CN105188787A - 用于组织移植物去细胞化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于处理组织以产生与受体免疫相容的天然、无细胞的替代组织的材料和方法。根据本发明，用其中只使用两性洗涤剂（例如不包括阴离子洗涤剂）的洗涤液清洗收获的组织。在经两性洗涤剂提取之后，用缓冲系统洗涤组织以帮助清除细胞组分和洗涤剂。在一个实施例中，本发明涉及一种支持轴突再生、引导轴突朝向远端神经末端和/或免疫耐受的神经移植物的替代组织。优选地，所述神经移植物保留主要的细胞外基质支架以及促进贯穿神经移植物的神经再生的生物组分。

Description

用于组织移植物去细胞化的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请US61/794,012的权利，所述申请案全文以引证的方式并入本文中。
背景技术
生物医学工程在开发可用于帮助愈合的组织的过程中面临许多挑战。例如，“替代”组织应促进组织再生。在这种情况下，所述新组织必须与受体组织相容以便相邻细胞接受替代物。重要地是，替代组织应克服(或避免)通常由于向生物系统添加“外来物”而引起的免疫反应。
而且，替代组织应展示它所替代的组织的特性和功能。例如，替代组织应展示与原始组织类似的机械特性和结构特性，或至少不干扰原生环境。替代组织可作为支架和/或保持生物学特性以促进细胞再生。最后，替代组织不应刺激疤痕形成，疤痕形成会限制组织再生或抑制深层组织的天然功能。
组织工程学的一个特别具有挑战性的实施例是制造可用于帮助切断的神经再生的神经移植物。在直接神经修复过程中，当切断的神经末端再接合(没有间置移植物)时，轴突会试图从近端神经向远端神经重新生长。由于这个原因，在神经损伤之后，远端神经经受被称为华勒氏变性(Walleriandegeneration)的过程，其涉及神经单元(nerveelement)(包括非功能性远端轴突及其髓鞘)的崩解和清除。部分地因为此过程，轴突碎片和髓磷脂碎片长期被认为具有减少神经再生的生长抑制作用并且可能是轴突生长的机械屏障。
大量证据表明当华勒氏变性过程被推迟时神经再生变慢了。因此，人们已普遍接受神经单元的清除改善了远端神经的轴突生长。这个假定已被外推到神经移植并且使人相信为了促进轴突生长，也必须将细胞碎片从神经移植物移除。移除剩余的细胞物质也被认为是使组织中的病原体减到最少以及除去可能导致移植物免疫排斥的免疫原性物质所必需。因此，用于神经移植物的处理方法通常包括严格的去细胞化技术，甚至代价为破坏支持再生过程的细胞外基质(ECM)结构和神经移植物的完整性。
神经损伤常常导致用于直接修复的干净末端(cleanends)的损失或由神经组织损伤而造成缺口。在该情况下，神经修复要求间置移植物来桥接缺失处并恢复神经连续性。
例如，美国专利号为7,402,319的专利(该专利全文并入本文中)描述了一种无细胞的神经同种异体移植物，其可以恢复神经连续性并且在合适环境下可以促使神经再生。这类神经移植物经将神经组织浸泡于含有硫代甜菜碱和阴离子表面活性洗涤剂(例如曲拉通(Triton)X-200)的若干系列溶液中而获得，所述系列溶液用于使神经组织脱去细胞。
Hudson等人申请了一种含有曲拉通X-200TM、硫代甜菜碱-16和硫代甜菜碱-10的用于大鼠神经的去细胞化技术，并报告了极高的提取水平。(HudsonTW,LiuSY,SchmidtCE.TissueEng.10:1346-58,2004)。然而，啮齿动物神经含有单个神经束(簇)且啮齿动物神经的外神经鞘与较大动物的神经的相似性较小。较大动物(例如兔、人)的大部分神经具有嵌入于胶原性内在神经外膜(围绕神经束的结缔组织)的多个神经束。人神经的鞘和束内结构是可扩张的，且对神经完整性和渗透性(包括影响组织提取的特性)具有明显影响。因此，当应用于来自较大动物的神经时，关于啮齿动物神经的去细胞化和提取的知识是所期望的提取的最佳提示。
总而言之，对改善组织替代物(特别是在神经组织环境中)仍有需要。经改善的组织替代物应维持它所替代的组织的原生结构和生物活性特征，包括例如层粘连蛋白活性，并且能够在必要时结合生物活性化合物或分子以促进快速再生，并刺激组织修复和无疤痕的再生，疤痕可减低组织可动性和完整性。
发明简述
本发明提供了用于制备组织移植物的新颖方法和组合物，所述组织移植物保持原生结构和完整性以及改善再生所需的生物学特性。
本发明的组织移植物提供了一种天然替代组织或可通过简单制备步骤获得的移植物。本发明的方法特定地破坏免疫原性细胞组分而不会显著改变天然细胞外结构。有利地，组织保持促进移植物中细胞再生的生物学特性。原生细胞外基质(ECM)的结构被保持，具体地说，在神经移植的情况下，基膜和神经内膜/内皮细胞层保持天然和通常的原始结构。
因此，在一个实施例中，本发明提供了一种神经移植物，其支持轴突再生、引导轴突朝向远端神经末端并且免疫耐受。无细胞神经移植物可以是例如，同系移植物、自体移植物、同种异体移植物或异种移植物。
在一个实施例中，本发明提供了一种制备组织替代物的方法，所述方法包括以下步骤：在没有任何离子型洗涤剂的情况下(包括任何阴离子洗涤剂)，在包含至少一种两性洗涤剂的溶液中洗涤替代组织，然后在缓冲盐的系列溶液中洗涤替代组织以除去多余的两性洗涤剂。这个方法比当前技术的方法更简单更便宜，且得到具有更好的处理特性和更好的促进再生特性的替代组织。
在一个特定实施例中，根据本发明使用的两性洗涤剂是硫代甜菜碱-10(SB-10)和/或硫代甜菜碱-16(SB-16)。
本发明还提供一种去细胞化替代组织。在一个实施例中，替代组织可以形成为缝合处、管、片、膜或支架的一部分，以递送到受体。优选地，替代组织保留了在移植到受体之后促进再生和/或不引起免疫反应的生物组分。
在另一个实施例中，本发明提供了用于组织替代的试剂盒，其包含去细胞化替代组织。该试剂盒还可包括一或多种用于使本发明的替代组织再悬浮的溶液，例如药理学可接受的缓冲无菌生理盐水溶液。此外，所述试剂盒还可包括一小瓶具有细胞或其他活性剂的溶液，其可被加入以促进组织再生(例如，施万细胞(Schwanncell)和/或细胞因子)。所述试剂盒可进一步包括说明书或小册子，给用户提供所述无细胞替代组织的详细说明。
在一个特定实施例中，本发明提供了一种移植物，其支持轴突再生、引导轴突朝向远端神经末端并且免疫耐受。在一个实施例中，所述移植物是神经移植物。移植物可在去细胞化之前被冷冻，然后储存并搁置以冷冻使用。另一个实施例是用于不要求冷冻保藏的特别应用而制备神经移植物；在那种情况下，可使温度降低或升高，这取决于使用前储存移植物的溶液，例如包括一或多种防腐剂和/或抗微生物剂。
在一个实施例中，支持再生的移植物还可包括帮助抑制受体对移植物植入的免疫反应的一或多种物质。例如，本发明的移植物可包括佛波酯佛波醇豆蔻乙酸酯(phorbolesterphorbolmyristateacetate，PMA)以在CD4+T细胞介导的免疫反应减少的情况下促进移植物植入。
附图说明
图1苏木紫和曙红染色的兔神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的兔神经组织(DC2；图B)以及按照本发明的方法处理的兔神经组织(DC3；图C)。
图2Hoescht染色的兔神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的兔神经组织(DC2；图B)以及按照本发明的方法处理的兔神经组织(DC3；图C)。
图3S-100免疫染色的兔神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的兔神经组织(DC2；图B)以及按照本发明的方法处理的兔神经组织(DC3；图C)。
图4苏丹黑染色的兔神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的兔神经组织(DC2；图B)以及按照本发明的方法处理的兔神经组织(DC3；图C)。
图5NAP-4神经丝染色的兔神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的兔神经组织(DC2；图B)以及按照本发明的方法处理的兔神经组织(DC3；图C)。
图6层粘连蛋白免疫染色的兔神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的兔神经组织(DC2；图B)以及按照本发明的方法处理的兔神经组织(DC3；图C)。
图7苏木紫和曙红染色的人神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的人神经组织(DC2；图B)以及按照本发明的方法处理的人神经组织(DC3；图C)。
图8Hoescht染色的人神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的人神经组织(DC2；图B)以及按照本发明的方法处理的人神经组织(DC3；图C)。
图9S-100免疫染色的人神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的人神经组织(DC2；图B)以及按照本发明的方法处理的人神经组织(DC3；图C)。
图10苏丹黑染色的人神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的人神经组织(DC2；图B)以及按照本发明的方法处理的人神经组织(DC3；图C)。
图11NAP-4神经丝免疫染色的人神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的人神经组织(DC2；图B)以及按照本发明的方法处理的人神经组织(DC3；图C)。
图12层粘连蛋白免疫染色的人神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教示导的方法处理的人神经组织(DC2；图B)以及按照本发明的方法处理的人神经组织(DC3；图C)。
图13A经(A)单独的缓冲液和(B)由Hudson等人描述的去细胞化洗涤剂(硫代甜菜碱-10、硫代甜菜碱-16和曲拉通X-200TM)去细胞的大鼠神经移植物的冷冻培养分析。将神经沿纵轴冷冻切片并安放在盖玻片上。将分离神经元接种在组织切片上并培养24小时。随后将冷冻培养物固定并且将测试神经元免疫染色。当神经移植物的促进生长的活性几乎全被严格的洗涤剂去细胞化消除时，观察到在单独缓冲液条件下有大量轴突生长。
图13B曲拉通X-200TM对神经移植物神经突促进活性的影响。在有和没有曲拉通X-200TM的情况下经由Hudson等人的方法将神经移植物样品去细胞化。将神经沿纵轴冷冻切片并安放在盖玻片上。将分离神经元接种在组织切片上并培养24小时。经由数字图象分析给神经突长度评分。数据表示在2个独立的实验中来自4个组织切片的超过500个轴突的平均(±SE)得分。
图14单个洗涤剂对纯化的层粘连蛋白的神经突促进活性的影响。纯化的层粘连蛋白-1与如下的单个洗涤剂混合：对照物(单独缓冲液)、硫代甜菜碱-10(125mM)、硫代甜菜碱-16(0.6mM)和曲拉通X-200(0.14％)。将混合物大量透析且随后添加至组织培养孔中以形成基质，在其上接种分离的神经元。在培养基中24小时之后，测量神经突的长度。数据表示从来自4个独立实验中重复进行的稀释系列中的平均得分计算的特异活性(ED50)。
图15在兔神经同种异体移植物模型中的成功的神经再生。兔腓骨神经中的0.5cm缺口用经由本发明方法处理的1.2cm神经移植物来修复。4周之后检查移植物。A)苏木紫和曙红染色表明极佳的移植物完整性且并入受体神经中。在移植物内明显有血管再生和细胞浸润。在24个受体中的任一个中均没有发现发炎或移植排斥的迹象。B)β-微管蛋白III免疫标记(对轴突为特异的)显示在整个移植物中有大量的轴突再生。C)S100免疫标记显示大量的受体组织施万细胞浸润了与再生轴突密切相关的移植物，指示有功能的神经再生。
图16很长的神经同种异体移植物成功再生。兔腓骨神经中的5cm缺口用经由本发明方法处理的7cm神经移植物来修复。26周之后检查移植物。A)苏木紫和曙红染色表明极佳的移植物完整性且并入受体神经中。在移植物内明显有血管再生和细胞浸润。在10个受体中的任一个中均没有发现发炎或移植排斥的迹象。B)NAP-4神经丝免疫标记(对轴突为特异的)显示在整个移植物中有大量的轴突再生。C)S100免疫标记显示大量的受体组织施万细胞浸润与再生轴突密切相关的移植物，指示有功能的神经再生。D)在移植物的受体神经远端发现大量的神经丝免疫阳性轴突，表明神经再生成功地横越7厘米移植物并向远端前进到靶组织。
发明详述
本文中使用的术语具有与本发明相关的领域的一般技术人员所普遍理解的含义。诸如“a”、“an”和“the”等术语不是指仅仅单一的实体，而是包括特定的例子可用来说明的一般类别。本文中的术语用来描述本发明的特定实施例，但它们的用法不限制本发明，除非是权利要求书中概述的。本文中使用的所有技术术语和科学术语具有本发明所属技术领域的一般技术人员所普遍理解的含义，除非另有规定。
在一个实施例中，本发明提供一种保留细胞外结构以及周围神经组织的生物学特性的神经同种异体移植物。同种异体移植物是通过一种改进的专有的去细胞处理来制备。去细胞化方法从神经组织中溶解细胞膜，从而消除导致同种异体移植排斥的抗原。
本发明进一步提供了制备基于天然组织的移植物的方法，所述移植物具有免疫耐受性并且保留原生组织的内在结构和架构。本文中使用的术语“替代组织”用来描述已从供体动物(活的或尸体)移除并且已根据本发明处理的一种组织。
本发明中的移植物的用途包括但不限于：1)作为生物相容的生物材料，一般是非免疫原性的；2)作为促进组织特异性和受体特异性的组织再生的因素的结构基础；以及3)作为一种研究工具来研究受体对替代组织结构的反应。本发明还提供一种替代组织，其一般为具有可处理、生物学、生物活性和/或生物可降解特性的无细胞组织。
根据本发明，现已发现，与传统的担心相反，在组织移植物中绝大多数残余细胞组分是没有问题的；在植入之后宿主细胞最终将他们除去。即使残余的MHC分子可能引起排斥反应也不成问题。为引起显著免疫反应，MHC组分必须作为细胞膜中紧密结合的复合物而保留。根据本发明，由于细胞膜和MHC复合物容易被温和(非离子和两性离子)洗涤剂溶解，因此这些担心得以缓解。
传统的去细胞化技术要求苛刻的试剂和强效的阴离子洗涤剂。根据本发明已出人意料地且有利地确定大量的细胞提取对植入过程并非有利，事实上是不利的。相反，温和的提取足以使组织同种异体移植物免疫相容且有利于促进组织修复所需的移植物ECM的保留。
遗憾的是，用离子型洗涤剂(诸如曲拉通X-200TM)洗涤神经组织已显示会减少层粘连蛋白活性。层粘连蛋白是基底层中的主要蛋白质，其对于经由影响细胞分化、迁移和粘附的组织再生很重要。例如，层粘连蛋白是沿神经轴突生长的主要底物。
因此，根据本发明，温和的两性洗涤剂足以使细胞成分充分分散并简单地使组织移植物免疫相容，而不会使基本的内在生物活性变性。
定义
本文中使用的术语“无细胞的”是指没有活细胞的组织。
术语“去细胞的”是指其中细胞被解离且细胞物质被提取的组织。细胞的移除程度取决于组织的确切来源、用于提取细胞的方法以及细胞移除的需要。经由细胞移除，本发明可使用大量提取方法。细胞移除量可以从非常小到接近100％。当使用非自体组织来源或在组织相容性方面不匹配的组织来源时，所实现的细胞解离和/或提取使得移植物免疫耐受。为减少对受体免疫排斥的担心，同种异体移植要求的组织提取比异种移植少。因此，表明与两性洗涤剂的接触时间较长。
本文中使用的术语“移植物”是指来源于供体用于植入受体的生物材料。移植物可来自任何动物来源，包括人类，无论是来自尸体或活供体。供体优选为哺乳动物。
术语“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物受体，包括人类、家养动物和农场动物，以及动物园动物、运动动物或玩赏动物，诸如狗、马、猫、猪和牛。
用于组织移植物去细胞化的方法
根据本发明使用的组织可使用本领域技术人员熟知的标准技术来收集。在一个优选实施例中，组织(可以是例如神经组织)在其被收集后被冷冻。
在优选实施例中，在本发明的方法中使用盐和缓冲溶液中的至少一种洗涤剂。洗涤剂组分优选包含至少一种两性洗涤剂且不包括使用任何大量的离子型洗涤剂(如阴离子洗涤剂)。在一个优选实施例中，所述方法不使用曲拉通X-200TM。
本发明中所用的洗涤剂是指使组织内的细胞特异性破裂，但不解离细胞外结构或结构蛋白(包括例如细胞外基质和/或层粘连蛋白)的洗涤剂。细胞碎片可能会如本文中所述那样被移除，例如，经由用缓冲溶液洗涤和/或物理上移除其他非结构性碎片，诸如脂肪。与未经处理的组织移植物相比，本发明的替代组织引起显著减少的免疫反应，因为表面细胞抗原已经解离或移除。
在一个特定实施例中，获得神经组织并且其被包含至少一种两性洗涤剂的洗涤液洗涤。本申请中使用的术语“洗涤剂”与术语“表面活性剂”可互换。
两性洗涤剂可以大致描述为包括可作为酸以及碱起作用的分子(或离子)。两性表面活性剂可包括可提供或接受质子(H+)的两性分子。这些都受pH值变化的影响很大。他们在pH值大于或等于8时作用类似于阴离子洗涤剂。他们在pH值介于8与6之间时作用类似于非离子型洗涤剂。他们在pH值低于4时作用类似于阳离子洗涤剂。在高pH值时，洗涤能力增加；在低pH值时，洗涤能力降低。在一个优选实施例中，组织与pH值6至8时为两性的洗涤剂接触。在一个特定实施例中，组织与两性洗涤剂的接触在pH值介于与8之间进行。
两性离子类别的清单和这些表面活性剂的种类在1975年12月30日颁发给Laughlin和Heuring的美国专利第3,929,678号中提供。进一步例子在"SurfaceActiveAgentsandDetergents"(卷I和卷II，Schwartz、Perry和Berch)中提供。
两性离子表面活性剂是两性表面活性剂的子集，所述两性表面活性剂包括两性电解质。通常，两性离子表面活性剂包括在分子内不同位置具有正电荷和负电荷(注意非偶极子)的中性分子。两性离子一般含有阳离子和阴离子基团，其离子化至分子的等电位区中几乎相等的程度，且可在正负电荷中心之间产生强的“内盐”吸引力。甜菜碱和磺基甜菜碱(sultaine)表面活性剂是供本文中使用的示例性的两性离子表面活性剂。在一个实施例中，所用的表面活性剂不是两性离子表面活性剂。
组织去细胞化方案中使用的洗涤剂的浓度(包括两性硫代甜菜碱和阴离子曲拉通X-200TM)是基于他们的“临界胶束浓度”。此浓度报告于文献或制造商的说明书中，且是洗涤剂效力的最低需要量。本发明的独特缓冲基本原理是较大的胶束提取较好。较高的盐浓度增加胶束大小。
因此，例如，在本发明的提取缓冲液中形成大胶束，其优选具有生理盐度或更大盐度。这些大胶束对于溶解细胞组分有利。在优选实施例中，洗涤剂的浓度为临界胶束浓度，或更高。
在漂洗缓冲液中形成较小胶束，其具有低的(低于生理学盐度)渗透压/盐度/渗透性或无渗透压/盐度/渗透性。根据本发明，已发现小胶束对于扩散出组织较好并且低渗透压/盐度/渗透性漂洗(在高盐度洗涤之后)造成向外流动以及有助于提取。
在本发明的优选实施例中，用具有高浓度NaCl的溶液进行的一或多次初始组织洗涤经由提供大胶束而维持可溶性并帮助提取。用具有较低NaCl浓度的溶液进行的后续漂洗减少胶束大小并改善向组织外的扩散。
在优选实施例中，神经与提取组合物(优选含水组合物)接触，所述提取组合物包括包含一或多种两性洗涤剂或由一或多种两性洗涤剂组成的洗涤剂组分。优选地，在提取组合物的洗涤剂组分中不存在阴离子洗涤剂。“不存在”阴离子洗涤剂，如本文中阐明的概念，意思指没有足够的离子型洗涤剂来分解组织的ECM。因此，没必要要求完全不存在(即0％)。优选地，阴离子洗涤剂的量小于0.14、0.10、0.05、0.01或0.005％。
两性洗涤剂可以是例如SB-10和/或SB-16。洗涤剂浓度应为至少临界胶束浓度。SB-10的浓度可以是例如100、125、150、175、200或200mM以上。SB-16的浓度可以是例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0或1.0mM以上。
除洗涤剂组分之外，提取组合物还可包含一或多种盐类和/或缓冲系统。盐浓度应为生理学盐度或高于生理学盐度。盐浓度的下限可为例如100、125、150、175、200或200mM以上的NaCl，且上限可为例如500、450、400、350、250或250mM以下的NaCl。pH值可为例如6.5到8.5。优选pH值是生理学pH值。在一个实施例中，使用磷酸钠缓冲液来维持pH值在大约7.2。
可使组织与此组合物在温和搅动下接触优选5、10、15或15小时以上的一段时间。
可选地，在新鲜(fresh)提取组合物情况下可使用一或多个额外提取步骤，所述新鲜提取组合物中的成分可以与第一提取组合物相同或不同。随后，可将此后续提取组合物与其所包含的组织搅拌1、2、3、4、5、6小时或6小时以上。
提取步骤之后优选用提取缓冲液和/或生理盐水洗涤，优选地，随后是用漂洗缓冲液洗涤。漂洗缓冲液可与提取缓冲液具有相同或不同的缓冲系统且通常还具有相同或相似pH值。然而漂洗组合物的盐浓度优选小于提取组合物的盐度。在一个实施例中，漂洗组合物没有盐度。
处理步骤通常会在20℃到30℃下进行，且优选在室温或接近室温(例如25℃)。
在一个优选实施例中，所述方法包含用大量漂洗缓冲液进行最终洗涤且可将组织再悬浮于漂洗缓冲液中，随后放入生理缓冲盐水中并优选冷冻直到使用。
本发明中使用的缓冲系统和两性洗涤剂与Hudson等人相比达成相同或较好的去细胞化效果，Hudson等人使用苛刻的阴离子洗涤剂提取。经由Hudson等人的方法处理的人神经显示比大鼠神经所报道的细胞残余物实质上更多的细胞残余物。此外，当应用于兔和人神经时，Hudson等人使用的方法和本发明的方法实现几乎相同的细胞提取水平。因此，如Hudson等人描述的添加阴离子洗涤剂曲拉通X-200TM在去细胞化方面没有明显优势，且如上所述，不利于神经鞘结构的促进生长特性。此外，Hudson等人使用"新鲜的"神经，相比较而言，本发明优选使用获得后立即冷冻的神经，这还允许更有效利用来自人尸体供体的神经。
有利地，本发明的去细胞化方法获得具有极佳生理学特性及结构特性以帮助和促进组织再生的组织移植物。例如，保留高比例的细胞外基质。在优选实施例中，此百分比大于50、60、70、75、80、85、90、95或99％。
在神经移植物的特定情况下，在去细胞化处理之后，保留大于50、60、70、75、80、85、90、95或99％的层粘连蛋白。这可以经由例如观察(双盲)计分或数字图象分析与未处理的对照物供体神经对比来测量。
根据本发明制造的神经移植物的有利特性还可测量它们的促进神经突的活性，如通过生物测定所测量。一种此类生物测定是冷冻培养测定。在优选实施例中，根据本发明的去细胞化技术制造的神经移植物保持它们的神经突促进活性的50、60、70、75、80、85、90、95或99％，与例如只用缓冲洗涤液处理的对照神经相比。
在一个实施例中，根据本发明将包括神经、肌肉、胎盘和血管的组织去细胞化并用作移植物来修复神经。在一个优选实施例中，根据本发明的去细胞化神经被用作原位移植物来修复神经。
在一个实施例中，根据本发明的去细胞化神经被用于兽医同种异体的应用，包括但不限于，马神经移植于马体内、猫神经移植于猫体内，以及狗神经移植于狗体内。
在另一个实施例中，根据本发明的去细胞化神经被用于异种移植应用中，包括动物供体神经移植于人受体体内和动物供体神经移植于不同物种的动物受体体内。
本发明去细胞化的方法除用于神经修复之外，还可用于组织移植物，包括但不限于骨移植物、肠移植物、血管移植物、韧带移植物、腱移植物和心脏瓣膜移植物。
在本发明的一个优选实施例中，将移植物在去细胞化以后冷冻。此便于γ辐照的良好状态(最常见的杀菌方法)。此外，冷冻的最终移植物产品的运输和储存更实际。
移植物的细胞再增殖
虽然细胞被从本发明的组织解离和提取，不过向替代组织再引入一或多种不同类型的细胞还可以是可接受的且常常是必需的。这些细胞可以直接从供体、从来自供体的细胞的培养物或从细胞培养物获得。供体细胞一般通过活组织检查和使用标准条件在培养物中生长至细胞覆盖来获得。受体可根据需要而受免疫抑制，例如，若需要，使用类固醇和/或其他免疫抑制药物的方案。在一个新的组织或组织等价物生长时，受体的免疫抑制可提供替代组织移植物的免疫保护。
此外，出于移植植入、免疫疗法、认知功能、组织再生、修复或重建的目的，本发明的替代组织可用来在替代组织的立体架构/结构内提供多种细胞类型，包括基因改变的细胞、克隆体或移植物。此类细胞的例子包括(但不限于)软骨细胞、成骨细胞、肌细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、免疫细胞、胰腺细胞、纤维母细胞、肝细胞、上皮细胞、胰岛细胞、神经细胞，和其他主要用作合成和分泌或代谢物质的细胞，以及肠、肾、心脏、脑、脊髓、肌肉、骨骼、肝、胃、皮肤、肺、生殖系统、神经系统、免疫系统、脾、骨髓、淋巴结、腺的活检或克隆细胞体。
作为生物活性分子的载体的移植物
本发明的替代组织还可包括配制成具有一或多种活性物种的生物活性分子，以便使替代组织变成为一或多种活性物种的载体。本发明的试剂盒或替代组织可包括掺入所添加的聚合物或聚合物溶液(例如，聚合物支架)中的活性剂，或使用本领域技术人员显而易见的技术可直接连接至替代组织表面或内部的活性剂。例如，活性剂可通过离子键结、共价键结和/或使用交联剂(例如可裂解的交联剂)键结而固化在无细胞替代组织上和进入无细胞替代组织中。
活性剂可以是药物或其他生物活性化合物；因此，当用于身体内时，本发明的替代组织可以是用于递送药物或其他生物活性化合物的微载体。生物活性化合物的例子是蛋白、肽、多糖、核酸、寡核苷酸、天然的和合成的有机或无机分子，以及那些用于治疗、预防或诊断目的的生物分子。药物可包括抗生素、抗病毒剂、化学治疗剂、免疫抑制剂、生长因子、抗血管生成剂、激素、消炎剂，对血管流量、细胞新陈代谢有影响的药物，或针对一或多种疾病有效的药物，和/或它们的组合。
其他活性剂也可以包括在本发明的替代组织或试剂盒中，例如，非甾体类抗炎药(NSAID)，诸如丙酸衍生物；乙酸衍生物；灭酸(fenamicacid)衍生物；联苯甲酸衍生物；和昔康类(oxicams)。供本发明的试剂盒或替代组织使用的止痛剂包括对乙酰氨基酚(acetominophen)和非那西汀(phenacetin)。
本文中涉及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开案均以引证的方式在它们与本说明书的明确指示不相抵触的程度上全文(包括所有图和表)并入本文中。
以下是说明实践本发明的方法的实例。这些实例不应被解释为限制性的。除非另有说明，否则所有百分比是以重量计的且所有溶剂混合物比例是以体积计的。
实施例1——去细胞化过程
所有步骤应采用防腐技术和无菌溶液。以下是本发明的去细胞化过程的一个实施例的步骤。
1.从供体切除神经并冷冻储存。
2.在室温下解冻所述神经。用冰冷的水漂洗。浸没在大量冰冷的水中。在4℃下轻轻搅拌6小时(或更长时间)。
3.将所述神经浸没在提取缓冲液(10mM磷酸钠缓冲液，pH7.2和150mMNaCl)或任何生理盐水中的大量125mM(或浓度更大)的硫代甜菜碱-10中。在25℃(接近室温)下缓慢搅拌15小时(或更长时间)。
4.替换为提取缓冲液或任何生理盐水中的大量新鲜的125mM(或浓度更大)的硫代甜菜碱-10。在25℃下搅拌6小时(或更长时间)。
5.用大量的提取缓冲液或任何生理盐水洗涤。在25℃下搅拌60分钟(或更长时间)。
6.用大量漂洗缓冲液(10mM磷酸钠缓冲液，pH7.2)或具有极低渗透压(没有盐度)的任何缓冲液洗涤。在25℃下搅拌60分钟(或更长时间)。
7.将所述神经浸没在大量提取缓冲液或任何生理盐水中的0.6mM(或浓度更大)的硫代甜菜碱-16中。在25℃下搅拌15小时(或更长时间)。
8.替换为提取缓冲液或任何生理盐水中的大量新鲜的0.6mM(或浓度更大)的硫代甜菜碱-16。在25℃下搅拌6小时(或更长时间)。
9.用大量的提取缓冲液或任何生理盐水洗涤。缓慢搅拌所述神经30分钟(或更长时间)，然后替换为新鲜的提取缓冲液或任何生理盐水。在4℃搅拌下洗涤15小时。
10.用大量漂洗缓冲液洗涤。缓慢搅拌以使所述神经再悬浮，然后替换为具有极低渗透压(没有盐度)的新鲜漂洗缓冲液或任何缓冲液。在4℃搅拌下洗涤3小时。
11.放置在生理缓冲盐水中并冷冻储存。
实施例2——与兔神经去细胞化方法的比较
按照如上所述的本发明制备的移植物被称为DC3移植物。将DC3移植物与正常的(未处理的)兔神经和经由Hudson等人(TissueEngineering10:1346-1358,2004)和美国专利第7,402,319号所描述的方案处理的兔移植物(本文中称为DC2移植物)相比较。
通过几种组织学技术评价来自两种处理方法的DC2和DC3移植物。对每个评价的结果进行半定量计分(0＝未提取、1＝部分提取、2＝大部分提取、3＝完全提取以及R＝重新分配)。在图1-6中显示两种洗涤剂处理方案的结果(DC2、DC3)和正常的神经对照物。
图1说明了苏木紫和曙红(H和E)染色的兔神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的兔神经组织(DC2；图B)以及按照本发明教导的方法处理的兔神经组织(DC3；图C)。图A得分为0。图B(DC2)和C(DC3)各自得分为2。H和E染色是一种用于普通组织学的染色法。这些图和得分表明DC2和DC3的处理方法获得大量的细胞提取并保持整个神经鞘完整。
图2说明了Hoescht染色的兔神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的兔神经组织(DC2；图B)以及按照本发明教导的方法处理的兔神经组织(DC3；图C)。图A得分为0。图B(DC2)和C(DC3)各自得分为1R。Hoescht染色是一种用于DNA的染色法。这些图和得分显示DC2和DC3的处理方法并未清除DNA而是分散和重新分配DNA。
图3说明S-100免疫染色的兔神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的兔神经组织(DC2；图B)以及按照本发明教导的方法处理的兔神经组织(DC3；图C)。图A得分为0。图B(DC2)和C(DC3)各自得分为3。S-100免疫标记(施万细胞中的胞浆蛋白)显示DC2和DC3处理方法在提取施万细胞的细胞质时同样有效。
图4说明苏丹黑染色的兔神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的兔神经组织(DC2；图B)以及按照本发明教导的方法处理的兔神经组织(DC3；图C)。图A得分为0。图B(DC2)和C(DC3)各自得分为3。苏丹黑染色是一种用于髓磷脂的染色法。这些图和得分表明DC2和DC3的处理方法在提取髓磷脂时相同且非常有效。
图5说明NAP-4神经丝免疫染色的兔神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的兔神经组织(DC2；图B)以及按照本发明教导的方法处理的兔神经组织(DC3；图C)。图A得分为0。图B(DC2)和C(DC3)各自得分为1R。神经丝免疫标记(神经元/轴突细胞骨架的标记)显示DC2和DC3的处理方法只部分地提取和重新分配所述轴突细胞骨架。
图6说明层粘连蛋白免疫染色的兔神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的兔神经组织(DC2；图B)以及按照本发明教导的方法处理的兔神经组织(DC3；图C)。图A得分为0。图B(DC2)和C(DC3)各自得分为1R。层粘连蛋白是包括轴突周围重要基底层的神经鞘的主要组分。层粘连蛋白免疫标记显示DC3的处理方法基本上没有提取基底层结构。
实施例3——神经移植物的免疫相容性
已用Hudson等人的方法和本发明处理的神经移植物对新西兰白兔(NewZealandWhite，NZW)进行了大量体内试验。结果显示，两种类型的去细胞神经移植物是免疫相容的，没有观察到移植排斥。
新西兰白兔是一种远亲杂交品系。文献中已知从新西兰白兔供体至新西兰白兔受体的活的或细胞组织的同种异体移植导致移植免疫排斥。
因此，所观察到的在新西兰白兔同种异体移植物中没有移植排斥表明由本发明制备的神经同种异体移植物是免疫相容的。
实例4——与人神经去细胞化方法的比较
人神经组织是按照如上所述的本发明制备的且被称为DC3移植物。将DC3移植物与正常的(未处理的)人神经和经由Hudson等人(TissueEngineering10:1346-1358,2004)和美国专利第7,402,319号所描述的方案处理的人移植物(本文中称为DC2移植物)相比较。通过几种组织学技术评价来自两种处理方法的DC2和DC3移植物。
图7说明苏木紫和曙红染色的人神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的人神经组织(DC2；图B)以及按照本发明教导的方法处理的人神经组织(DC3；图C)。
图8说明Hoechst染色的人神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的人神经组织(DC2；图B)以及按照本发明教导的方法处理的人神经组织(DC3；图C)。
图9说明S-100免疫染色的人神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的人神经组织(DC2；图B)以及按照本发明教导的方法处理的人神经组织(DC3；图C)。
图10说明苏丹黑染色的人神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的人神经组织(DC2；图B)以及按照本发明教导的方法处理的人神经组织(DC3；图C)。
图11说明NAP-4神经丝免疫染色的人神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的人神经组织(DC2；图B)以及按照本发明教导的方法处理的人神经组织(DC3；图C)。
图12说明层粘连蛋白免疫染色的人神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的人神经组织(DC2；图B)以及按照本发明教导的方法处理的人神经组织(DC3；图C)。
实例5——大鼠神经移植物的神经元再增殖
将神经沿纵轴冷冻切片并安放在盖玻片上。将分离神经元接种在组织切片上并培养24小时。随后将冷冻培养物固定并且将测试神经元免疫染色。
图13A说明经(A)单独的缓冲液和(B)由Hudson等人描述的去细胞化洗涤剂(硫代甜菜碱-10、硫代甜菜碱-16和曲拉通X-200TM)去细胞的大鼠神经移植物的冷冻培养鉴定。当神经移植物的促进生长的活性几乎全被严格的洗涤剂去细胞化消除时，观察到在单独缓冲液条件下有大量轴突生长。
在有和没有曲拉通X-200TM的情况下对经由Hudson等人的方法去细胞化的神经进行冷冻培养鉴定(图13B)。对照神经(仅仅用缓冲洗涤液处理)具有高神经突促进活性。用硫代甜菜碱-10和硫代甜菜碱-16(无曲拉通X-200TM)去细胞化的神经具有类似高的神经突促进活性。相比之下，经添加曲拉通X-200TM去细胞显著地降低了促进神经突的活性。这些结果显示曲拉通X-200TM对去细胞化神经移植物的生物特性具有持久有害影响。
实例6——洗涤剂对层粘连蛋白促进神经突的活性的影响
已知神经的细胞外基质促进轴突的生长。具体地讲，包住轴突的基底层管对神经再生中的轴突生长提供了强有力的刺激。在上述实验中使用的冷冻培养鉴定依赖于基底层的结构和生长促进活性。文献已记载层粘连蛋白是神经基底层的主要促进神经突的组分。这在冷冻培养鉴定中很容易表明，其中神经突生长有效地被具有阻断抗层粘连蛋白抗体功能的神经组织部分的预处理所抑制。因此，进行测试以检验各个洗涤剂对纯化的层粘连蛋白的影响。SB-10未改变层粘连蛋白活性。暴露于SB-16使层粘连蛋白活性降低大约50％。TrX200(一种阴离子洗涤剂)基本上消除了层粘连蛋白的神经突促进活性(图14)。
本文中描述的本发明的任何方面或实施例中关于一个或多个要素所使用的术语，诸如“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”或“含有(containing)”是用来提供“由特定要素组成(consistsof)”、“基本上由特定要素组成(consistsessentiallyof)”或“基本上包含特定要素(substantiallycomprises)”的本发明的相似方面或实施例的支持，除非上下文另有说明或明显矛盾(例如，本文中描述的组合物包含一个特定要素应该被理解为还描述由那个要素组成的组合物，除非上下文另有说明或明显矛盾)。
如本文中所用，术语“基本上由...组成(consistsessentiallyof)”限制了成分范围和至指定物质的步骤，或没有在实质上影响本发明的基本特征和新颖特征的步骤，即用于组织移植物去细胞化的组合物和方法。例如，通过使用“基本上由...组成(consistsessentiallyof)”，所述组合物不含任何未指明的成分，包括但不限于对组织的去细胞化具有直接有利或不利影响的表面活性剂。
本文中所述的实例和实施例仅用于说明性目的且本领域技术人员可获得根据其的各种修改或改变的启示，并且包括在本申请的精神和权限内。此外，本文公开的任何发明或其实施例的任何要素或限制可与本文公开的任何和/或所有其他要素或限制(单独地或以任何组合)或任何其它发明或其实施例组合，并且设想所有此类组合均在本发明的范围之内，但不限于此。

Claims (20)

1.一种用于使组织移植物去细胞的方法，其中所述方法包括使组织移植物与包含一定浓度的两性洗涤剂的提取组合物接触一段时间，所述接触时间足以使所述组织中的细胞破裂，且其中所述方法是在无阴离子洗涤剂的情况下进行的。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在去细胞化之后，所述细胞外基质结构保持完整且测得的完整程度等于或优于通过包括阴离子洗涤剂的方法去细胞化。
3.根据权利要求1所述的方法，其中没有将阴离子洗涤剂施用于所述组织。
4.根据权利要求1所述的方法，其中没有将曲拉通X-200TM施用于所述组织。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织移植物与硫代甜菜碱-10和/或硫代甜菜碱-16接触。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述组织移植物与一具有由硫代甜菜碱-10组成的洗涤剂组分的提取组合物接触，且所述组织移植物还与具有由硫代甜菜碱-16组成的洗涤剂组分的第二提取组合物接触。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述两性洗涤剂的浓度为至少临界胶束浓度。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取组合物具有生理盐度或更大盐度。
9.根据权利要求1所述的方法，还包括至少一种漂洗步骤，包括将所述组织与具有小于生理盐度的溶液接触。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述漂洗溶液没有盐度。
11.根据权利要求1所述的方法，还包括从所述组织物理上去除非结构性碎片。
12.根据权利要求1所述的方法，还包括在所述去细胞化处理之前或之后冷冻所述组织移植物。
13.根据权利要求1所述的方法，用于制造选自神经、骨、肠、血管、韧带、腱和心脏移植物的组织移植物。
14.根据权利要求13所述的方法，用于制造神经移植物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中用于制造所述神经移植物的所述组织是选自神经、肌肉、胎盘和血管组织。
16.根据权利要求1所述的方法，还包括将一或多种生物活性分子或细胞引入所述组织移植物中。
17.根据权利要求1所述的方法，其中与用单独缓冲洗涤液处理的神经相比，所述组织移植物的促进轴突的活性在去细胞化之后得以保持。
18.根据权利要求1所述的方法，其中在去细胞化之后，所述组织移植物的促进神经突活性被保持且测得的保留程度等于或优于通过包括阴离子洗涤剂的方法去细胞化。
19.一种组织移植物，其经由权利要求1所述的方法制备。
20.一种试剂盒，其包括权利要求19所述的组织移植物。
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