KR20150127247A - 조직 이식편의 세포제거 방법 - Google Patents

조직 이식편의 세포제거 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수용자와 면역적합성인 천연의 무세포 대체 조직을 생성시키기 위해서 조직을 처리하기 위한 물질 및 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 수확된 조직에 오직 양쪽성 세제(들)만이 사용되는(예를 들어 음이온성 세제는 제외된다) 세척 용액을 가한다. 양쪽성 세제(들)에 의한 추출에 이어서, 상기 조직을 완충제 시스템으로 세척하여 세포 성분 및 세제의 제거를 촉진시킨다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 축색 돌기 재생을 지지하고, 축색 돌기를 원위 신경 단부를 향해 안내하고/하거나 면역학적으로 허용되는 신경 이식편인 대체 조직에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 신경 이식편은 필수적인 세포외 기질의 발판뿐만 아니라 상기 신경 이식편을 통해 신경 재생을 촉진하는 생물학적 성분을 보유한다.

Description

조직 이식편의 세포제거 방법{METHOD FOR DECELLULARIZATION OF TISSUE GRAFTS}
본원은 2013년 3월 15일자로 출원된 미국 가 출원 제 61/794,012 호를 우선권 주장하고, 상기 출원은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
의공학은 치유를 촉진하기 위해 사용될 수 있는 조직의 개발에 수많은 도전에 직면해 있다. 예를 들어, "대체" 조직은 조직 재생을 촉진해야 한다. 그렇게 하면서, 상기 새로운 조직은 이웃 세포들이 상기 대체 조직을 수용하도록 수용 조직에 융화성이어야 한다. 중요하게, 상기 대체 조직은 생물계에 대한 "이물질"의 첨가에 의해 전형적으로 유도되는 면역 반응을 극복해야 한다(또는 피해야 한다).
더욱 또한, 상기 대체 조직은 상기 조직이 대체하는 조직의 성질 및 기능을 나타내어야 한다. 예를 들어, 상기 대체 조직은 원래의 조직과 유사한 역학적 및 구조적 성질을 나타내어야 하거나, 또는 최소한 고유 환경을 방해하지 않아야 한다. 상기 대체 조직은 스캐폴드로서 작용하고/하거나 세포 재생을 촉진하기 위해 생물학적 성질을 유지할 수 있다. 최종적으로, 상기 대체 조직은 조직 재생을 제한하거나 하부 조직의 본래의 기능을 억제하는 흉터 형성을 자극하지 않아야 한다.
조직 공학의 한 가지 특히 도전적인 실시태양은 끊어진 신경의 재생을 돕기 위해 사용될 수 있는 신경 이식편의 생성이다. 직접적인 신경 복원에서, 끊어진 신경의 단부를 재연결하는 경우(삽입 이식편 없이), 축색 돌기가 근위 신경으로부터 원위 신경까지 다시 성장하려고 할 것이다. 이와 관련하여, 신경 손상 이후에, 상기 원위 신경은, 비기능성 원위 축색 돌기 및 그의 수초를 포함한 신경 요소들의 파괴 및 제거를 수반하는 월러 변성(Wallerian degeneration)으로서 공지된 과정을 겪는다. 부분적으로 상기 과정으로 인해, 축색 돌기 및 마이엘린 파편은 신경 재생을 단축시키고 축색 돌기 성장에 대한 역학적 장벽일 수 있는 성장-억제 효과를 갖는 것으로 오랫동안 여겨져 왔다.
광범위한 증거가 월러 변성 과정이 지연될 때 신경 재생이 느려짐을 가리키고 있다. 상응하게, 신경 요소의 제거가 원위 신경에서 축색 돌기 성장을 개선시키는 것은 널리 받아들여졌다. 이러한 전제는 신경 이식을 추론하게 하였으며 축색 돌기 성장을 촉진시키기 위해서는 세포 파편을 또한 신경 이식편으로부터 제거해야 한다는 믿음을 불러일으켰다. 잔류 세포 물질의 제거는 또한 조직 중의 병원체를 최소화하고 이식편 면역거부에 이르게 할 수도 있는 면역원성 물질을 제거하는데 필요한 것으로 생각되었다. 결과적으로, 신경 이식편에 사용되는 처리 방법들은 통상적으로, 상기 재생 과정을 지지하는 세포외 기질(ECM) 구조 및 신경 이식편 보전의 붕괴 희생에도 불구하고 엄격한 세포제거 기법을 수반하였다.
신경 손상은 종종 직접 복원을 위한 깨끗한 단부의 상실 또는 신경 조직 손상에 의해 생성되는 틈을 생성시킨다. 이 경우에 신경 복원은 상기 결함을 메우고 신경 연속성을 회복시키기 위해 삽입 이식편을 필요로 한다.
예를 들어, 미국특허 제 7,402,319 호(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)는 신경 연속성을 회복시킬 수 있고 올바른 환경하에서 신경 재생에 이르게 할 수 있는 무세포 신경 동종이식편을 개시한다. 이러한 유형의 신경 이식편은 신경 조직을 설포베타인 및 음이온성 계면활성 세제(예를 들어 트리톤 X-200)(상기 신경 조직의 세포제거에 사용된다)를 갖는 다수의 일련의 용액들 중에 침지시킴으로써 수득된다.
허드슨(Hudson) 등은 래트 신경상에 트리톤 X-200(상표), 설포베타인-16 및 설포베타인-10을 함유하는 세포제거 기법을 적용하였으며 매우 높은 수준의 추출을 보고하였다(문헌[Hudson TW, Liu SY, Schmidt CE. Tissue Eng. 10: 1346-58, 2004]). 그러나, 설치류의 신경은 단일의 신경 다발(신경섬유다발)을 함유하며, 설치류 신경의 외부 신경초는 보다 큰 동물의 신경을 거의 닮지 않는다. 보다 큰 동물들(예를 들어 토끼, 인간)의 대부분의 신경은 콜라겐성 내부 신경외막(신경 다발을 둘러싸는 결합 조직) 중에 매몰된 다수의 신경 다발을 갖는다. 인간 신경의 상기 신경초 및 관다발내 구조는 팽창성이며, 조직 추출에 영향을 미치는 성질들을 포함하여 신경 보전 및 침투성에 깊은 영향을 미친다. 따라서, 설치류 신경의 세포제거 및 추출에 대한 지식은 기껏해야, 보다 큰 동물로부터의 신경에 적용시 예상되는 추출만을 연상시킬 뿐이다.
요약하면, 특히 신경 조직과 관련하여 조직 대체를 개선시킬 필요가 여전히 있다. 상기 개선된 조직 대체는 상기 조직이 대체하는 조직의 고유의 구조 및 생물활성 특성, 예를 들어 라미닌 활성을 유지해야 하고, 필요한 경우 신속한 재생의 촉진이 필요하고 조직 이동성 및 보전을 감소시킬 수 있는 흉터형성 없이 조직 복원 및 재생을 자극하기 위해 생물활성 화합물 또는 분자를 통합시킬 수 있어야 한다.
본 발명은 고유의 구조 및 보전뿐만 아니라 개선된 재생에 필요한 생물학적 성질들을 유지하는 조직 이식편의 제조를 위한 신규의 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명의 조직 이식편은 간단한 제조 단계를 통해 수득될 수 있는 천연 대체 조직 또는 이식편을 제공한다. 본 발명의 방법은 구체적으로 상기 천연의 세포외 구조를 현저하게 변경시키지 않으면서 면역원성 세포 성분들을 파괴한다. 유리하게, 상기 조직은 상기 이식편을 통해 세포 재생을 촉진하는 생물학적 성질들을 보유한다. 상기 고유의 세포외 기질(ECM) 구조가 보존되며, 구체적으로 신경 이식편의 경우 기저층 및 신경내막/내피층은 그들의 천연 및 일반적으로 원래의 구조를 유지한다.
따라서, 하나의 실시태양에서, 본 발명은 축색 돌기 재생을 지지하고, 상기 축색 돌기를 원위 신경 단부를 향해 안내하고 면역학적으로 허용되는 신경 이식편을 제공한다. 상기 무세포 신경 이식편은 예를 들어 동계이식편, 자가이식편, 동종이식편 또는 이종이식편일 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 조직 대체물의 제조 방법을 제공하며 상기 방법은 상기 대체 조직을 임의의 이온성 세제(임의의 음이온성 세제 포함)의 부재하에서 하나 이상의 양쪽성 세제를 포함하는 용액 중에서 세척하고 이어서 상기 대체 조직을 일련의 완충된 염 용액 중에서 세척하여 과잉의 양쪽성 세제를 제거하는 단계들을 포함한다. 상기 공정은 현재 기술의 공정들보다 더 간단하고 비용이 덜 들며 보다 양호한 취급 성질 및 보다 양호한 재생-촉진 성질을 갖는 대체 조직을 생성시킨다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 따라 사용되는 양쪽성 세제(들)는 설포베타인-10(SB-10) 및/또는 설포베타인-16(SB-16)이다.
본 발명은 또한 세포제거된 대체 조직을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 대체 조직은 수용자에의 전달을 위한 봉합사, 튜브, 시트, 필름 또는 스캐폴드 부분을 형성할 수 있다. 바람직하게, 상기 대체 조직은 수용자에의 이식에 이어서 재생을 촉진하고/하거나 면역학적 반응을 유도하지 않는 생물학적 성분들을 보유한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 세포제거된 대체 조직을 포함하는 조직 대체용 키트를 제공한다. 상기 키트는 또한 본 발명의 대체 조직의 재-현탁에 유용한 하나 이상의 용액, 예를 들어 약물학적으로 허용 가능한 완충된 멸균 염수 용액을 포함할 수 있다. 더욱 또한, 상기 키트는 조직 재생을 조장하기 위해 첨가될 수 있는 세포, 또는 다른 활성제(예를 들어 슈반 세포 및/또는 사이토킨)가 있는 용액의 바이알을 또한 포함할 수 있다. 상기 키트는 사용자에게 상기 무세포 대체 조직에 대한 상세한 설명을 제공하는 설명지 또는 소책자를 추가로 포함할 수 있다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 축색 돌기 재생을 지지하고, 상기 축색 돌기를 원위 신경 단부를 향해 안내하고, 면역학적으로 허용되는 이식편을 제공한다. 일례로, 상기 이식편은 신경 이식편이다. 상기 이식편을 세포제거 전에 동결시키고 이어서 동결된 채로 사용을 위해 저장 및 보관할 수 있다. 또 다른 실시태양은 상기 신경 이식편을 동결 보존이 필요하지 않은 특정한 용도를 위해 제조하는 경우이며; 이 경우에, 온도는, 예를 들어 하나 이상의 보존제 및/또는 항균제를 포함하여, 상기 이식편이 사용 전에 보관되는 용액에 따라 더 높거나 더 낮을 수 있다.
하나의 실시태양에서, 재생을 지지하는 이식편은 또한 이식편 이식에 대한 수용자 면역 반응을 하향조절함을 돕는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이식편은 감소된 CD4+ T-세포 매개된 면역 반응으로 이식편 이식을 조장하기 위해서 포르볼 에스터 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)를 포함할 수 있다.
도 1은 토끼 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨(Hudson) 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명의 방법에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC3; 패널 C)의 헤마톡실린 및 에오신 염색이다.
도 2는 토끼 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명의 방법에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC3; 패널 C)의 훽스트(Hoescht) 염색이다.
도 3은 토끼 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명의 방법에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC3; 패널 C)의 S-100 면역염색이다.
도 4는 토끼 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명의 방법에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC3; 패널 C)의 수단 블랙 염색이다.
도 5는 토끼 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명의 방법에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC3; 패널 C)의 NAP-4 신경섬유 염색이다.
도 6은 토끼 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명의 방법에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC3; 패널 C)의 라미닌 면역염색이다.
도 7은 인간 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명의 방법에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC3; 패널 C)의 헤마톡실린 및 에오신 염색이다.
도 8은 인간 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명의 방법에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC3; 패널 C)의 훽스트 염색이다.
도 9는 인간 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명의 방법에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC3; 패널 C)의 S-100 면역염색이다.
도 10은 인간 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명의 방법에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC3; 패널 C)의 수단 블랙 염색이다.
도 11은 인간 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명의 방법에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC3; 패널 C)의 NAP-4 신경섬유 면역염색이다.
도 12는 인간 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명의 방법에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC3; 패널 C)의 라미닌 면역염색이다.
도 13a는 (A) 완충제 단독 및 (B) 허드슨 등에 의해 개시된 세포제거 세제(설포베타인-10, 설포베타인-16 및 트리톤 X-200(상표))에 의해 세포제거된 래트 신경 이식편의 저온배양 분석이다. 신경을 종방향 축으로 저온절제하고 커버슬립상에 올려놓았다. 분리된 뉴런들을 상기 조직편상에 시딩하고 24시간 동안 배양하였다. 이어서 상기 저온배양물을 고정시키고 시험 뉴런을 면역염색하였다. 광범위한 축색 돌기 성장이 완충제 단독 조건에서 관찰된 반면, 상기 신경 이식편의 성장-촉진 활성은 상기 엄격한 세포제거 세제에 의해 실질적으로 제거되었다.
도 13b는 신경 이식편의 신경돌기-촉진 활성에 대한 트리톤 X-200(상표)의 영향이다. 신경 이식편 샘플을 트리톤 X-200(상표)의 존재 및 부재하에서 허드슨 등의 방법에 의해 세포제거하였다. 신경을 종방향 축으로 저온절제하고 커버슬립상에 올려놓았다. 분리된 뉴런들을 상기 조직편상에 시딩하고 24시간 동안 배양하였다. 신경돌기 길이를 디지털 상 분석에 의해 채점하였다. 데이터는 2개의 별도의 실험에서 4개의 조직편으로부터의 500개 초과의 축색 돌기의 평균(±SE) 점수를 나타낸다.
도 14는 정제된 라미닌의 신경돌기-촉진 활성에 대한 개별적인 세제의 영향이다. 정제된 라미닌-1을 하기와 같은 개별적인 세제들과 혼합하였다: 대조용(완충제 단독), 설포베타인-10(125 mM), 설포베타인-16(0.6 mM) 및 트리톤 X-200(0.14%). 상기 혼합물을 광범위하게 투석시키고 이어서 조직 배양 웰에 가하여 분리된 뉴런들이 시딩된 기층을 형성시켰다. 24시간 배양 후에, 신경돌기의 길이를 측정하였다. 데이터는 4개의 별도의 실험에서 중복하여 수행된 일련의 희석으로부터의 평균 점수로부터 계산된 비활성(ED50)을 나타낸다.
도 15는 토끼 신경 동종이식편 모델에서 성공적인 신경 재생을 나타낸다. 토끼의 비골신경 중의 0.5 ㎝ 틈이 본 발명의 방법에 의해 처리된 1.2 ㎝ 신경 이식편으로 복원되었다. 4주 후에 상기 이식편을 검사하였다. A) 헤마톡실린 및 에오신 염색은 탁월한 이식편 보전 및 수용자 신경에의 통합을 나타내었다. 혈관재생 및 세포 침윤이 상기 이식편내에서 분명하다. 염증 또는 이식편 거부의 징후는 24마리의 수용자 중 누구에게서도 발견되지 않았다. B) β-튜불린 III 면역표지화(축색 돌기에 특이적임)는 상기 이식편 전체를 통해 풍부한 축색 돌기 재생을 나타내었다. C) S100 면역표지화는 풍부한 수용자 조직 슈반 세포가 재성장하는 축색 돌기와 밀접하게 결합된 이식편을 침윤하였음을 나타내었으며, 이는 기능 신경 재생을 가리킨다.
도 16은 매우 긴 신경 동종이식편을 통한 성공적인 재생을 나타낸다. 토끼의 비골신경 중의 5 ㎝ 틈이 본 발명의 방법에 의해 처리된 7 ㎝ 신경 이식편으로 복원되었다. 26주 후에 상기 이식편을 검사하였다. A) 헤마톡실린 및 에오신 염색은 탁월한 이식편 보전 및 수용자 신경에의 통합을 나타내었다. 혈관재생 및 세포 침윤이 상기 이식편내에서 분명하다. 염증 또는 이식편 거부의 징후는 10마리의 수용자 중 누구에게서도 발견되지 않았다. B) NAP-4 신경섬유 면역표지화(축색 돌기에 특이적임)는 상기 이식편 전체를 통해 풍부한 축색 돌기 재생을 나타내었다. C) S100 면역표지화는 풍부한 수용자 조직 슈반 세포가 재성장하는 축색 돌기와 밀접하게 결합된 이식편을 침윤하였음을 나타내었으며, 이는 기능 신경 재생을 가리킨다. D) 풍부한 신경섬유 면역양성 축색 돌기가 상기 이식편에 대해 원위의 수용자 신경에서 발견되었으며, 이는 신경 재생이 상기 7 ㎝ 이식편을 성공적으로 횡단하였고 표적 조직에 대해 원위에서 진행되었음을 가리킨다.
본 발명에 사용되는 용어들은 본 발명과 관련된 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 단수형 용어는 단지 단수의 존재만을 지칭하고자 하는 것이 아니고, 특정한 예가 예시를 위해 사용될 수 있는 일반적인 부류를 포함하고자 한다. 본 발명의 용어는 본 발명의 특정한 실시태양을 개시하는데 사용되지만, 이들의 사용은 특허청구범위에 개략된 경우를 제외하고, 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 본 발명에 사용된 모든 과학기술 용어들은 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 말초 신경 조직의 생물학적 성질뿐만 아니라 세포외 구조를 유지하는 신경 동종이식편을 제공한다. 상기 동종이식편은 개선된 광범위한 세포제거 처리를 통해 제조된다. 상기 세포제거 공정은 신경 조직으로부터 세포막을 용해시키고, 따라서 동종이식편 거부되는 항원을 제거한다.
본 발명은 또한, 면역학적으로 허용되고 고유 조직의 본래 구조 및 구성을 유지하는 천연 조직-기재 이식편의 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 사용되는 바와 같이 "대체 조직"이란 용어는 공여 동물(살아있거나 시체의)로부터 제거되고 본 발명에 따라 처리된 조직을 개시하는데 사용된다.
본 발명에서 상기 이식편의 용도는 비제한적으로 1) 일반적으로 비-면역원성인 생체적합성 생체재료로서; 2) 조직- 및 수용자-특이적인 조직 재생을 촉진하는 인자들에 대한 구조 토대로서; 및 3) 대체 조직 구조에 대한 수용자 반응을 연구하기 위한 연구 도구로서의 용도를 포함한다. 본 발명은 또한 가공 가능한 생물학적, 생물활성적 및/또는 생분해성 특징을 갖는 일반적으로 무세포성 조직인 대체 조직을 제공한다.
본 발명에 따르면, 통상적인 우려와 상반되게, 조직 이식편 중의 막대한 잔류 세포 성분들은 문제가 되지 않으며; 숙주 세포는 결국 이식 후에 상기 성분들을 제거하는 것으로 밝혀졌다. 거부를 유발할 수 있는 잔류 MHC 분자들조차 문제가 되지 않는다. MHC 성분은 현저한 면역 반응을 유발하기 위해서 세포막 중에서 가깝게 회합된 복합체로서 유지되어야 한다. 세포막 및 MHC 복합체는 본 발명에 따른 순한(비-이온성 및 양쪽성) 세제에 의해 쉽게 용해되므로, 이러한 우려가 경감된다.
통상적인 세포제거 기술은 가혹한 작용제 및 강력한 음이온성 세제를 요한다. 본 발명에 따르면, 놀랍고도 유리하게, 광범위한 세포 추출이 이식 과정에 이로운 것이 아니라, 실제로는 유해한 것으로 판정되었다. 오히려, 조직 동종이식편을 면역적합성으로 만들기 위해서는 보통의 추출이면 충분하며 상기 추출이 조직 복원을 촉진하는데 필요한 이식편 ECM의 보존에 이롭다.
불행히도, 신경 조직을 이온성 세제(예를 들어 트리톤 X-200(상표))로 세척하는 것은 라미닌 활성을 감소시키는 것으로 나타났다. 라미닌은 세포 분화, 이동 및 유착에 영향을 미침으로써 조직 재생에 중요한 기저층 중의 주요 단백질이다. 예를 들어, 라미닌은 신경 축색 돌기가 따라 성장하는 주요 기질이다.
따라서, 본 발명에 따르면, 순한 양쪽성 세제가, 필수적인 본래의 생물활성의 변성없이 세포 요소를 충분히 분산시키고 조직 이식편을 간단히 면역적합성으로 만들기에 충분하다.
정의
본 발명에 사용되는 바와 같이, "무세포"란 용어는 살아있는 세포가 없는 조직을 지칭한다.
"세포제거"란 용어는 세포가 붕해되고 세포 물질이 추출된 조직을 지칭한다. 세포 제거 수준은 조직의 정확한 공급원, 상기 세포의 추출에 사용되는 방법, 및 세포 제거의 필요성에 따라 변할 것이다. 세포 제거에 의한 광범위한 추출이 본 발명에 의해 사용될 수 있다. 세포 제거량은 매우 적은 %에서부터 거의 100%까지의 범위일 수 있다. 상기 성취되는 세포 붕해 및/또는 추출은 비-자가 조직 공급원 또는 조직적합성에 관하여 맞지 않는 조직의 공급원을 사용할 때 상기 이식편을 면역학적으로 허용되게 한다. 동종이식은 수용자에 의한 면역학적 거부의 우려를 감소시키기 위해서 이종이식보다 적은 조직 추출을 요한다. 따라서, 양쪽성 세제에 의한 보다 긴 접촉 시간이 지시된다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "이식편"이란 용어는 수용자에의 이식을 위해서 공여자로부터 유래되는 생물 물질을 지칭한다. 상기 이식편은, 시체로부터든 살아있는 공여자로부터든 간에, 인간을 포함한 임의의 동물 공급원으로부터 유래될 수 있다. 상기 공여자는 바람직하게는 포유동물이다.
"포유동물"이란 용어는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠용 또는 애완용 동물을 포함한 포유동물로서 분류되는 임의의 동물 수용자, 예를 들어 개, 말, 고양이, 돼지 및 소를 지칭한다.
조직 이식편의 세포제거 방법
본 발명에 따라 사용되는 조직을 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 표준 기법을 사용하여 수확할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 조직(예를 들어 신경 조직일 수 있다)을 상기 수확 후 동결시킨다.
바람직한 실시태양에서, 염 및 완충된 용액 중의 하나 이상의 세제를 본 발명의 방법에 사용한다. 상기 세제 성분은 바람직하게는 하나 이상의 양쪽성 세제를 포함하며, 임의의 상당량의 이온성 세제(예를 들어 음이온성 세제)의 사용은 배제한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 트리톤 X-200(상표)을 사용하지 않는다.
본 발명에 사용되는 세제는 조직 내부의 세포를 특이적으로 파괴시키지만 세포외 구조 또는 구조 단백질(예를 들어 상기 세포외 기질 및/또는 라미닌을 포함하는 것들)은 붕해시키지 않는 것들이다. 세포 파편을, 예를 들어 완충된 용액에 의한 세척에 의해서 및/또는 지방과 같은 다른 비-구조 파편을 물리적으로 제거함으로써 본 발명에 개시된 바와 같이 제거할 수 있다. 처리되지 않은 조직 이식편에 비해, 본 발명의 대체 조직은 표면 세포 항원이 붕해되거나 제거되었기 때문에, 상당히 감소된 면역학적 반응을 유도한다.
특정한 실시태양에서, 신경 조직을 수득하고 하나 이상의 양쪽성 세제를 포함하는 세척액을 가한다. "세제"란 용어는 본원에서 "계면활성제"란 용어와 호환가능하게 사용된다.
양쪽성 세제는 산뿐만 아니라 염기로서 반응할 수 있는 분자(또는 이온)를 포함하는 것으로서 광범위하게 개시될 수 있다. 양쪽성 계면활성제는 양성자(H+)를 제공하거나 수용할 수 있는 양쪽성 분자를 포함할 수 있다. 상기 계면활성제는 pH의 변화에 의해 크게 영향을 받는다. 상기 계면활성제는 8 이상의 pH 값에서 음이온성 세제처럼 작용한다. 상기 계면활성제는 8 내지 6의 pH 값에서 비-이온성 세제처럼 작용한다. 상기 계면활성제는 4 이하의 pH 값에서 양이온성 세제처럼 작용한다. 높은 pH에서, 세정력은 증가하며; 낮은 pH에서 세정력은 감소한다. 바람직한 실시태양에서, 조직을 pH 6 내지 8에서 양쪽성인 세제와 접촉시킨다. 특정한 실시태양에서 양쪽성 세제와의 조직 접촉을 8의 pH 값에서 수행한다.
양쪽성 부류의 목록, 및 이들 계면활성제의 종이 1975년 12월 30일자로 래플린(Laughlin) 및 휴링(Heuring)에게 허여된 미국특허 제 3,929,678 호에 제공되어 있다. 추가의 예들이 문헌["Surface Active Agents and Detergents" (Vol. I and II by Schwartz, Perry and Berch)]에 제공되어 있다.
쯔비터이온성 계면활성제는 양쪽성 전해질을 포함하는 양쪽성 계면활성제의 부분집합이다. 전형적으로, 쯔비터이온성 계면활성제는 분자내의 상이한 위치들에 양전하 및 음전하(주의: 쌍극자가 아님)를 갖는 중성 분자를 포함한다. 쯔비터이온은 일반적으로 분자의 등전점 영역에서 거의 같은 정도로 이온화되고 양성-음성 전하 중심들 사이에서 강한 "분자 내염" 인력을 발달시킬 수 있는 양이온기 및 음이온기를 함유한다. 베타인 및 설타인 계면활성제는 본 발명에 사용하기 위한 예시적인 쯔비터이온성 계면활성제이다. 하나의 실시태양에서, 사용되는 계면활성제는 쯔비터이온성 계면활성제는 아니다.
조직 세포제거 설계에 사용되는 세제(양쪽성 설포베타인 및 음이온성 트리톤 X-200(상표) 포함)의 농도는 상기 세제의 "임계 미셀 농도"에 근거한다. 상기 농도는 문헌 또는 제조자의 명세서에 보고되어 있으며 세제 효능에 최소 필요조건이다. 본 발명의 독특한 완충 원리는 미셀이 클수록 추출이 양호하다는 것이다. 보다 높은 염 농도는 미셀 크기를 증가시킨다.
따라서, 예를 들어 큰 미셀은 본 발명의 추출 완충제(바람직하게는 생리학적 또는 보다 큰 염도를 갖는다) 중에서 형성된다. 상기 큰 미셀은 세포 성분의 용해에 유리하다. 바람직한 실시태양에서, 상기 세제의 농도는 임계 미셀 농도 또는 그 이상이다.
보다 작은 미셀은 세정 완충제(긴장도/염도/오스몰농도가 낮거나(생리학적 염도 이하), 또는 없다) 중에서 형성된다. 본 발명에 따라, 작은 미셀이 조직 밖으로의 확산에 보다 양호하며 상기 낮은 긴장도/염도/오스몰농도 세정(고 염도 세척 후의)은 외향 흐름을 생성시켜 추출을 돕는다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 고 농도의 NaCl을 갖는 용액에 의한 하나 이상의 초기 조직 세척은 용해도를 유지시키며 큰 미셀을 제공함으로써 추출을 촉진한다. 보다 낮은 NaCl 농도를 갖는 용액에 의한 후속 세정(들)은 미셀 크기를 감소시키고 상기 조직 밖으로의 확산을 개선시킨다.
바람직한 실시태양에서, 신경을 하나 이상의 양쪽성 세제를 포함하거나 또는 상기 세제로 이루어지는 세제 성분을 포함하는 추출 조성물(바람직하게는 수성 조성물)과 접촉시킨다. 바람직하게, 상기 추출 조성물의 세제 성분 중에는 음이온성 세제가 존재하지 않는다. 음이온성 세제(그의 개념은 본 발명에 설명되어 있다)의 "부재"는 상기 조직의 ECM을 분해시키기에 충분한 이온성 세제가 없음을 의미한다. 따라서, 완전한 부재(즉 0%)가 반드시 요구되는 것은 아니다. 바람직하게, 상기 음이온성 세제의 양은 0.14, 0.10, 0.05, 0.01 또는 0.005% 미만이다.
상기 양쪽성 세제는 예를 들어 SB-10 및/또는 SB-16일 수 있다. 상기 세제(들)의 농도는 적어도 상기 임계 미셀 농도이어야 한다. 상기 SB-10의 농도는 예를 들어 100, 125, 150, 175, 200 mM 이상일 수 있다. 상기 SB-16의 농도는 예를 들어 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 mM 이상일 수 있다.
상기 추출 조성물은 상기 세제 성분 외에, 하나 이상의 염 및/또는 완충 시스템을 추가로 포함할 수 있다. 상기 염 농도는 생리학적 염도이거나 그 이상이어야 한다. 상기 염 농도의 하한은 예를 들어 100, 125, 150, 175, 200 mM 이상의 NaCl일 수 있고 상한은 예를 들어 500, 450, 400, 350, 250 mM 이하의 NaCl일 수 있다. 상기 pH는 예를 들어 6.5 내지 8.5일 수 있다. 바람직하게 상기 pH는 생리학적 pH이다. 하나의 실시태양에서, 나트륨 포스페이트 완충제를 사용하여 대략 7.2의 pH를 유지시킨다.
상기 조직을 상기 조성물과, 바람직하게는 5, 10, 15시간 이상의 기간 동안 서서히 교반하면서 접촉시킬 수 있다.
임의로, 하나 이상의 추가적인 추출 단계를 신선한 추출 조성물과 함께 사용할 수 있으며, 상기 조성물의 성분들은 상기 제 1 추출 조성물과 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 이어서 상기 후속 추출 조성물(상기 조성물 중에 조직이 함유되어 있다)을 1, 2, 3, 4, 5, 6시간 이상 동안 교반할 수 있다.
상기 추출 단계에 이어서 바람직하게는 추출 완충제 및/또는 생리식염수에 의한 세척을 수행한 다음, 바람직하게는 세정 완충제에 의한 세척을 수행한다. 상기 세정 완충제는 상기 추출 완충제와 동일하거나 상이한 완충제 시스템을 가질 수 있으며 또한 전형적으로는 동일하거나 유사한 pH일 수 있다. 그러나, 상기 세정 조성물의 염 농도는 바람직하게는 상기 추출 조성물의 염도 미만이다. 하나의 실시태양에서, 상기 세정 조성물은 염도를 갖지 않는다.
상기 공정의 단계들을 전형적으로는 20 ℃ 내지 30 ℃, 바람직하게는 실온 또는 그 부근(예를 들어 25 ℃)에서 수행할 것이다.
바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 다량의 세정 완충제에 의한 최종 세척을 포함하며, 상기 조직을 상기 세정 완충제에 재현탁시키고, 이어서 생리학적 완충 염수 중에 넣고, 바람직하게는 사용시까지 동결시킬 수 있다.
본 발명에 사용되는 완충 시스템 및 양쪽성 세제는, 가혹한 음이온성 세제 추출을 사용하는 허드슨 등의 경우와 동등하거나 또는 이보다 양호한 세포제거를 성취한다. 허드슨 등의 방법에 의해 처리된 인간 신경은 래트 신경에 대해 보고된 것보다 실질적으로 더 많은 세포 잔여물을 나타내었다. 또한, 허드슨 등에 의해 사용된 방법 및 본 발명은 토끼 및 인간 신경에 적용시 거의 동일한 수준의 세포 추출을 성취한다. 따라서, 허드슨 등에 의해 개시된 바와 같은 음이온성 세제 트리톤 X-200(상표)의 첨가는 세포제거에 있어서 명백한 이점이 없으며, 상술한 바와 같이 신경초 구조의 성장-촉진 성질에 유해하다. 더욱 또한, 허드슨 등은, 바람직하게는 획득 직후 동결된 신경을 사용하는 본 발명(이는 또한 인간 시체 공여자로부터의 신경의 보다 효율적인 사용을 허용한다)에 비해 "신선한" 신경을 사용한다.
유리하게는, 본 발명의 세포제거 방법은 조직 재생의 촉진 및 증진을 위한 탁월한 생리학적 및 구조적 성질을 갖는 조직 이식편을 제공한다. 예를 들어, 높은 %의 세포외 기질이 보존된다. 바람직한 실시태양에서, 상기 %는 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 초과이다.
신경 이식편의 특정한 경우에, 상기 세포제거 공정 후에 라미닌의 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 초과가 유지된다. 이를 처리되지 않은 대조용 공여자 신경과 비교하여, 예를 들어 관찰에 의한 (이중-맹검) 채점 또는 디지털 상 분석에 의해 측정할 수 있다.
본 발명에 따라 생성된 신경 이식편의 유리한 성질들을 또한 생물학적 검정에 의해서 측정되는 바와 같이 상기 이식편의 신경돌기-촉진 활성에 관하여 측정할 수 있다. 하나의 상기와 같은 생물학적 검정은 저온배양 분석이다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 세포제거 기법에 따라 생성된 신경 이식편은, 예를 들어 단지 완충제 세척만으로 처리된 대조용 신경과 비교시, 그의 신경돌기 촉진 활성의 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%를 유지한다.
하나의 실시태양에서, 신경, 근육, 태반 및 맥관을 포함한 조직들을 본 발명에 따라 세포제거하고 신경 복원을 위한 이식편으로서 사용한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 세포제거된 신경은 신경 복원을 위한 제자리(orthotopic) 이식편으로서 사용된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 세포제거된 신경은 비제한적으로 말내로의 말 신경 이식편, 고양이내로의 고양이 신경 이식편, 및 개내로의 개 신경 이식편을 포함한 수의학적 동종이계 용도에 사용된다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명에 따른 세포제거된 신경은 인간 수용자에게 이식된 동물 공여자 신경 및 상이한 종의 동물 수용자내로 이식된 동물 공여자 신경을 포함한 이종이식편 용도에 사용된다.
본 발명의 세포제거 방법을 또한 신경 복원 외의 조직 이식편, 예를 들어 비제한적으로 골 이식편, 장 이식편, 맥관 이식편, 인대 이식편, 힘줄 이식편, 및 심장 이식편에 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서 이식편을 세포제거 후 동결시킨다. 이는 감마선 조사(가장 통상적인 멸균 수단)에 유리한 상태를 촉진한다. 또한, 상기 동결된 최종 이식편 제품의 선적 및 보관이 보다 실용적이다.
이식편의 세포 재증식
세포를 본 발명의 조직으로부터 붕해시키고 추출하지만, 하나 이상의 상이한 유형의 세포를 상기 대체 조직에 재도입시키는 것이 허용될 수 있으며 종종 필요하다. 이들 세포는 공여자, 공여자로부터의 세포 배양물, 또는 세포 배양물로부터 수득될 수 있다. 공여자 세포를 일반적으로 생검에 의해 수득하며 표준 조건을 사용하여 배양물 중에서 융합까지 증식시킨다. 수용자를 필요에 따라, 예를 들어 스테로이드 및/또는 요구되는 경우, 다른 면역억제제의 스케줄을 사용하여 면역억제시킬 수 있다. 상기 수용자의 면역억제는 새로운 조직 또는 조직 등가물이 성장하는 동안 대체 조직 이식물의 면역보호를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 대체 조직을 사용하여, 유전자 변경된 세포, 클론 또는 이식물을 포함한 다수의 세포 유형을 이식편 생착, 면역요법, 인지 기능, 조직 재생, 복원 또는 재건을 위해서 상기 대체 조직의 3차원 구성/구조내에 제공할 수 있다. 상기와 같은 세포의 예는 비제한적으로 연골세포, 조골세포, 근육세포, 갑상선세포, 부갑상선세포, 면역세포, 췌장세포, 섬유아세포, 간세포, 상피세포, 섬세포, 신경세포, 및 주로 물질을 합성하고 분비하거나 대사하는 작용을 하는 다른 세포뿐만 아니라 장, 신장, 심장, 뇌, 척수, 근육, 골격, 간, 위, 피부, 폐, 생식계, 신경계, 면역계, 비장, 골수, 림프절, 샘의 생검 또는 클로닝된 세포를 포함한다.
생물활성 분자에 대한 담체로서 이식편
본 발명의 대체 조직은 또한 상기 대체 조직이 하나 이상의 활성 종에 대한 담체가 되도록 하나 이상의 활성 종과 함께 제형화된 생물활성 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트 또는 대체 조직은, 첨가된 중합체 또는 중합체 용액(예를 들어 중합체 스캐폴드) 내로 통합되거나 또는 당해 분야의 숙련가들에게 쉽게 명백한 기법을 사용하여 상기 대체 조직의 표면에 직접 또는 상기 조직 내에 부착될 수도 있는 활성제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 활성제를, 이온에 의해, 공유적으로 및/또는 가교결합제, 예를 들어 절단성 가교결합제를 사용함으로써 결합된 상기 무세포 대체 조직상에서 및 상기 조직내에서 경화시킴으로써 첨가할 수 있다.
상기 활성제는 약물 또는 다른 생물 활성 화합물일 수 있으며; 따라서 본 발명의 대체 조직은 체내에 사용시 약물 또는 다른 생물 활성 화합물의 전달을 위한 미세담체일 수 있다. 생물 활성 화합물의 예는 단백질, 펩타이드, 폴리사카라이드, 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 천연 및 합성 유기 또는 무기 분자, 및 치료, 예방 또는 진단 목적으로 사용되는 생물 분자들이다. 약물은 항생제, 항바이러스제, 화학요법제, 면역억제제, 성장 인자, 혈관형성 억제제, 호르몬, 소염제, 혈관 흐름에 영향을 미치는 약물, 세포 대사산물, 또는 하나 이상의 질병에 유효한 약물 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
다른 활성제, 예를 들어 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 예를 들어 프로피온산 유도체; 아세트산 유도체; 페남산 유도체; 바이페닐카복실산 유도체; 및 옥시캄을 또한 본 발명의 대체 조직 또는 키트에 포함시킬 수 있다. 본 발명의 키트 또는 대체 조직과 함께 사용하기 위한 진통제는 아세트아미노펜 및 펜아세틴을 포함한다.
본 발명에서 지칭되거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가 출원, 및 공보들은 모든 도면 및 표를 포함하여 내용 전체가, 본 명세서의 있는 그대로의 교시와 불일치하지 않는 정도로, 참고로 인용된다.
하기는 본 발명의 실시 과정을 예시하는 실시예들이다. 이들 실시예를 제한으로서 해석해서는 안 된다. 달리 나타내지 않는 한 모든 백분율은 중량 기준이며 모든 용매 혼합물 비율은 부피 기준이다.
실시예 1 - 세포제거 공정
모든 과정들은 무균 기법 및 멸균 용액을 사용해야 한다. 하기는 본 발명의 세포제거 공정의 하나의 실시태양의 단계들이다.
1. 공여자로부터 신경을 절제하고 동결 보관한다.
2. 상기 신경을 실온에서 해동시킨다. 찬물로 세정한다. 다량의 찬물에 담근다. 4 ℃에서 6시간(또는 그 이상) 동안 서서히 교반한다.
3. 상기 신경을 다량의 추출 완충제(10 mM Na 포스페이트 완충제, pH 7.2 + 150 mM NaCl) 또는 임의의 생리 식염수 중의 125 mM(또는 그 이상 농축된) 설포베타인-10에 담근다. 25 ℃(실온 부근)에서 15시간(또는 그 이상) 동안 서서히 교반한다.
4. 다량의 추출 완충제 또는 임의의 생리 식염수 중의 신선한 125 mM(또는 그 이상 농축된) 설포베타인-10으로 교체한다. 25 ℃에서 6시간(또는 그 이상) 동안 교반한다.
5. 다량의 추출 완충제 또는 임의의 생리 식염수로 세척한다. 25 ℃에서 60분(또는 그 이상) 동안 교반한다.
6. 다량의 세정 완충제(10 mM Na 포스페이트 완충제, pH 7.2) 또는 매우 낮은 긴장성(염도 없음)을 갖는 임의의 완충제로 세척한다. 25 ℃에서 60분(또는 그 이상) 동안 교반한다.
7. 상기 신경을 다량의 추출 완충제 또는 임의의 생리 식염수 중의 0.6 mM(또는 그 이상 농축된) 설포베타인-16에 담근다. 25 ℃에서 15시간(또는 그 이상) 동안 교반한다.
8. 다량의 추출 완충제 또는 임의의 생리 식염수 중의 신선한 0.6 mM(또는 그 이상 농축된) 설포베타인-16으로 교체한다. 25 ℃에서 6시간(또는 그 이상) 동안 교반한다.
9. 다량의 추출 완충제 또는 임의의 생리 식염수로 세척한다. 상기 신경을 30분(또는 그 이상) 동안 서서히 교반하고 이어서 신선한 추출 완충제 또는 임의의 생리 식염수로 교체한다. 4 ℃에서 교반하면서 15시간 동안 세척한다.
10. 다량의 세정 완충제로 세척한다. 서서히 교반하여 상기 신경을 재현탁시키고 이어서 신선한 세정 완충제 또는 매우 낮은 긴장성(염도 없음)을 갖는 임의의 완충제로 교체한다. 4 ℃에서 교반하면서 3시간 동안 세척한다.
11. 생리학적 완충 염수 중에 넣고 동결 보관한다.
실시예 2 - 토끼 신경을 사용하는 세포제거 방법의 비교
상술한 바와 같이 본 발명에 따라 제조된 이식편을 DC3 이식편이라 칭한다. DC3 이식편을 정상(처리되지 않은) 토끼 신경 및 허드슨 등의 문헌(문헌[Tissue Engineering 10:1346-1358, 2004]) 및 미국특허 제 7,402,319 호에 개시된 프로토콜에 의해 처리된 토끼 이식편(여기에서 DC2 이식편이라 칭함)과 비교하였다.
상기 두 처리 방법으로부터의 DC2 및 DC3 이식편을 다수의 조직학적 기법에 의해 평가하였다. 각 평가의 결과를 반-정량적으로 채점하였다(0 = 추출 안 됨, 1 = 부분적으로 추출됨, 2 = 대부분 추출됨, 3 = 완전히 추출됨 및 R = 재분배됨). 상기 두 세제 처리 설계(DC2, DC3) 및 정상적인 신경 대조군에 대한 결과를 도 1 내지 6에 도시한다.
도 1은 토끼 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명에 의해 교시된 방법에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC3; 패널 C)의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 예시한다. 패널 A는 0의 점수를 득점하였다. 패널 B(DC2) 및 C(DC3)는 각각 2의 점수를 득점하였다. H&E 염색은 일반적인 조직학에 대한 염색 방법이다. 이들 패널 및 점수들은 DC2 및 DC3에 대한 처리 방법이 광범위한 세포 추출 및 전체적인 신경초 보전의 유지를 성취했음을 입증한다.
도 2는 토끼 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명에 의해 교시된 방법에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC3; 패널 C)의 훽스트 염색을 예시한다. 패널 A는 0의 점수를 득점하였다. 패널 B(DC2) 및 C(DC3)는 각각 1R의 점수를 득점하였다. 훽스트 염색은 DNA에 대한 염색 방법이다. 이들 패널 및 점수들은 DC2 및 DC3에 대한 처리 방법이 DNA를 제거하지 않고 오히려 DNA를 분산시키고 재분배시켰음을 나타낸다.
도 3은 토끼 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명에 의해 교시된 방법에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC3; 패널 C)의 S-100 면역염색을 예시한다. 패널 A는 0의 점수를 득점하였다. 패널 B(DC2) 및 C(DC3)는 각각 3의 점수를 득점하였다. S-100 면역표지화(슈반 세포 중 세포질 단백질)는 상기 DC2 및 DC3 처리 방법이 슈반 세포의 세포질 추출에서 동등하게 유효함을 나타내었다.
도 4는 토끼 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명에 의해 교시된 방법에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC3; 패널 C)의 수단 블랙 염색을 예시한다. 패널 A는 0의 점수를 득점하였다. 패널 B(DC2) 및 C(DC3)는 각각 3의 점수를 득점하였다. 수단 블랙 염색은 미엘린에 대한 염색 방법이다. 이들 패널 및 점수는 DC2 및 DC3에 대한 처리 방법이 미엘린 추출에서 동등하게 매우 유효함을 입증한다.
도 5는 토끼 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명에 의해 교시된 방법에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC3; 패널 C)의 NAP-4 신경섬유 면역염색을 예시한다. 패널 A는 0의 점수를 득점하였다. 패널 B(DC2) 및 C(DC3)는 각각 1R의 점수를 득점하였다. 신경섬유 면역표지화(뉴런/축색 돌기 세포골격의 마커)는 DC2 및 DC3에 대한 처리 방법이 상기 축색 돌기 세포골격을 단지 부분적으로 추출하였으며 재분배시켰음을 보였다.
도 6은 토끼 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명에 의해 교시된 방법에 따라 처리된 토끼 신경 조직(DC3; 패널 C)의 라미닌 면역염색을 예시한다. 패널 A는 0의 점수를 득점하였다. 패널 B(DC2) 및 C(DC3)는 각각 1R의 점수를 득점하였다. 라미닌은 축색 돌기를 둘러싸는 중요한 기저층을 포함하는 신경초의 주성분이다. 라미닌 면역표지화는 DC3의 처리 방법이 상기 기저층 구조를 실질적으로 추출하지 못함을 나타내었다.
실시예 3 - 신경 이식편의 면역적합성
뉴질랜드 화이트(NZW) 토끼에서의 광범위한 생체내 시험을 허드슨 등의 방법 및 본 발명에 의해 처리된 신경 이식편을 사용하여 수행하였다. 결과는 상기 두 유형의 세포제거된 신경 이식편이 모두 면역학적으로 적합하였으며 이식편 거부가 관찰되지 않았음을 나타낸다.
NZW 토끼는 무작위교배 균주이다. NZW 토끼 공여자로부터 NZW 수용자로의 생 조직 또는 세포 조직의 동종이식이 이식편 면역거부를 생성시킴은 문헌에 공지되어 있다.
따라서, NZW 동종이식편에서 관찰된 이식편 거부의 결여는 본 발명에 의해 제조된 신경 동종이식편이 면역적합성임을 입증한다.
실시예 4 - 인간 신경을 사용하는 세포제거 방법의 비교
인간 신경 조직을 상술한 바와 같이 본 발명에 따라 제조하고 DC3 이식편이라 칭하였다. DC3 이식편을 정상(처리되지 않은) 인간 신경 및 허드슨 등의 문헌(문헌[Tissue Engineering 10:1346-1358, 2004]) 및 미국특허 제 7,402,319 호에 개시된 프로토콜에 의해 처리된 인간 이식편(여기에서 DC2 이식편이라 칭함)과 비교하였다. 상기 두 처리 방법들로부터의 DC2 및 DC3 이식편을 다수의 조직학적 기법에 의해 평가하였다.
도 7은 인간 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명에 의해 교시된 방법에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC3; 패널 C)의 헤마톡실린 및 에오신 염색을 예시한다.
도 8은 인간 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명에 의해 교시된 방법에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC3; 패널 C)의 훽스트 염색을 예시한다.
도 9는 인간 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명에 의해 교시된 방법에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC3; 패널 C)의 S-100 면역염색을 예시한다.
도 10은 인간 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명에 의해 교시된 방법에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC3; 패널 C)의 수단 블랙 염색을 예시한다.
도 11은 인간 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명에 의해 교시된 방법에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC3; 패널 C)의 NAP-4 신경섬유 면역염색을 예시한다.
도 12는 인간 신경 조직(대조용; 패널 A), 허드슨 등에 의해 교시된 공정에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC2; 패널 B), 및 본 발명에 의해 교시된 방법에 따라 처리된 인간 신경 조직(DC3; 패널 C)의 라미닌 면역염색을 예시한다.
실시예 5 - 래트 신경 이식편의 뉴런 재증식
신경을 종방향 축으로 저온절제하고 커버슬립상에 올려놓았다. 분리된 뉴런들을 상기 조직편상에 시딩하고 24시간 동안 배양하였다. 이어서 상기 저온배양물을 고정시키고 시험 뉴런을 면역염색하였다.
도 13a는 (A) 완충제 단독 및 (B) 허드슨 등에 의해 개시된 세포제거 세제(설포베타인-10, 설포베타인-16 및 트리톤 X-200(상표))에 의해 세포제거된 래트 신경 이식편의 저온배양 분석을 예시한다. 광범위한 축색 돌기 성장이 완충제 단독 조건에서 관찰된 반면 상기 신경 이식편의 성장-촉진 활성은 상기 엄격한 세제 세포제거에 의해 실질적으로 제거되었다.
저온배양 분석을 트리톤 X-200(상표)의 존재 및 부재하에서 허드슨 등의 방법에 의해 세포제거된 신경상에서 수행하였다(도 13b). 대조용 신경(완충제 세척만으로 처리된)은 높은 신경돌기-촉진 활성을 가졌다. 설포베타인-10 및 설포베타인-16(트리톤 X-200(상표) 부재)에 의한 신경의 세포제거는 유사하게 높은 신경돌기-촉진 활성을 가졌다. 대조적으로, 트리톤 X-200(상표)의 첨가에 의한 세포제거는 신경돌기-촉진 활성을 현저하게 감소시켰다. 이들 결과는 트리톤 X-200(상표)이 세포제거된 신경 이식편의 생물학적 성질에 지속적으로 유해한 영향을 미침을 나타낸다.
실시예 6 - 라미닌의 신경돌기-촉진 활성에 대한 세제의 영향
신경의 세포외 기질은 축색 돌기의 성장을 촉진하는 것으로 공지되어 있다. 특히, 축색 돌기를 싸고 있는 기저층 튜브는 신경 재생에서 축색 돌기 성장에 효능 있는 자극을 제공한다. 상술한 실험들에 사용된 저온배양 분석은 상기 기저층의 구조 및 성장-촉진 활성에 의존한다. 라미닌이 신경 기저층의 주요한 신경돌기-촉진 성분임은 문서에 잘 보고되어 있다. 이는, 신경돌기 성장이 항-라미닌 항체를 차단하는 기능을 갖는 신경 조직 절편의 전처리에 의해 유효하게 억제되는 저온배양 분석에서 쉽게 입증된다. 따라서, 정제된 라미닌에 대한 개별적인 세제의 영향을 검사하는 시험을 수행하였다. 라미닌 활성은 SB-10에 의해 변하지 않았다. SB-16에의 노출은 라미닌 활성을 대략 50% 감소시켰다. TrX200(음이온성 세제)은 라미닌의 신경돌기-촉진 활성을 필수적으로 제거하였다(도 14).
요소와 관련하여 "포함하는", "갖는", "구성하는" 또는 "함유하는"과 같은 용어들을 사용하는 본 발명의 임의의 태양 또는 실시태양의 본 발명의 명세는 문맥상 달리 서술되거나 명백히 반박되지 않는 한, 특정 요소"로 이루어지거나", "로 필수적으로 이루어지거나" 또는 "실질적으로 포함하는" 본 발명의 유사한 태양 또는 실시태양들에 대한 지지를 제공하고자 한다(예를 들어 특정한 요소를 포함하는 것으로서 본 발명에 개시된 조성물은 문맥상 달리 서술되거나 명백히 반박되지 않는 한, 상기 요소로 이루어지는 조성물을 또한 개시하는 것으로서 이해해야 한다).
본 발명에 사용되는 바와 같은 "로 필수적으로 이루어지는"이란 용어는 성분들 및 단계들의 범위를, 명시된 물질 또는 단계 및 본 발명의 기본적이고 새로운 특징(들), 즉 조직 이식편의 세포제거를 위한 조성물 및 방법에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 제한한다. 예를 들어, "로 필수적으로 이루어지는"을 사용함으로써, 상기 조성물은 임의의 불특정 성분들, 예를 들어 비제한적으로 조직의 세포제거에 직접적으로 이롭거나 또는 불리한 영향을 미치는 계면활성제를 함유하지 않는다.
본 발명에 개시된 실시예 및 실시태양들은 단지 예시를 위한 것이며 상기에 비추어 다양한 변형 또는 변화들이 당해 분야의 숙련가들에게 암시될 것이고 이들은 본원의 진의 및 이해 범위내에 포함된다. 또한, 본 발명에 개시된 임의의 발명 또는 그의 실시태양의 임의의 요소 또는 제한을 본 발명에 개시된 모든 다른 요소 또는 제한 또는 임의의 다른 발명 또는 그의 실시태양과 병행할 수 있다(개별적으로 또는 임의의 조합으로).

Claims (20)

  1. 조직 이식편의 세포제거 방법으로서, 조직 이식편을 상기 조직 중의 세포를 파괴하기에 충분한 농도에서 및 충분한 접촉시간 동안 양쪽성 세제를 포함하는 추출 조성물과 접촉시킴을 포함하고, 음이온성 세제의 부재하에서 수행하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    세포제거 후에 세포외 기질 구조가 완전하게 남아 있고 보존이 음이온성 세제를 포함하는 방법에 의해 세포제거된 경우와 어느 정도 동등하거나 이보다 더 양호한 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    음이온성 세제를 조직에 적용하지 않는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    트리톤(Triton) X-200(상표)을 조직에 적용하지 않는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    조직 이식편을 설포베타인-10(SB-10) 및/또는 설포베타인-16(SB-16)과 접촉시키는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    조직 이식편을 SB-10으로 이루어지는 세제 성분을 갖는 제 1 추출 조성물과 접촉시키고, 상기 조직 이식편을 또한 SB-16으로 이루어지는 세제 성분을 갖는 제 2 추출 조성물과 접촉시키는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    양쪽성 세제의 농도가 임계 미셀 농도 이상인 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    추출 조성물이 생리학적 또는 그 이상의 염도를 갖는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    조직을 생리학적 염도 미만의 염도를 갖는 용액과 접촉시킴을 포함하는 하나 이상의 세정 단계를 또한 포함하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    세정 용액이 염도를 갖지 않는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    조직으로부터 비-구조 파편을 물리적으로 제거함을 또한 포함하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    세포제거 공정 전 또는 후에 조직 이식편을 동결시킴을 또한 포함하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    신경 이식편, 골 이식편, 장 이식편, 맥관 이식편, 인대 이식편, 힘줄 이식편 및 심장 이식편 중에서 선택된 조직 이식편의 제조에 사용되는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    신경 이식편의 제조에 사용되는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    신경 이식편의 제조에 사용되는 조직을 신경, 근육, 태반 및 맥관 조직으로부터 선택하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서,
    조직 이식편에 하나 이상의 생물활성 분자 또는 세포를 도입시킴을 또한 포함하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서,
    조직 이식편의 신경돌기-촉진 활성이 완충제 세척만으로 처리된 신경에 비해 세포제거 후에 유지되는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서,
    세포제거 후에 조직 이식편의 신경돌기-촉진 활성이 유지되고 보존이 음이온성 세제를 포함하는 방법에 의해 세포제거된 경우와 어느 정도 동등하거나 이보다 더 양호한 방법.
  19. 제 1 항의 방법에 의해 제조된 조직 이식편.
  20. 제 19 항의 조직 이식편을 포함하는 키트.
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