CN109946449A - 一种组织特异性侵袭试剂盒的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种组织特异性侵袭试剂盒的制备方法，属于肿瘤侵袭转移检测技术领域；本试剂盒率先将该技术与常规基质胶实验相结合，不同组织经过脱细胞、冻干、研磨、溶解等步骤制备成组织特异性的细胞外基质水溶液，该水溶液含有天然组织全部的细胞外基质成分，并将其与传统基质胶按照一定比例配比，制备成的组织特异性基质胶，更贴近体内组织的微环境，更能模拟肿瘤对不同组织器官侵袭转移的能力；本试剂盒的制备及应用将为肿瘤转移的预测、个性化治疗以及科学研究提供更可靠有效的检测手段。

Description

一种组织特异性侵袭试剂盒的制备方法

技术领域

本发明属于肿瘤侵袭转移检测技术领域，具体是涉及一种组织特异性侵袭试剂盒的制备方法。

背景技术

转移是临床绝大多数肿瘤患者治疗失败和死亡的主要原因，防治转移是改善肿瘤预后的关键。肿瘤转移涉及多个步骤，包括细胞的侵袭，进入血管，经血液系统进入循环，归巢到特定组织形成一个新的微转移灶，并最终形成一个肉眼可见的肿瘤，这个过程中不仅受到肿瘤及肿瘤相关细胞的调控，微环境同样也发挥了重要的调控作用。不同组织微环境的异质性影响了肿瘤侵袭转移方向的“偏爱性”。因此在研究肿瘤转移的过程中引入特异性的微环境，对于肿瘤的治疗、预后，甚至是预测转移都具有重要的意义。

细胞的微环境包括细胞与细胞以及细胞与多种蛋白质，也就是细胞外基质之间的相互作用。不同组织来源的细胞外基质组分及组装形式不同，这是由产生细胞外基质的细胞决定的，并与组织的特殊功能相适应。细胞外基质主要成分有三类：1.结构蛋白，如胶原和弹性蛋白等；2.粘着蛋白，如纤粘连蛋白和层粘连蛋白等；3.蛋白聚糖和糖胺聚糖等。这些组分含量和比例的不同造成了细胞对其侵袭速度和方向差异。除此以外细胞外基质中还含有一些组织细胞特异性的成分，这些特异性的成分是微环境异质性形成的原因之一，也是造成肿瘤转移“偏爱性”的因素之一。如果能在不同的组织微环境中研究肿瘤的侵袭过程，将更能体现体内肿瘤侵袭的真实情况，有利于肿瘤侵袭转移机制以及疾病预后监测等的研究。然而目前体外实验研究肿瘤侵袭过程多采用基质胶实验，选取的基质胶来源于小鼠EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)肉瘤提取的基质成分，含有层粘连蛋白、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖。这种商品化的基质胶优点是获取相对容易，成分固定，但也由于其成分单一、物种来源固定，造成不同肿瘤的侵袭实验是在同一种微环境中检测，无法完全再现肿瘤在体内侵袭转移的能力强弱和组织偏向性，影响了实验结果的可靠程度和再现程度。

发明内容

本发明主要是解决上述现有技术所存在的技术问题，提供一种组织特异性侵袭试剂盒的制备方法。

本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：一种组织特异性侵袭试剂盒的制备方法，所述制备方法为：通过手术获取动物的不同组织器官，组织器官包括骨、肺、肝、肾、胃、肠、胰腺、脑的组织器官，获取后对组织器官依次进行双蒸水冲洗处理、由洗脱剂混合溶液脱细胞处理和负压冷冻干燥处理，负压冷冻干燥后，在消化液中消化，形成细胞外基质水溶液，按照终浓度为10μg/μl与普通液态基质胶进行混匀，制成组织特异性基质胶，装盒后即成组织特异性侵袭试剂盒。

作为优选，所述洗脱剂混合溶液脱细胞处理后，在干重条件下脱细胞材料中DNA残余百分比小于5％，且经HE染色后未见明显细胞核残留，脱细胞组织中保留多种主要细胞外基质成分，包括胶原、纤维蛋白、蛋白多糖类以及无机物。

作为优选，所述洗脱剂混合溶液为TritonX-100、十二烷基硫酸钠(SDS)、氨水、DNA酶、RNA酶、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、脱氧胆酸钠(DOC)中的二种或二种以上；洗脱剂混合溶液震荡洗脱时间为3-4周，3天换一次洗脱液，摇床震荡速度为100转/分钟。

作为优选，所述洗脱剂混合溶液为1％TritonX-100+0.1％氨水组合。

作为优选，所述消化液为0.01MHCl+2mg/ml胃蛋白酶。

作为优选，所述组织特异性基质胶经0.22μm滤器过滤除菌。

作为优选，所述组织特异性基质胶采用传统基质胶实验方法对多种细胞的侵袭能力进行检测。

作为优选，所述多种细胞为各种类型细胞，包括胃癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、乳腺癌、前列腺癌、胶质瘤的肿瘤细胞以及各种正常细胞，所述的细胞为各种来源细胞，包括大鼠、小鼠、牛、猪、兔、狗、猴的来源组织。

本发明具有的有益效果：脱细胞技术通过化学和物理的方法去除组织中的细胞成分，保留了天然的细胞外基质成分及其空间结构；脱细胞技术已广泛应用于组织再生工程和肿瘤机制研究，它能够高度的模拟细胞生长的真实空间结构和微环境，克服了经典的2D细胞培养技术和动物造模技术的部分局限性；本试剂盒率先将该技术与常规基质胶实验相结合，不同组织经过脱细胞、冻干、研磨、溶解等步骤制备成组织特异性的细胞外基质水溶液，该水溶液含有天然组织全部的细胞外基质成分，并将其与传统基质胶按照一定比例配比，制备成的组织特异性基质胶，更贴近体内组织的微环境，更能模拟肿瘤对不同组织器官侵袭转移的能力；本试剂盒的制备及应用将为肿瘤转移的预测、个性化治疗以及科学研究提供更可靠有效的检测手段。

附图说明

图1是本发明SD大鼠肝、肺、肠、坐骨神经及颅骨的一种未脱细胞处理组形态图；

图2是本发明SD大鼠肝、肺、肠、坐骨神经及颅骨的一种脱细胞处理组形态图；

图3是本发明脱细胞前后的一种DNA含量图；

图4是本发明脱细胞前后的一种DNA1％琼脂糖凝胶电泳图；

图5是本发明乳腺癌细胞在颅骨、肝、肠、肺和坐骨神经组织特异性基质胶中的一种细胞侵袭实验图；

图6是本发明胃癌细胞在颅骨、肝、肠、肺和坐骨神经组织特异性基质胶中的一种细胞侵袭实验图；

图7是本发明胰腺癌细胞在颅骨、肝、肠、肺和坐骨神经组织特异性基质胶中的一种细胞侵袭实验图。

图1中：A、肝；B、肺；C、肠；D、坐骨神经；E、颅骨；

图2中：A、肝；B、肠；C、肺；D、坐骨神经；E、颅骨；

图3中：A、颅骨；B、肺；C、肠；D、肝；E、坐骨神经；

图4中：1、肝组织；2、肠组织；3、肺组织；4、颅骨；5、坐骨神经；M、marker；6、脱细胞处理后的肝组织；7、脱细胞处理后的肠组织；8、脱细胞处理后的肺组织；9、脱细胞处理后的颅骨组织；10、脱细胞处理后的坐骨神经组织；

图5中：A、颅骨ECM特异性侵袭；B、肺ECM特异性侵袭；C:、肝ECM特异性侵袭；D、坐骨神经ECM特异性侵袭；E、Matrigel侵袭；F、肠ECM特异性侵袭；

图6中：A、肝ECM特异性侵袭；B、肺ECM特异性侵袭；C、颅骨ECM特异性侵袭；D、肠ECM特异性侵袭；E、Matrigel侵袭；F、坐骨神经ECM特异性侵袭；

图7中：A、肝ECM特异性侵袭；B、肺ECM特异性侵袭；C、坐骨神经ECM特异性侵袭；D、颅骨ECM特异性侵袭；E、肠ECM特异性侵袭；F、Matrigel侵袭。

具体实施方式

下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

实施例：一种组织特异性侵袭试剂盒的制备方法，如图1-图7所示，所述制备方法为：通过手术获取动物的不同组织器官，组织器官包括骨、肺、肝、肾、胃、肠、胰腺、脑的组织器官，获取后对组织器官依次进行双蒸水冲洗处理、由洗脱剂混合溶液脱细胞处理和负压冷冻干燥处理，负压冷冻干燥后，在消化液中消化，形成细胞外基质水溶液，按照终浓度为10μg/μl与普通液态基质胶进行混匀，制成组织特异性基质胶，装盒后即成组织特异性侵袭试剂盒；所述洗脱剂混合溶液脱细胞处理后，在干重条件下脱细胞材料中DNA残余百分比小于5％，且经HE染色后未见明显细胞核残留，脱细胞组织中保留多种主要细胞外基质成分，包括胶原、纤维蛋白、蛋白多糖类以及无机物；所述洗脱剂混合溶液为TritonX-100、十二烷基硫酸钠(SDS)、氨水、DNA酶、RNA酶、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、脱氧胆酸钠(DOC)中的二种或二种以上；洗脱剂混合溶液震荡洗脱时间为3-4周，3天换一次洗脱液，摇床震荡速度为100转/分钟；所述洗脱剂混合溶液为1％TritonX-100+0.1％氨水组合；所述消化液为0.01MHCl+2mg/ml胃蛋白酶；所述组织特异性基质胶经0.22μm滤器过滤除菌；所述组织特异性基质胶采用传统基质胶实验方法对多种细胞的侵袭能力进行检测；所述多种细胞为各种类型细胞，包括胃癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、乳腺癌、前列腺癌、胶质瘤的肿瘤细胞以及各种正常细胞，所述的细胞为各种来源细胞，包括大鼠、小鼠、牛、猪、兔、狗、猴的来源组织。

本发明采用的技术方案如下：目的在于提供一种组织特异性侵袭试剂盒的制备方法的应用，以模拟不同肿瘤的侵袭微环境，所述试剂盒费用低、细胞脱除彻底、细胞外基质保存完好，有利检测肿瘤细胞的侵袭特性，为肿瘤转移的机制研究、临床防控提供了一种新的检测方法；

1.组织特异性侵袭试剂盒的制备：(1)手术获取动物组织，根据实验需求，动物种类可为小鼠、大鼠、兔、狗、猪、牛、猴的来源组织；组织种类可为神经、肝、肺、肠、肾、胃、胰腺、骨、脑组织。(2)对获取的组织采用水合脱细胞法进行脱细胞处理：a.骨组织使用0.1MHCl24h去矿处理后，用1％TritonX-100+0.1％氨水脱细胞处理4周。b.肝、肺、肠等内脏器官经门静脉缓慢灌注双蒸水洗涤12h，然后用1％TritonX-100+0.1％氨水洗脱72h后，剪成0.5cm²大小的组织碎块，用1％TritonX-100+0.1％氨水进行脱细胞震荡洗涤2周。c.坐骨神经组织去除周围脂肪组织和部分神经外膜后，去离子水冲洗6h，用3.0％TritonX-100震荡脱细胞12h，4.0％脱氧胆酸钠震荡脱细胞24h，然后用混合溶剂(乙醇：二氯甲烷＝1：2)洗涤24h去除脂质。对脱细胞后的各种组织进行DNA残余量检测、免疫组化检测，评价脱细胞效果，要求DNA残余度小于5％，HE染色后未见明显细胞核残留。(3)脱细胞组织经负压低温冷冻干燥后液氮中研磨成粉末，100mg脱细胞组织粉末加入5ml消化液(0.01MHCl+2mg/ml胃蛋白酶)，37℃摇床震荡消化72h制成水溶液，此水溶液即为组织特异性细胞外基质。(4)0.22μm滤器过滤除菌。

2.组织特异性侵袭试剂盒成品包括：试剂A：小鼠EHS肉瘤来源的普通基质，试剂B：组织特异性细胞外基质水溶液，浓度为20μg/μl，试剂B可根据不同实验需求选择神经、肝、肺、肠、肾、胃、胰腺、骨、脑组织任一一种组织细胞外基质水溶液或者选取其中几种组织细胞外基质水溶液的组合。

3.组织特异性侵袭试剂盒应用：(1)试剂A普通基质胶和试剂B组织细胞外基质4℃解冻成液体；(2)溶解后的试剂B组织细胞外基质水溶液与试剂A普通液态基质胶溶液进行混合，混合液中组织特异性细胞外基质终浓度为10μg/μl(冰上操作)；(3)取50μl无血清培养基，加入10μl组织特异性基质胶(试剂B和试剂A的混合液)，混匀(冰上操作)；(4)取50μl加入transwell小室上室(可参考以上操作配制复孔)。(5)37℃细胞培养箱中培养5h，凝固后取出；(6)胰酶消化获取所需肿瘤细胞，无血清培养基清洗细胞3次，计数并配制成5×10⁴个细胞/100μl的单细胞悬液；(7)用无血清培养基清洗侵袭胶1次；(8)每孔加入100μl单细胞悬液；(9)小室下室中加入500μl含有10％胎牛血清的完全培养基，37℃、5％CO₂条件下培养(时间根据不同肿瘤细胞侵袭特性而定)；(10)取出小室，PBS清洗2次；(11)4℃甲醛固定10min；(12)结晶紫室温染色5min；(13)PBS洗涤3次；(14)用棉签擦去小室内细胞，显微镜下观察。

经多种肿瘤细胞的侵袭实验结果表明，采用本专利所述方法可以实现肿瘤细胞在组织特异性侵袭胶中的侵袭能力检测，较好的模拟了体内肿瘤对不同组织的侵袭情况。

本实验例所用动物为SD大鼠，利用本实施例制备骨、肝、肠、肺和坐骨神经组织特异性侵袭试剂盒，并对相应试剂盒进行应用及评价，内容如下：

(1)动物术前准备

健康成年SD大鼠，250g-300g，雌雄不限，手术器械常规高压蒸汽灭菌，术前实验场地空气净化消毒；手术人员操作遵守无菌术原则，手术以标准外科无菌方式进行。

(2)脱细胞组织制备

a.肝、肺及肠脱细胞组织制备：大鼠麻醉后经门静脉逆行插管，将肝、肺及肠动静脉的大小分支依次小心结扎以防止渗漏，经门静脉缓慢灌注双蒸水洗涤12h，1％Triton X-100+0.1％氨水洗脱液72h，用蠕动泵控制速度在5ml/min，待所有灌注组织变为透明为止，取出所需组织，剪成0.5cm²大小的组织碎块，1％TritonX-100+0.1％氨水洗脱液摇床震荡洗涤2周，每3天更换一次洗脱液，摇床速度为100转/分钟，2周后双蒸水摇床震荡洗涤1h以去除残余的洗脱液，摇床速度为100转/分钟，期间多次更换新鲜双蒸水，脱细胞组织负压低温冷冻干燥后备用，相较于未脱组织(见图1A-C)，肝、肺及肠脱细胞组织较为透明(见图2A-C)。

b.坐骨神经脱细胞组织制备：先以10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射，待大鼠角膜反射消失，呼吸平稳，肌肉松弛，刺激大鼠足底无反应时，即麻醉成功，将大鼠固定，手术部位备皮，消毒，在股骨结节下0.5cm处，平行于坐骨神经干走行方向，用手术剪纵行切开长约1～1.5cm的皮肤切口，用止血钳钝性分离肌肉层，暴露梨状肌，取出游离的坐骨神经。将神经切成5cm左右，除去神经周围的脂肪组织和部分神经外膜；室温下用去离子水搅拌、冲洗6h，用3.0％TritonX-100震荡脱细胞12h；去离子水洗三次，每次15分钟；4.0％脱氧胆酸钠震荡脱细胞24h；无菌水洗涤三次，每次15分钟；冻干得到的pDNM支架(pDNM-S；用混合溶剂(乙醇：二氯甲烷＝1：2)洗涤24h去除脂质，用水冲洗，然后冻干备用。相较于未脱组织(见图1D)，坐骨神经脱细胞组织透明度增加(见图2D)。

c.骨脱细胞组织制备：SD大鼠无菌消毒后处死，取颅骨，去除软组织，将颅骨剪成0.5cm²大小的骨片，重量约为15mg/片。双蒸水摇床震荡洗涤1h，摇床速度为100转/分钟，期间多次更换新鲜双蒸水，待骨片上无明显残余的血液后0.1MHCl摇床震荡24h去除矿物质，24h后双蒸水摇床震荡洗涤1h，摇床速度为100转/分钟，期间多次更换新鲜双蒸水，随后1％TritonX-100+0.1％氨水洗脱液摇床震荡洗涤4周，每3天更换一次洗脱液，摇床速度为100转/分钟，4周后双蒸水摇床震荡洗涤1h以去除骨片上残余的洗脱液，摇床速度为100转/分钟，期间多次更换新鲜双蒸水。骨片负压低温冷冻干燥后备用。相较于未脱细胞骨片(见图1E)，脱细胞骨片质地柔韧、颜色较为透明(见图2E)。

(3)脱细胞组织效果评价

DNA残余量检测：取未脱细胞的肺、肝、肠、坐骨神经及颅骨和脱细胞后的肺、肝、肠、坐骨神经及颅骨(以未脱前重量选择)各约15mg，按照DNA含量提取试剂盒(TIANGEN公司)要求说明操作，计算DNA含量＝组织DNA含量/组织重量，脱细胞组与未脱细胞组骨片DNA含量见图3；DNA残余百分比＝脱细胞组织DNA含量/未脱细胞组织DNA含量，要求DNA残余百分比小于等于5％。本专利所述DNA残余百分比分别为颅骨组织4.2％±0.4％，肺组织4.5％±0.2％，肠组织4.6％±0.3％，肝组织4.0％±0.5％，坐骨神经组织4.4％±0.2％。对各组织提取的DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，未脱细胞组DNA条带清晰，脱细胞处理组DNA条带不明显(见图4)。

HE染色：4％多聚甲醛固定1h，乙醇梯度脱水，冰冻切片(5μm)，依次苏木素染色，1％盐酸酒精分化，伊红染色。未脱细胞组中存在大量紫染细胞核，而脱细胞组无明显细胞核存在。

(4)细胞外基质水溶液制备

将(2)中冷冻干燥后的脱细胞组织(骨、肝、肺、肠和坐骨神经)液氮研磨成粉末，每100mg脱细胞组织粉末加入5ml消化液(0.01MHCl+2mg/ml胃蛋白酶)，37℃摇床震荡消化72h，待全部组织消化完成后即制备成无色透明的细胞外基质水溶液，溶液终浓度为20μg/μl。

(5)过滤除菌

将上述的细胞外基质水溶液使用0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存备用。

(6)组织特异性基质胶侵袭试剂盒运用

实例1.组织特异性侵袭试剂盒在乳腺癌细胞中的运用

选取骨、肺、肝、肠及坐骨神经细胞外基质水溶液进行实验：a.冰上操作：15μl试剂A(普通基质胶)+15μl试剂B(骨细胞外基质水溶液(20μg/μl))混匀，其中骨细胞外基质浓度为10μg/μl；再加入150μl无血清培养基混匀制得骨组织特异性侵袭胶。b.取骨组织特异性侵袭胶50μl加入transwell小室上室，另备2个复孔进行验证。c.分别用试剂C(肺细胞外基质水溶液(20μg/μl))、D(肝细胞外基质水溶液(20μg/μl))、E(肠细胞外基质水溶液(20μg/μl))和F(坐骨神经细胞外基质水溶液(20μg/μl))按照a-b步骤配置肺、肝、肠和坐骨神经组织特异性侵袭胶；以不添加任何细胞外基质的普通基质胶做为本实验的对照组。d.37℃培养箱5h，凝固后取出备用。e.无血清培养基清洗乳腺癌细胞MDA-MB-231为3次，计数并制成细胞悬液，每孔准备1×10⁵个细胞，每种组织做三个复孔。f.无血清培养基清洗基质胶1次，每孔加入100μl细胞悬液；下室中加入500μl含有10％胎牛血清的完全培养基，37℃、5％CO2条件下培养15h。g.取出小室，PBS清洗2次，4℃甲醛固定10min，加入结晶紫室温染色5min，PBS洗涤3次，用棉签擦去小室内细胞，显微镜下观察(见图5)；结果显示乳腺癌细胞MDA-MB-231在五种不同组织来源的基质胶中侵袭能力具有显著差异，乳腺癌细胞MDA-MB-231在组织特异性基质胶中的侵袭能力为：颅骨ECM>肺组织ECM>肝组织ECM>坐骨神经ECM>Martrigel>肠组织ECM。

实例2.组织特异性侵袭试剂盒在胃癌细胞中的运用

选取骨、肺、肝、肠及坐骨神经细胞外基质水溶液进行实验：a.冰上操作：15μl试剂A(普通基质胶)+15μl试剂B(骨细胞外基质水溶液(20μg/μl))混匀，其中骨细胞外基质浓度为10μg/μl；再加入150μl无血清培养基混匀制得骨组织特异性侵袭胶。b.取骨组织特异性侵袭胶50μl加入transwell小室上室，另备2个复孔进行验证。c.分别用试剂C(肺细胞外基质水溶液(20μg/μl))、D(肝细胞外基质水溶液(20μg/μl))、E(肠细胞外基质水溶液(20μg/μl))和F(坐骨神经细胞外基质水溶液(20μg/μl))按照a-b步骤配置肺、肝、肠和坐骨神经组织特异性侵袭胶；以不添加任何细胞外基质的普通基质胶做为本实验的对照组。d.37℃培养箱5h，凝固后取出备用。e.无血清培养基清洗胃癌细胞MKN-45为3次，计数并制成细胞悬液，每孔准备2×10⁴个细胞，每种组织做三个复孔。f.无血清培养基清洗基质胶1次，每孔加入100μl细胞悬液。下室中加入500μl含有10％胎牛血清的完全培养基，37℃、5％CO2条件下培养48h。g.取出小室，PBS清洗2次，4℃甲醛固定10min，加入结晶紫室温染色5min，PBS洗涤3次，用棉签擦去小室内细胞，显微镜下观察(见图6)。结果显示胃癌细胞MKN-45在五种不同组织来源的基质胶中侵袭能力具有显著差异，胃癌细胞MKN-45在组织特异性基质胶中侵袭能力为：肝组织ECM>肺组织ECM>颅骨ECM>肠组织ECM>Martrigel>坐骨神经ECM。

实例3.组织特异性侵袭试剂盒在胰腺癌细胞中的运用

选取骨、肺、肝、肠及坐骨神经细胞外基质水溶液进行实验：a.冰上操作：15μl试剂A(普通基质胶)+15μl试剂B(骨细胞外基质水溶液(20μg/μl))混匀，其中骨细胞外基质浓度为10μg/μl；再加入150μl无血清培养基混匀制得骨组织特异性侵袭胶。b.取骨组织特异性侵袭胶50μl加入transwell小室上室，另备2个复孔进行验证。c.分别用试剂C(肺细胞外基质水溶液(20μg/μl))、D(肝细胞外基质水溶液(20μg/μl))、E(肠细胞外基质水溶液(20μg/μl))和F(坐骨神经细胞外基质水溶液(20μg/μl))按照a-b步骤配置肺、肝、肠和坐骨神经组织特异性侵袭胶；以不添加任何细胞外基质的普通基质胶做为本实验的对照组。d.37℃培养箱5h，凝固后取出备用。e.无血清培养基清洗胰腺癌细胞PANC-1为3次，计数并制成细胞悬液，每孔准备5×10⁴个细胞，每种组织做三个复孔。f.无血清培养基清洗基质胶1次，每孔加入100μl细胞悬液。下室中加入500μl含有10％胎牛血清的完全培养基，37℃、5％CO2条件下培养6h。g.取出小室，PBS清洗2次，4℃甲醛固定10min，加入结晶紫室温染色5min，PBS洗涤3次，用棉签擦去小室内细胞，显微镜下观察(见图7)。结果显示胰腺癌细胞PANC-1在五种不同组织来源的基质胶中侵袭能力具有显著差异，胰腺癌细胞PANC-1在组织特异性基质胶中侵袭能力为：肝组织ECM>肺组织ECM>坐骨神经ECM>颅骨ECM>肠组织ECM>Martrigel。

需要指出的是，本实施例所述制备方法，还可用于制备小鼠、牛、猪、兔、狗其他物种的组织特异性侵袭试剂盒，以及可用于检测其他各种肿瘤细胞。

最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明不限于上述实施例，还可以有许多变形。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均应认为属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种组织特异性侵袭试剂盒的制备方法，其特征在于所述制备方法为：通过手术获取动物的不同组织器官，组织器官包括骨、肺、肝、肾、胃、肠、胰腺、脑的组织器官，获取后对组织器官依次进行双蒸水冲洗处理、由洗脱剂混合溶液脱细胞处理和负压冷冻干燥处理，负压冷冻干燥后，在消化液中消化，形成细胞外基质水溶液，按照终浓度为10μg/μl与普通液态基质胶进行混匀，制成组织特异性基质胶，装盒后即成组织特异性侵袭试剂盒。

2.根据权利要求1所述的一种组织特异性侵袭试剂盒的制备方法，其特征在于所述洗脱剂混合溶液脱细胞处理后，在干重条件下脱细胞材料中DNA残余百分比小于5％，且经HE染色后未见明显细胞核残留，脱细胞组织中保留多种主要细胞外基质成分，包括胶原、纤维蛋白、蛋白多糖类以及无机物。

3.根据权利要求1或2所述一种组织特异性侵袭试剂盒的制备方法，其特征在于所述洗脱剂混合溶液为Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)、氨水、DNA酶、RNA酶、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、脱氧胆酸钠(DOC)中的二种或二种以上；洗脱剂混合溶液震荡洗脱时间为3-4周，3天换一次洗脱液，摇床震荡速度为100转/分钟。

4.根据权利要求3所述一种组织特异性侵袭试剂盒的制备方法，其特征在于所述洗脱剂混合溶液为1％Triton X-100+0.1％氨水组合。

5.根据权利要求1所述的一种组织特异性侵袭试剂盒的制备方法，其特征在于所述消化液为0.01M HCl+2mg/ml胃蛋白酶。

6.根据权利要求1所述的一种组织特异性侵袭试剂盒的制备方法，其特征在于所述组织特异性基质胶经0.22μm滤器过滤除菌。

7.根据权利要求1或2或5或6所述的一种组织特异性侵袭试剂盒的制备方法，其特征在于所述组织特异性基质胶采用传统基质胶实验方法对多种细胞的侵袭能力进行检测。

8.根据权利要求7所述一种组织特异性侵袭试剂盒的制备方法，其特征在于所述多种细胞为各种类型细胞，包括胃癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、乳腺癌、前列腺癌、胶质瘤的肿瘤细胞以及各种正常细胞，所述的细胞为各种来源细胞，包括大鼠、小鼠、牛、猪、兔、狗、猴的来源组织。