

实验例1本发明温敏性水凝胶的性质检测

一、检测方法

1、脱细胞胎盘组织检测

1.1组织学观察

1.1.1组织包埋切片

(1)取未经过脱细胞处理的胎盘和经过实施例1脱细胞处理的胎盘组织，4％多聚甲醛固定48小时，流水冲洗过夜；

(2)梯度酒精脱水：80％酒精、90％酒精、95％酒精和100％酒精各4h；

(3)ETC透明过夜，I蜡、II蜡、III蜡各浸润1h；

(4)石蜡包埋；

(5)常规组织切片(4-6μm)

1.1.2H&E染色

将上步的常规石蜡切片37℃烘烤恒长，染色前于65℃烘烤2h以上；

脱蜡：ETC脱蜡I和II分别浸泡10min；

梯度酒精复水：100％酒精5min，95％酒精，90％酒精，80％酒精各2min，流水冲洗；

苏木素染15min，流水洗3次；

盐酸分色10s，流水洗3次；

氨水促蓝1min，流水洗3次

过75％酒精，伊红染4min，流水洗3次；

烤干，ETC透明I、II各5min；

中性树胶封片，采图。

1.1.3DAPI染色

常规石蜡切片按前面H&E染色的方法脱蜡复水后：

配置DAPI染液(0.1μg/ml，PBS配制)，注意避光；

每张切片加50μl染液，均匀覆盖组织即可；

5min后采图。

1.2DNA定量检测

样品中DNA的提取纯化：

将6个不同的胎盘，分别取其未经处理的组织、脱细胞组织、经过胃蛋白酶消化处理的pre-gel粉末，球磨，各称取10mg左右；

100μg/ml蛋白酶K 60℃消化48h；

10000g 4℃离心10min，取上清液；

加入等体积的苯酚-氯仿(V:V＝1:1)，上下震荡10min，10000g离心30min，取上层液体；

加入十分之一上清液体积的3mol/L醋酸钠，2.5倍体积的无水乙醇，4℃静置过夜沉淀DNA；

10000g离心10min，弃去上清，挥干液体，即得待测DNA样品。

采用Quant-iT^TMPicoGreendsDNA Assay Kit进行检测DNA的含量，具体方法是：

配制样本稀释液：取2ml 20xTE加入38ml双蒸水，混匀得40ml 1xTE；PicoGreen试剂：取100μl Reagent，加入19.9ml稀释液混匀后避光；

配制标准品：取30μl DNA标准品，加入1470μl 1xTE得2μg/ml的DNA标准品溶液，依次用1xTE稀释得以下浓度的DNA标准品：

高浓度组：2000ng/ml、200ng/ml、20ng/ml、2ng/ml、0ng/ml各1000μl；

低浓度组：100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0ng/ml各1000μl；

检测OD值。加入50μl样品或者上述系列DNA标准品(设3个复孔)，并加入50μl PicoGreen试剂，震荡均匀。散射波长为485nm，放射波长为538nm，于荧光酶标仪上检测OD值；

计算样本浓度。根据标准品浓度和对应的OD值，分别作出高浓度和低浓度标准曲线，结合各样本的OD值计算样本浓度。

2、本发明水凝胶的检测

胎盘水凝胶的制备方法：按照实施例1的方法制备水凝胶粉，分装并经环氧乙烷消毒灭菌备用；按照实施例5的方法，将步骤(1)的水凝胶粉制成水凝胶(后称胎盘水凝胶，D-gel)。

2.1理化性质

2.1.1扫描电镜观察(SEM)

将不同浓度(20mg/ml、30mg/ml和40mg/ml)的胎盘水凝胶37℃成胶后，低温冷冻干燥，喷金，用扫描电镜观察凝胶的微观结构。

2.1.2傅里叶变换红外光谱分析(FT-IR)

冻干的天然胎盘基质粉末(P)、脱细胞胎盘粉末(DPM)、胎盘水凝胶(D-gel)与I型胶原水凝胶(C-gel)分别与KBr混合制成小球，用红外光谱分析仪(Nicolet,USA)在波长4000–400cm^-1范围内检测其透射峰并进行分析。

2.1.3流变学检测

温敏材料凝胶化温度比较:采用旋转流变仪(RS6000，Thermo公司)对胎盘水凝胶原凝胶、I型胶原水凝胶原凝胶样品进行流变学中的温度扫描测定。在40mm检测平板上加样600μl，10～50℃范围内以1℃/min的速度缓慢升高温度，检测储能模量(G')和耗能模量(G″)变化曲线，当G'和G″均符合力学定律(G'∝ω_n，G″∝ω_n)，且n值相同时，该温度为凝胶化温度。分别测定D-gel、C-gel温敏溶液的凝胶化温度。

2.1.4溶胀率

将不同浓度的胎盘水凝胶(20mg/ml、30mg/ml和40mg/ml，每个浓度4 个平行样本)各800μl，37℃孵育成胶后，37℃条件下，浸没于PBS(pH＝7.4)中24h。小心移出样品，弃去表面多余的水分，称重为总蓄水量(Ws)，将样品冷冻干燥后称重(Wd)。样品的溶胀率按以下公式计算：

\frac{W_{s} - W_{d}}{W_{d}}

2.2.1生物相容性评价实验

2.2.1.1细胞相容性评价

2.2.1.1.1死活细胞染色

D-gel凝胶(30mg/ml)为实验组，C-gel凝胶和孔板为对照。凝胶按比例配好，以0.1ml/孔把凝胶铺板在24孔板中，放入37℃恒温孵箱中，待凝胶形成。将消化好的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)以每孔1×10⁵个细胞进行表面接种。在第1、3和9天行死活细胞染色观察细胞在材料上的生长情况，首先弃去培养液，PBS清洗两遍，加入100μl荧光染色液(染色液配置：1mlPBS中含1mM钙黄绿素、1mM PI和1mM Hochest)覆盖凝胶表面即可，在37℃孵育20分钟后弃去多余的染液，PBS清洗2次，最后用激光共聚焦显微镜(Nikon公司，日本)观察。

D-gel凝胶(30mg/ml)为实验组，C-gel凝胶和孔板为对照。凝胶按比例配好，以0.1ml/孔把凝胶铺板在24孔板中，放入37℃恒温孵箱中，待凝胶形成。将消化好的NIH 3T3小鼠成纤维细胞和本室分离培养法培养的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)P₄代分别以每孔1×10⁵个和6×10⁴细胞进行表面接种。在第1、3和5天行死活细胞染色观察细胞在材料上的生长情况，首先弃去培养液，PBS清洗两遍，加入100μl荧光染色液(染色液配置：1ml PBS中含1mM钙黄绿素、1mM PI和1mM Hochest)覆盖凝胶表面即可，在37℃孵育20分钟后弃去多余的染液，PBS清洗2次，最后用荧光显微镜(Olympus公司，日本)观察并采图。

2.2.1.1.2细胞毒性实验

胎盘水凝胶和I型胶原水凝胶37℃成胶后，加入无血清DMEM培养基(1:10,V/V)，37℃水平震荡48h后，收集液体即为浸提液，使用时加入与完全培养基相同比例的FBS。

接种HUVEC(200μl，4000细胞/每孔)和NIH 3T3成纤维细胞(200μl，4000细胞/每孔)于96孔板中，次日更换浸提液培养基(含血清的D-gel浸提液和C-gel浸提液)和正常培养基(HUVEC，含5％FBS的DMEM培养基；NIH 3T3成纤维细胞：含10％FBS的DMEM培养基)，以后隔天换液。第1、3和5天时，弃去上清液液，加入cck-8试剂(100μl无血清DMEM培养基+10μl CCK-8)，37℃、5％CO₂孵箱中孵育2.5h后，于酶标仪上在450nm波长处测定吸收值。

2.2.1.2大鼠皮下植入

为验证胎盘水凝胶可体内成胶，将1ml D-gel注射入大鼠皮下，30min后，处死大鼠，取出植入材料观察。

雄性SD大鼠共30只，2月龄，体重250～300g，大鼠背部皮下注射植入实验观察D-gel和C-gel的炎症反应，实验大鼠因麻醉过量死亡2只，饲养过程中死亡3只。大鼠经水合氯醛(每300g体重腹腔注射1ml水合氯醛)麻醉后沿背部脊柱两侧去毛，再用碘伏和75％酒精依次消毒后，在脊柱两侧选择2个点分别作为实验组和对照组。术后7、14和28天分别处死5只SD大鼠取材，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片(片厚4μm)，行H&E染色、日本Masson染色和CD68免疫组化染色。

观察指标及检测方法：

(1)大体观察

(2)组织学检测

H&E染色：同前

日本Masson染色步骤：

常规脱蜡至复水；

苏木素染15min，流水洗3次；

盐酸分色19s，流水洗3次；

氨水促蓝1min，流水洗3次

丽春红染15min，流水洗3次；

2.5％磷钨酸6min，水洗3次；

苯胺蓝染色约2min，水洗3次；

烤干，ETC透明I、II各5min；

中性树胶封片，采图。

CD68免疫组化染色步骤：

石蜡切片37℃过夜，65℃烘烤2h；

常规脱蜡至复水，PBS洗3次，每次5min；

3％H₂O₂避光封闭20min，PBS洗3次；

抗原修复：微波修复3min(即柠檬酸缓冲液液高火3min，将组织切片放入，中火3min即可)，自然冷却后PBS洗3次；

1％牛血清白蛋白(BSA)室温封闭10min；

加一抗(稀释比为1：800)，置于4℃过夜，次日取出置于37℃复温30min，PBS洗3次；

生物素化二抗工作液37℃孵育30min，PBS洗3次；

辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃孵育30min，PBS洗3次；

DAB显色，自来水终止显色；

苏木素染2min，自来水洗涤数次；

盐酸分色，自来水洗数次，氨水促蓝1min，自来水洗数次；

常规脱水、透明、封片、采图。

2.2.2促血管化评价实验

2.2.2.1体外血管化评价

2.2.2.1.1HUVEC体外成管实验

D-gel凝胶(30mg/ml)为实验组，C-gel凝胶为对照。凝胶按比例配好，以50μml/孔把凝胶铺板在48孔板中，放入37℃恒温孵箱中，待凝胶形成。将消化好的HUVEC以每孔2×10⁵个细胞进行表面接种。在24h后于倒置显微镜(Olympus公司，日本)下观察血管网络的形成情况，每孔随机选取3个视野，用图像分析系统(Image-Pro Plus)计数管腔的个数。

2.2.2.1.2大鼠主动脉环实验

主动脉环的三维培养方法：大鼠主动脉血管环培养基为含1％FBS的EBM-2，培养条件为48孔细胞培养板中置于37℃、5％CO₂混合气体的培养箱中培养。

A、主动脉血管环的分离

将4周龄的SD大鼠脱颈处死后立即先后用碘伏和75％酒精浸泡消毒；

在无菌超净台上操作，用灭菌的手术器械从大鼠腹部开口，找到主动脉血管位置；

小心取下主动脉近心端约2-3cm迅速移至预冷的无血清的EBM-2培养基中清洗；

使用显微镊去除血管周围的纤维和脂肪组织，小心不要破坏血管壁；

将干净的血管置于无菌玻片上，用手术刀片切成1mm的小段；

挑选没有分支的血管环，用无血清的EBM-2清洗3次备用。

B、主动脉血管环的三维培养

在无菌超净台上，在48孔细胞培养板中每孔加入100μL胎盘水凝胶或者I型胶原水凝胶，使胶在孔底部铺平，注意不要产生气泡；

将加好胶的培养板放入37℃、5％CO₂混合气体的培养箱中孵育1h使其成胶；

取出培养板，用显微镊将准备好的血管环小心平放在每孔中央；

在血管环上再加入100μl胎盘水凝胶或者I型胶原水凝胶；

待双层胶凝固并将血管环固定后，于每孔中加入250μL培养基(含1％FBS的EBM-2培养基)置于37℃、5％CO₂混合气体的培养箱中培养；

每2天更换一次表层培养基，显微镜下观察微血管生成状况；

在培养18天后，钙黄绿素染色后于荧光显微镜下采集微血管生成图像，放大倍数为40。

C、新生微血管密度分析

使用Image Pro-Plus图像分析软件分析微血管生成的面积。

2.2.2.2体内血管化评价

于皮下植入术后3、7天取材，行CD31免疫组化，400倍随机在材料内部采图6张，计数CD31阳性的管腔数据并进行统计分析。

CD31免疫组化染色步骤：

石蜡切片37℃过夜，65℃烘烤2h；

常规脱蜡至复水，PBS洗3次，每次5min；

3％H₂O₂避光封闭20min，PBS洗3次；

抗原修复：微波修复20min(即pH＝9.0的EDTA缓冲液液高火3min，将组织切片放入，中火15min即可)，自然冷却后PBS洗3次；

山羊血清室温封闭5min；

加一抗(稀释比为1：50)，置于4℃过夜，次日取出置于37℃复温30min，PBS洗3次；

生物素化二抗工作液37℃孵育30min，PBS洗3次；

辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃孵育30min，PBS洗3次；

DAB显色，自来水终止显色；

苏木素染2min，自来水洗涤数次；

盐酸分色10s，自来水洗数次，氨水返蓝1min，自来水洗数次；

常规脱水、透明、封片、采图。

2.2.3统计学方法

数据采用SPSS19统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用LSD法，p<0.05有统计学意义。

二、检测结果

1、脱细胞胎盘

1.1组织学观察

胎盘经过SDS和过氧乙酸处理之后，H&E和DAPI染色结果显示可明显去除细胞和核酸物质(图1)。在未经脱细胞处理的胎盘组织中可见大量的细胞成分和核酸物质(H&E染色中的蓝紫色斑点和DAPI染色中的蓝白色斑点显示的均为细胞核)，但是经过脱细胞处理后，无明显细胞残留。

1.2DNA定量检测

DNA荧光定量检测结果(图2)显示，通过脱细胞处理后，明显降低了基质中的DNA含量(正常胎盘dsDNA含量：1082±365ng/mg placenta，PDM中dsDNA含量：141±100ng/mg PDM，显著降低了材料中的DNA含量，但仍有比较多的DNA残留，经过胃蛋白酶进一步消化处理，进一步降低了材料中的细胞含量(D-gel粉末中的dsDNA含量为20±11ng/mg D-gel，低于50ng/ml)。

2、温敏性水凝胶

2.1成胶和微观结构观察

如图3～4所示，将D-gel粉末溶解并37℃孵育后，成无色半透明凝胶态(图4A图所示)。冷冻干燥后，呈多孔网状结构(图4B、C所示)，孔径为45-108μm。

2.2傅里叶红外光谱(FT-IR)检测

从FT-IR分析图谱(图5)可看出，正常胎盘(P)、脱细胞胎盘(DPM)、胎盘水凝胶(D-gel)和I型胶原水凝胶(C-gel)均具有胶原的典型峰：C＝O伸缩振动峰1650cm^-1(酰胺I),N-H伸缩振动峰1545cm^-1(酰胺II)和N-H弯曲振动峰1339cm^-1(酰胺III)^[28-30]。然而，正常胎盘、脱细胞胎盘、胎盘水凝胶在1240cm^-1处的峰为R-SO₃ ^-1基团中S＝O的伸缩振动峰的，在1200cm^-1-1000cm^-1之间(C-C-O和C-O-C的伸缩振动峰)有多糖的特征峰，两者结合起来表明其含有sGAG^[31]，而单纯胶原凝胶则不具有sGAG。

2.3流变学检测

如图6所示，温度低于35℃时，储能模量(G’)和损耗模量(G”)均小于3Pa，表明处于可流动的液体状态，在相变温度后，材料储能模量G’上升，表明材料从液态向凝胶态转变。

2.4溶胀率

如图7所示，不同浓度(2％、3％和4％)胎盘水凝胶的溶胀率分别为48.00±2.46，,47.89±2.56，46.56±1.09，各浓度组间溶胀率没有显著性差异(p>0.05，n＝4)。

2.5生物相容性实验

2.5.1细胞相容性

2.5.1.1死活细胞染色

NIH 3T3成纤维细胞和BMSC接种于D-gel凝胶和C-gel凝胶表面，随着接种时间的延长，细胞呈不断增多趋势，生长良好，死细胞较少(图8～12)。

2.5.1.2细胞毒性实验

水凝胶浸提液分别培养HUVEC细胞和NIH 3T3小鼠成纤维细胞，均生长良好，与正常培养基相比，OD值无统计学差异(图13)，说明材料的毒性较小。

2.6大鼠皮下植入

如图14～16所示，组织学观察皮下植物后1周、2周和4周材料在体内引起的炎症反应(图11H&E染色，图12CD68免疫组化染色)。1周和2周时炎性反应较重，4周时有所降低。

2.7血管化评价

2.7.1体外促血管化评价

2.7.1.1HUVEC成管实验

如图17～18，将HUVEC分别接种于胎盘水凝胶和I型胶原水凝胶表面，12h时观察(图17A和B)，细胞在I型水凝胶表面贴壁并铺展开，形态与接种于孔板表面类似，而在胎盘水凝胶上，细胞仍基本是圆形，但是成管状排布。24h时(图17C和D)，细胞在I型水凝胶表面形态和排布基本没变，但是细胞大量增殖，而在胎盘水凝胶上形成明显的管状结构，细胞增殖不明显。对24h时两种凝胶上形成的管腔数进行计数统计。胎盘水凝胶组形成管腔数(18.7±11.7)与I型胶原水凝胶组(2.8±0.8)相比明显较多，差异有统计学意义(p＜0.05)，表明D-gel能促进HUVEC的体外管腔形成。

2.7.2大鼠主动脉环发芽实验

以体外培养的大鼠主动脉环为研究对象，实验组为胎盘水凝胶，对照组为大鼠I型胶原水凝胶，连续培养18天后于显微镜下观察并采集微血管形成图像。

微血管生成情况和新生微血管密度统计图如图19所示，实验组和对照组，血管周围均出现了迁移的内皮细胞和少量的分支状微血管，实验组周围迁移的内皮细胞较多，两组新生血管面积比较具有统计学差异。

2.7.3体内血管化评价实验

如图20所示，对大鼠皮下植入3天和7天取材的切片行CD31免疫组化并进行血管阳性数目计数分析。7天时，胎盘水凝胶和I型胶原水凝胶中的血管数目均高于3天时，差异没有统计学意义。3天和7天时，胎盘水凝胶中的血管数目均高于I型胶原水凝胶中的，但仅3天时差异具有统计学意义。

实验结果说明，采用本发明温敏性凝胶粉制备的温敏性凝胶具有良好的温敏特性和生物相容性，在体内可降解，具有促进血管化的作用。

综上，本发明温敏性水凝胶粉可以长期室温存放，灭菌方法简单，方便大规模生产和投入市场使用，由其制备的温敏性水凝胶具有良好的温敏特性、生物相容性，在体内可降解，具有促进血管化的作用，工业应用前景良好。

Claims

1.一种温敏性水凝胶粉，其特征在于：它由如下方法制备：

(2)将脱细胞胎盘粉与胃蛋白酶酸溶液按(10mg～30mg)：1ml的比例混合，所述胃蛋白酶酸溶液是胃蛋白酶醋酸溶液或胃蛋白酶盐酸溶液，其中，胃蛋白酶浓度为1mg/ml，醋酸浓度为3％(v/v)，盐酸浓度0.01-0.5mol/L，室温搅拌，得均一粘稠的液状物体；

(3)在冰浴下，加入强碱溶液至pH为6.5-7.2，冻干，即得。

2.根据权利要求1所述的温敏性水凝胶粉，其特征在于：步骤(1)中，所述脱细胞处理的步骤如下：

a、将胎盘用0.5～1％(w/v)SDS溶液浸泡8-15h，用去离子水洗净；

3.根据权利要求2所述的温敏性水凝胶粉，其特征在于：步骤a中，所述SDS溶液的浓度为0.5％(w/v)；所述SDS溶液为含有SDS的生理盐水溶液；所述浸泡为震荡浸泡，震荡的频率为100rpm；所述浸泡的时间为8h。

4.根据权利要求1所述的水凝胶粉，其特征在于：步骤(1)中，所述脱细胞胎盘粉的粒径不大于60目。

5.根据权利要求1所述的水凝胶粉，其特征在于：步骤(1)和步骤(4)中，所述冻干的温度为-50℃～-80℃，真空度为0.1mbar～0.2mbar，时间为24h～48h。

6.根据权利要求5所述的水凝胶粉，其特征在于：所述冻干的温度为-80℃，真空度为0.12mbar，时间为24h。

7.根据权利要求1所述的水凝胶粉，其特征在于：步骤(2)中，所述脱细胞胎盘粉与胃蛋白酶酸溶液按20mg：1ml的比例混合；所述胃蛋白酶酸溶液中，酸为0.1mol/L的盐酸；所述搅拌的时间为48h；所述搅拌的频率为100-300rpm。

8.根据权利要求1所述的水凝胶粉，其特征在于：步骤(3)中，所述强碱溶液为氢氧化钠溶液。

9.一种制备温敏性水凝胶粉的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(3)在冰浴下，加入强碱溶液至pH 6.5-7.2，冻干，即可。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述脱细胞处理的步骤如下：

a、将胎盘用0.5～1％(w/v)SDS溶液浸泡8-15h，用去离子水洗净；

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：步骤a中，所述SDS溶液的浓度为0.5％(w/v)；所述SDS溶液为含有SDS的生理盐水溶液；所述浸泡为震荡浸泡，震荡的频率为100rpm；所述浸泡的时间为8h。

12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述脱细胞胎盘粉的粒径不大于60目。

13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(4)中，所述冻干的温度为-50℃～-80℃，真空度为0.1mbar～0.2mbar，时间为24h～48h。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述冻干的温度为-80℃，真空度为0.12mbar，时间为24h。

15.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述脱细胞胎盘粉与胃蛋白酶酸溶液按20mg：1ml混合；所述胃蛋白酶酸溶液中，酸为0.1mol/L的盐酸；所述搅拌的时间为48h；所述搅拌的频率为100-300rpm。

16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述强碱溶液为氢氧化钠溶液。

17.一种温敏性水凝胶，其特征在于：它是由权利要求1～8任意一项所述的温敏性凝胶粉制备而成，制备方法为：称取权利要求1～8任意一项所述的温敏性凝胶粉，在冰浴条件下加入预冷的PBS溶液、蒸馏水或DMEM培养基中，二者的比例为30mg：1ml，搅拌均匀后，置于37℃下，即得。

18.一种制备温敏性水凝胶的方法，其特征在于：步骤如下：称取权利要求1～8任意一项所述的温敏性凝胶粉，在冰浴条件下加入预冷的PBS溶液、蒸馏水或DMEM培养基中，二者的比例为30mg：1ml，搅拌均匀后，置于37℃条件下，即可形成温敏性凝胶。