CN107224617A - 一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶及其制备方法。该水凝胶以同种或异种来源的脾脏为原材料，经过脱细胞、消化和孵育成胶等处理制备而成。本发明脾脏特异水凝胶可以表现出自组装的特点，并有效形成干细胞巢，促进干细胞迁移到病变部位并促进干细胞生存促进血管生成，从而发挥功能。同时，脾脏特异水凝胶可以有效改善病变部位的免疫微环境，促进免疫细胞的生长和淋巴管的生成，从而对病变部位进行有效的修复。在多种重大疾病的临床治疗中具有良好的应用前景。

Description

一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶及其制备方法。
背景技术
水凝胶(hydrogel)是一种以水为分散介质,通过共价键、氢键或范德华力等作用相互交联构成的具有三维网络结构的高分子材料。因其特有的粘弹性、高含水性和环境响应性等特性而在组织工程、药物缓释以及生物传感器等生物医学领域具有广泛的应用前景。
传统水凝胶可分为合成高分子水凝胶和天然高分子水凝胶。合成水凝胶以丙烯酰胺(AAM)及其衍生物的均聚物和共聚物、丙烯酸(AA)及其衍生物的均聚物和共聚物居多。其次，还有聚乙烯醇(PPA)、聚磷腈(PPZ)等。天然高分子材料如壳聚糖(CS)、葡聚糖(dex)、瓜胶(GG)、胶原、蛋白质等。由于传统水凝胶存在生物相容性、响应速度、机械强度等性能问题，研究者一直致力于通过各种方式对传统水凝胶进行改性来接近细胞外基质。然而这些改性后的传统水凝胶，无论是超微结构还是生物学功能，仍和天然的细胞外基质相差甚远。
细胞外基质(extracellular matrix,ECM)是细胞微环境的重要组成部分，在体内可以调节细胞的生存和功能状态。由于细胞外基质不仅具有良好的生物相容性，同时还具有多重生物学功能，因此被广泛应用于组织工程学领域。目前，已经有很多种组织来源的细胞外基质被制备成水凝胶用于治疗一些心血管疾病或修复组织的缺损，从而改善组织和复杂器官的功能。不同组织来源的细胞外基质具有不同的组成成分和结构。如心脏细胞外基质、小肠细胞外基质、胎盘细胞外基质等，它们含有不同的生物学成分和具有不同的结构，因此它们在用于治疗心血管疾病，用作辅料修复组织缺损，或者用于改善组织器官功能的过程中，具有各自的优势特点，但是也存在各自的不足之处。
发明内容
为了解决传统凝胶和其它组织细胞外基质存在的不足，本发明提供了一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶制备方法，包括以下步骤：
(1)制备生物基质材料：取同种或异种来源的脾脏组织进行处理制备成生物基质材料；处理方法是将取材的脾脏去除脾脏组织中的脂肪组织，剪成1～3mm3的组织小块浸泡在生理盐水中漂洗，然后经脱细胞处理，得到脱细胞的脾脏细胞外基质。
(2)消化：用去离子水清洗步骤(1)获得的脾脏细胞外基质去除残留的脱细胞试剂，真空冷冻干燥，称重，加入0.01～0.2M的盐酸溶液并研磨成匀浆，加入胃蛋白酶，恒温搅拌进行消化，得到均匀粘稠的脾脏细胞外基质溶液。
(3)孵育成胶：在冰浴条件下，用1M的氢氧化钠溶液调节脾脏细胞外基质溶液PH至中性，然后加入PBS溶液，置于37℃孵育成胶，于4℃保存。
步骤(1)中所述脱细胞处理包括：将脾脏组织小块浸泡在脱细胞液中，置于37℃，80r/min条件下震荡20～40小时，更换脱细胞液，置于25℃，60r/min条件下震荡30～50小时。脱细胞液为0.05％～0.3％SDS+1.5％～4％EGTA，并调节pH至中性。
步骤(2)中所述真空冷冻干燥中冻干温度为-80～-60℃，真空度为0.1～0.2mbar，时间为24～48h。
步骤(2)中所述胃蛋白酶的浓度为1mg/ml，搅拌温度为25℃，搅拌频率为100rmp，搅拌时间为24～48h。
本发明还提供了一种由上述方法制备的水凝胶。
脾脏是人体中最大的免疫器官和造血细胞池，并且脾脏组织的细胞外基质在造血细胞、免疫细胞、淋巴生成、免疫平衡等功能过程中起着重要作用。本发明由脾脏组织的细胞外基质经过脱细胞而来的温敏性水凝胶，当注射到体内时，它可以表现出自组装的特点，并有效形成干细胞巢，促进干细胞迁移到病变部位并促进干细胞生存促进血管生成，从而发挥功能。同时，脾脏特异水凝胶可以有效改善病变部位的免疫微环境，促进免疫细胞的生长和淋巴管的生成，从而对病变部位进行有效的修复。
本发明制备的脾脏特异水凝胶具有良好的生物相容性和明显的生物学功能。在多种重大疾病的临床治疗中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为脾脏特异性水凝胶的特征性描述图；图中a.未处理的猪的脾脏组织；b.脱细胞后的脾脏组织；c.脱细胞前的H&E染色切片；d.脱细胞后的H&E染色切片；e.脾脏特异性水凝胶成胶；f.电泳定性检测脱细胞前后组织中的DNA；g.脾脏特异性水凝胶的扫描电镜图；h.巨噬细胞接种于脾脏水凝胶48h后的扫描电镜图；i.巨噬细胞接种于心肌水凝胶48h后的扫描电镜图；
图2为超声心动图评价心脏功能图；如图标注依次为对照组、心脏水凝胶组、脾脏水凝胶组的超声心动图；折线图依次为EF(射血分数)、FS(短轴缩短率)、E/A(E峰值与A峰值比率)，其中，黑色方块是未处理的空白对照组，空心圆圈为脾脏水凝胶注射组，黑色三角为生理盐水对照组；
图3为缺血再灌注心脏原位注射后表型图；其中a,b,c,d分别为心肌梗死后注射生理盐水3天、7天、21天、42天的心脏表型；e,f,g,h分别为心肌梗死后注射脾脏特异性水凝胶3天、7天、21天、42天的心脏表型；
图4为组织学和免疫组化分析图；图中a.脾脏特异水凝胶的H&E染色；b,c分别表示脾脏特异水凝胶组和对照组中M2巨噬细胞的渗透情况；d,e,f分别表示心肌缺血条件下脾脏水凝胶组、心脏水凝胶组、生理盐水组中微淋巴管密度；g,h,i分别表示心肌梗死注射脾脏水凝胶、心脏水凝胶、生理盐水后心肌细胞群增加的平均面积；柱状图分别为微淋巴管密度和心肌细胞群面积的定量分析。
具体实施方式
本发明提供了一种以脾脏细胞外基质为原料的特异性水凝胶及其制备方法。该脾脏特异性水凝胶具有自组装的特点并且可以有效改善组织病变部位的免疫微环境，促进免疫细胞的生长和淋巴管的发育，以及提供干细胞生存，促进血管生成，从而对组织起到修复作用。下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述。
实施例1本发明脾脏特异水凝胶的制备
(1)脱细胞：将冰箱保存的同种或异种来源的(如猪)脾脏组织缓慢复温5～8小时，去除脾门等脂肪组织，剪成1～3mm3的组织小块浸泡在生理盐水中漂洗，然后将脾脏组织小块浸泡在脱细胞液(0.05％～0.3％SDS+1.5％～4％EGTA，并调节pH至中性)中，置于37℃，80r/min条件下震荡20～40小时，更换脱细胞液，置于25℃，60r/min条件下震荡30～50小时，得到脱细胞的脾脏细胞外基质。
(2)酶消化：用去离子水在25℃，80rpm条件下震荡漂洗步骤(1)的脱细胞的脾脏细胞外基质(每隔40～60分钟换一次水，共15～25次)，去除残留的脱细胞液，真空冻干(冻干温度为-80～-60℃，真空度为0.1～0.2mbar，时间为36～48h)，在0.01～0.2M的盐酸溶液中研磨成匀浆，加入胃蛋白酶(浓度为1mg/ml)，置于25℃，100rmp条件下搅拌消化24～48h，得到均匀粘稠的乳白色脾脏细胞外基质溶液。
(3)孵育成胶：在冰浴条件下，用1M的氢氧化钠溶液调节脾脏细胞外基质(ECM)溶液PH至中性，然后加入ECM溶液的10％的PBS溶液，置于37℃孵育成胶，于4℃保存。
通过以上步骤即可得到脾脏特异水凝胶。以下通过实施例来说明脾脏特异水凝胶的检测和应用。
实施例2本发明脾脏特异水凝胶的性质检测
1.脱细胞脾脏ECM组织检测
1.1组织包埋切片
(1)取经过实施例1脱细胞处理的脾脏细胞外基质和未处理的脾脏组织，用4％的多聚甲醛固定48小时，流水冲洗过夜。
(2)用梯度酒精进行脱水处理，ETC透明过夜。
(3)用Tissue Tek O.C.T.进行冷冻包埋，切割成10μm左右的薄片。
1.2H&E染色
(1)将上述切片37℃烘烤恒长，染色前于65℃烘烤2h以上。
(2)ETC脱蜡10min，梯度酒精复水，流水冲洗。
(3)苏木素染15min，流水洗3次；盐酸分色10s，流水洗3次；氨水促蓝1min，流水洗3次；过75％酒精，伊红染4min，流水洗3次。
(4)烤干，ETC透明5min，中性树脂封片，采图。
2.DNA定量检测
样品中的DNA的提取纯化：
(1)取经过实施例1脱细胞处理的脾脏细胞外基质和未处理的脾脏组织，研磨成粉末，各取10mg左右。
(2)100μg/ml蛋白酶K在60℃消化48h。
(3)10000g，4℃离心10min，取上清液。
(4)加入等体积的苯酚-氯仿溶液，上下震荡10min，10000g离心30min，取上层液。
(5)加入十分之一上清液体积的3mol/L的醋酸钠，2.5倍体积的无水乙醇，4℃静置过夜沉淀DNA。
(6)10000g离心10min，弃去上清，挥干液体，即得DNA样品。
DNA检测：
(1)取上述5～12μgDNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，定性分析DNA片段的长度。
(2)用分光光度计测定上述DNA的浓度，计算DNA的含量。
3.SDS含量的检测
(1)干燥的脱细胞脾脏组织被剪碎并在液氮中研磨成粉末。
(2)脾脏ECM粉末被溶解在蒸馏水中，加入5ml的氯仿和2ml的甲醇(5％)，混匀静置。
(3)加入0.6ml亚甲基蓝溶液(1％)混合1min。
(4)静置10分钟后，用分光光度计测量在660nm处的氯仿含量的吸收峰。
(5)制作标准曲线，然后计算脾脏组织水洗前后的SDS残留含量。
检测结果(参见图1)：
1.组织观察
脾脏组织经过脱细胞处理之后，H&E染色结果显示细胞外基质中的细胞被明显去除并且是无核酸物质。而在未经脱细胞处理的脾脏组织中可见大量的细胞成分和核酸物质(如图1c和d所示)。这说明脱细胞试剂可以有效去除细胞外基质中的细胞。
2.DNA定量检测
DNA含量的分析结果表明天然脾脏组织和脱细胞的脾脏组织之间存在着显著差异。脱细胞脾脏组织中的DNA含量(85.01±3.1％＝96.1±28.2ng/mg tissue；P<0.001)与天然脾脏样品中的DNA含量(100％＝6,468.11±646.9ng/mg tissue)相比显著降低(如图1中左下方柱状图)。凝胶电泳结果分析显示(如图1f所示，黑色尖头所指表示天然脾脏样品中DNA条带，白色尖头所指表示天然脾脏样品中DNA条带，中间为marker)，脱细胞处理后的细胞外基质中仍有比较多的DNA残留，经过胃蛋白酶进一步消化处理，可进一步有效降低组织中的DNA含量。
3.SDS含量检测
检测结果显示，经过连续不断地水洗后，脾脏组织中的SDS含量比水洗之前有显著的降低(如图1中右下方柱状图)。脾脏组织在用蒸馏水洗之后的SDS浓度(0.006±0.01mg/gtissue)与水洗之前的SDS浓度(8.449±0.43mg/g tissue)相比，大约减少了99.93％。
实施例3巨噬细胞接种于脾脏水凝胶的培养
1.外周血中巨噬细胞的分离培养和分化
(1)取大鼠的外周血，通过梯度离心法分离得到大鼠的巨噬细胞。
(2)巨噬细胞接种到培养基(成分为10％的FBS，1％的青霉素或链霉素，2mM的左旋谷酰胺和1mM的丙酮酸钠)中，置于37℃的湿润环境中，并通入5％的CO2培养7天，每隔48小时更换一次培养基。
(3)培养7天后，离心去除上述培养基，用基础培养基(10％的FBS，100ug/ml的链霉素，100U/ml的青霉素组成)继续培养。
2.脾脏特异水凝胶的扫描电镜
(1)取上述实施例1制备的脾脏特异水凝胶在37℃条件下温育1h。
(2)将上述分离培养的巨噬细胞离心去除培养基，用10％的PBS悬浮制备成巨噬细胞悬浮液。
(3)将巨噬细胞悬浮液和脾脏特异水凝胶溶液混合制备成细胞终浓度为2.0X107cells/mL，ECM水凝胶浓度为10mg/mL的混合液。
(4)上述混合液置于20℃培养一段时间后，首先用2.5％的戊二醛固定2h，然后用一系列梯度浓度乙醇冲洗(30～100％)进行脱水处理。
(5)样品用Emitech K575X喷涂机进行铱涂层，然后用扫描电镜观察水凝胶的微观结构。
结果分析(如图1g、h和i所示)：
扫描电镜分析表明脾脏细胞外基质由一个纳米纤维和多孔材料构成，重组装的纳米材料直径在40～100nm。巨噬细胞被分别接种在脾脏特异水凝胶和心肌水凝胶中。48小时后，扫描电镜观察到与心肌水凝胶相比，在脾脏特异水凝胶中有更多的巨噬细胞生长。这表明脾脏特异水凝胶可以有效促进免疫细胞的生长。
实施例4本发明脾脏特异水凝胶用于注射治疗心梗模型
1.大鼠心肌梗死模型和凝胶注射治疗
(1)取重量在250～300g的雄性大鼠，用水合氯醛(10g/kg)和阿托品(1mg/kg)通过腹腔注射麻醉并固定在无菌环境中。
(2)用静脉插管留针和使用动物呼吸机进行60次/分钟和3毫升/100克体重的呼吸容量进行机械呼吸。
(3)在无菌条件下，打开左胸腔，切除心包。左冠状动脉用脯氨酸阻塞45分钟来使心脏局部缺血。
(4)脾脏特异ECM水凝胶(75μl,10mg/ml)，心脏特异ECM水凝胶(75μl,10mg/ml)和生理盐水对照(75μl)分别用31G的针注射进缺血的心机衰弱组织中。出现明显的肿胀表明注射成功。用没有阻塞冠状动脉的大鼠作为空白对照。
(5)将处理后的大鼠放回恒温动物房中并提供饲料和水进行喂养。
2.通过超声心动图来评价心脏功能
(1)将上述心梗模型大鼠分别在3天、1周、2周、3周和4周时通过腹腔注射麻醉，用超声系统在13MHz的频率和100mm/s的速率下测试其左心室的LVDD(左心室舒张末内径)和LVSD(左心室收缩末内径)。
(2)计算左室短轴缩短率，计算公式为(LVDD-LVSD)/LVDD]×100％，其中LVDD为左心室舒张末内径，LVSD为左心室收缩末内径。
(3)计算EF(左室射血分数)，计算公式为EF＝(EDV-ESV)/EDV]×100％，其中EDV为左心室舒张末期容量，ESV为左心室收缩末期容量，EF值反映心室的收缩功能。
(4)通过多普勒脉冲波测量二尖瓣口血流速度，分别测量左室舒张早期快速充盈的充盈峰(E峰)和舒张晚期(心房收缩)充盈的充盈峰(A峰)，E/A的比率反映心室舒张功能。
注：上述所有的测量值都是三个连续心脏循环的平均值。
结果分析：(如图2所示)：
通过心脏超声来评价心脏功能。分别在3天、1周、2周、3周和4周时测量脾脏特异水凝胶组，心脏水凝胶组，生理盐水组和空白对照组心梗模型大鼠的LVSD，LVDD，EDV和ESV等参数，测量结果显示四组数据之间存在显著的差异。计算结果表明与心脏水凝胶组和生理盐水组相比，脾脏水凝胶组的FS(左室短轴缩短率)和EF(射血分数)等指标具有显著的恢复，这表明脾脏水凝胶可以有效改善心肌梗死后的心脏功能。
3.组织学与免疫组化分析
组织学分析：
(1)将上述经过不同处理的心肌梗死模型大鼠分别在3天，1周，2周，3周和4周的时候用过量麻醉的方法进行处死。
(2)立即取出心脏(如图3)置于4％的多聚甲醛溶液中浸泡24小时，然后进行冷冻包埋切成10μm左右的薄片(方法同实施例2中1.1)。
(3)将上述切片进行H&E染色(方法同实施例2中1.2)，用光学显微镜进行观察拍照。
免疫组化分析：
(1)用上述方法(方法同实施例2中1.1)制备心肌组织切片。
(2)加入1:100稀释度的小鼠抗大鼠LYVE-1多克隆抗体孵育48小时，然后加入1:200稀释度的CD206抗体过夜，再加入1:100稀释度的心肌肌钙蛋白抗体过夜。
(3)加入1:800稀释度的驴抗小鼠抗体孵育1个小时，置于室温1小时对样品进行染色。
(4)将上述样品用荧光显微镜进行观察拍照。
结果分析：(如图4所示)
通过组织切片H&E染色可以看出，在脾脏水凝胶组的心肌梗死区域有适度的单核细胞渗透浸入(如图4a)，这些单核细胞主要由淋巴细胞和巨噬细胞组成。而且，脾脏水凝胶组中的M2巨噬细胞的渗透水平明显要高于对照组(如图4b,c)。通过组织切片免疫荧光染色可以看出，脾脏水凝胶组缺血心肌中的为淋巴管密度(如图4d)明显要高于对照组(如图4e,f)，经计算可得脾脏水凝胶组中的淋巴管密度为24.4+3.3，对照组为5.6+2.5。同时，观测到活性心肌细胞群在脾脏水凝胶组中的面积(如图4g)要明显高于对照组(如图4h,i)，经计算可得脾脏水凝胶组中的活性心肌细胞群的面积为0.08+0.01mm2，生理盐水对照组为0.03+0.01mm2。这表明，脾脏水凝胶有助于改善心肌梗死区域的微环境，从而促进淋巴管和心肌细胞的生成。
实施例5本发明脾脏特异水凝胶敷料用于烧伤模型的伤口治疗
(1)用1cm直径的不锈钢杆在沸水中加热5分钟至100℃，在剃毛的大鼠背部生成一致的中度二度烧伤，每只大鼠烧伤三处。
(2)对每只大鼠(n＝9)施加的三处损伤分别用脾脏水凝胶、硅树脂水凝胶进行敷料，其中一处损伤不做处理作为对照。放置敷料后，用防水粘膜、纱布和弹性绷带固定敷料。
(3)每隔一天使用数字化测面积法定量测定伤口的大小、肉芽的形成和再上皮化，共14天。
(4)在7天后开始收集处理不同时间的皮肤样品，样品用石蜡包埋，切片染色，用显微镜进行组织学评估。
结果分析：
脾脏特异性水凝胶组在第8天时观察到伤口的清创开始，而对照组在第10天才开始。这表明脾脏特异水凝胶可以加速坏死组织的自溶性去除，促进组织再生。在14天时，观察到脾脏水凝胶组伤口面积愈合大约80％～90％，这明显高于对照组的60％～70％。这表明脾脏特异水凝胶可以促进伤口的愈合。组织学分析显示，在14天时，脾脏特异性水凝胶处理的伤口，表皮的再生几乎完成，在表皮和真皮界面处的基底细胞也已开始穿透真皮，开始形成毛干囊前体。而对照组中伤口中的表皮组织还很薄很脆弱。这表明脾脏水凝胶可以有效促进皮肤创伤后的修复，诱导皮肤组织再生。
实施例6本发明脾脏特异水凝胶用于视网膜损伤修复
(1)破坏小鼠的视网膜致小鼠失明，获得小鼠视网膜损伤模型。
(2)将上述实施例1中制备的脾脏特异水凝胶注射到失明小鼠的眼部，对照组注射同等体积的生理盐水。
(3)将处理后的小鼠放回恒温动物房中饲养，定期对小鼠的瞳孔反应和光敏感性进行检测。
结果分析：
检测结果显示注射脾脏特异水凝胶的小鼠在饲养一段时间后，它们的瞳孔反应恢复了近15％，眼睛开始能探测到光源并有所反应。而注射生理盐水的对照组瞳孔反应没有任何恢复，对光源也不敏感。这表明脾脏特异水凝胶可以有效修复视网膜损伤。
实施例7本发明脾脏特异水凝胶用于脑损伤修复
(1)利用线栓法制备小鼠缺血性脑梗死模型。
(2)将上述实施例1中制备的脾脏特异水凝胶注射到脑梗小鼠模型的脑部，对照组注射同等体积的生理盐水。
(3)将处理后的小鼠放回恒温动物房中饲养，定期对小鼠进行观察。
结果分析：
检测结果显示注射脾脏特异水凝胶的脑梗小鼠在饲养一段时间后，它们的运动能力有明显恢复，运动协调性开始有所提高。而注射生理盐水的脑梗小鼠无明显变化。这表明脾脏水凝胶能有效对脑损伤进行修复，促进大脑功能的恢复。
实施例8本发明脾脏特异水凝胶用于子宫内膜损伤修复
(1)取成年雌性新西兰白兔，用戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉。
(2)取下腹部正中切口暴露子宫，沿子宫长轴剪开，剪去子宫内膜凸起部分，生理盐水纱布止血，将剪开的子宫切口对合整齐并用尼龙线间断缝合。
(3)分两组进行不同的处理，自然修复组：缝合子宫切口，关闭宫腔，逐层缝合腹壁，让受损的子宫内膜自然修复；脾脏水凝胶治疗组：关闭子宫腔后，向腔内注射脾脏特异性水凝胶至饱和，随后逐层缝合腹壁。
(4)将术后的动物置于动物房中饲养，在术后7d和28d分别取各组的子宫标本进行组织学检测，检测方法同上述实施例2。
结果分析：
手术剪去了大部分子宫内膜，术后内膜非常薄。术后28d，组织切片HE染色显示自然修复组宫腔内无上皮样细胞出现，宫腔完全闭塞，内壁相互粘连；而脾脏水凝胶治疗组出现连续的上皮样细胞覆盖宫腔。术后7d，免疫荧光染色显示，在脾脏水凝胶治疗组中观察到有MSCs细胞归巢至再生内膜组织，而自然修复组没有出现此现象。这表明脾脏特异水凝胶可以促进干细胞归巢，对子宫内膜修复具有重要的作用。
实施例9本发明脾脏特异水凝胶用于脊髓损伤修复
(1)取成年SD大鼠，用戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉。
(2)取背部剪开，暴露脊柱，生理盐水纱布止血，将脊髓横断和半横断，制备脊髓损伤模型。
(3)分三组进行不同的处理，自然修复组：注射生理盐水；单独细胞组：注射含有细胞(MSCs)的培养液；细胞加脾脏水凝胶组：注射脾脏水凝胶和细胞(MSCs)混合液。
(4)将术后的动物置于动物房中饲养，在术后每周进行观察并对其运动功能进行评价，术后5周时取标本进行组织学检测和免疫组化检测，检测方法同上述实施例2。
结果分析：
脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统损伤，因其较高的发生率和致残率，常给患者、家庭和社会带来沉重的负担。近年来研究发现，局部注射骨髓间质干细胞(MSCs)可促进脊髓损伤修复。本实验通过建立大鼠脊髓损伤模型，分别设置自然修复组、单独细胞组、细胞加脾脏水凝胶组对脊髓损伤大鼠进行注射治疗，并对术后的恢复情况和组织学进行评价。检测结果显示：在术后的1～5周，各组动物的运动功能均有不同程度的恢复，其中细胞加脾脏水凝胶组的大鼠运动功能恢复最明显且持续时间最长，单独细胞组的大鼠运动功能恢复次之，且在3周后无明显变化，自然修复组的大鼠只在1周时有很轻微的恢复，1周后无明显变化。组织学检测显示：与自然修复组相比，单独细胞组和细胞加脾脏水凝胶组的脊髓组织结构较清晰，灰质中坏死区较小，可见白质存在，胶质瘢痕少。与单独细胞组相比，细胞加脾脏水凝胶组脊髓损伤组织中骨髓间质干细胞(MSCs)的数量要多，并且微血管再生和神经再生明显。结果表明：骨髓间质干细胞(MSCs)可有效修复脊髓损伤，但是细胞衰亡较快，修复效果有限。脾脏水凝胶可以为骨髓间质干细胞(MSCs)提供适宜的生长微环境，促进细胞生长和发挥功能，从而更加有效修复脊髓损伤。
实施例10本发明脾脏特异水凝胶用于癌症术后修复
(1)模型建立：取H22肿瘤细胞，3000转离心5分钟，再用无菌生理盐水洗涤肿瘤细胞3次，并做适当稀释，取40微升细胞悬液加入10微升0.4％台酚蓝染色并镜检计数，制成浓度为3×10个/ml的肿瘤细胞悬液，每只小鼠右腋皮下接种肿瘤细胞悬液0.2毫升。
(2)记录：接种完成后，逐日观察接种部位肿瘤的生长情况，并称量小鼠体重。
(3)实验分组：接种两周后，取体重和肿瘤大小一致的小鼠进行试验，小鼠麻醉后，手术切除肿瘤，随机分为两组。自然修复组：肿瘤切除后，不做任何处理，直接将伤口进行缝合；水凝胶治疗组：肿瘤切除后，用注射器在切除处喷涂一层脾脏特异性水凝胶，然后将伤口缝合。
(4)将上述实验处理后的小鼠置于恒温动物箱中饲养，定期观察小鼠伤口处的恢复情况。饲养两周后，处死小鼠，将伤口处制备成组织切片并进行H&E染色，观察免疫细胞生长情况。
结果分析：
检测结果显示，肿瘤切除后，自然修复组中的小鼠伤口愈合速度比水凝胶治疗组要慢，并且在自然修复组中有肿瘤复发的情况出现，而水凝胶组中无肿瘤复发。组织切片H&E染色结果显示，水凝胶治疗组的肿瘤切除部位的免疫细胞数量要比自然修复组中多。这表明，脾脏水凝胶不仅能够促进伤口的愈合，抑制肿瘤的复发，还有利于改善肿瘤部位的免疫微环境，促进免疫细胞的生长，有助于肿瘤的术后修复。

Claims (10)

1.一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶，由以下步骤制备得到：
(1)制备生物基质材料：取同种或异种来源的脾脏组织进行处理制备成生物基质材料；处理方法是将取材的脾脏去除脾脏组织中的脂肪组织，剪成1～3mm3的组织小块浸泡在生理盐水中漂洗，然后经脱细胞处理，得到脱细胞的脾脏细胞外基质；
(2)消化：用去离子水清洗步骤(1)获得的脾脏细胞外基质去除残留的脱细胞试剂，真空冷冻干燥，称重，加入0.01～0.2M的盐酸溶液并研磨成匀浆，加入胃蛋白酶，恒温搅拌进行消化，得到均匀粘稠的脾脏细胞外基质溶液；
(3)孵育成胶：在冰浴条件下，用1M的氢氧化钠溶液调节脾脏细胞外基质溶液PH至中性，然后加入PBS溶液，置于37℃孵育成胶，于4℃保存。
2.根据权利要求1所述一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶，其特征在于：所述脱细胞处理包括：将脾脏组织小块浸泡在脱细胞液中，置于37℃，80r/min条件下震荡20～40小时，更换脱细胞液，置于25℃，60r/min条件下震荡30～50小时。
3.根据权利要求2所述一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶，其特征在于：所述脱细胞液为0.05％～0.3％SDS+1.5％～4％EGTA，并调节pH至中性。
4.根据权利要求1所述一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶，其特征在于：所述真空冷冻干燥中冻干温度为-80～-60℃，真空度为0.1～0.2mbar，时间为24～48h。
5.根据权利要求1所述一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶，其特征在于：所述胃蛋白酶的浓度为1mg/ml，搅拌温度为25℃，搅拌频率为100rmp，搅拌时间为24～48h。
6.一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备生物基质材料：取同种或异种来源的脾脏组织进行处理制备成生物基质材料；处理方法是将取材的脾脏去除脾脏组织中的脂肪组织，剪成1～3mm3的组织小块浸泡在生理盐水中漂洗，然后经脱细胞处理，得到脱细胞的脾脏细胞外基质；
(2)消化：用去离子水清洗步骤(1)获得的脾脏细胞外基质去除残留的脱细胞试剂，真空冷冻干燥，称重，加入0.01～0.2M的盐酸溶液并研磨成匀浆，加入胃蛋白酶，恒温搅拌进行消化，得到均匀粘稠的脾脏细胞外基质溶液；
(3)孵育成胶：在冰浴条件下，用1M的氢氧化钠溶液调节脾脏细胞外基质溶液PH至中性，然后加入PBS溶液，置于37℃孵育成胶，于4℃保存。
7.根据权利要求6所述一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述脱细胞处理包括：将脾脏组织小块浸泡在脱细胞液中，置于37℃，80r/min条件下震荡20～40小时，更换脱细胞液，置于25℃，60r/min条件下震荡30～50小时。
8.根据权利要求7所述一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述脱细胞液为0.05％～0.3％SDS+1.5％～4％EGTA，并调节pH至中性。
9.根据权利要求6所述一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述真空冷冻干燥中冻干温度为-80～-60℃，真空度为0.1～0.2mbar，时间为24～48h。
10.根据权利要求6所述一种以脾脏细胞外基质为原料的水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述胃蛋白酶的浓度为1mg/ml，搅拌温度为25℃，搅拌频率为100rmp，搅拌时间为24～48h。
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