DE112019002479B4

DE112019002479B4 - Verfahren zur herstellung einer kollagen-laminin-matrix zur heilung von hautgeschwüren, verbrennungen und wunden beim menschen

Info

Publication number: DE112019002479B4
Application number: DE112019002479.5T
Authority: DE
Inventors: Aryuna Purbodorzhievna Tsybdenova; Erdem Bairovich Dashinimaev; Yury Sodnomovich Balkhanov
Original assignee: "sheneskin" LLC; Sheneskin LLC
Current assignee: "sheneskin" LLC; Sheneskin LLC
Priority date: 2018-05-15
Filing date: 2019-03-20
Publication date: 2021-12-30
Anticipated expiration: 2039-03-21
Also published as: RU2018117999A; CN112118860B; CN112118860A; DE112019002479T5; RU2736480C2; WO2019221639A1; RU2018117999A3; US20210220518A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung einer Kollagen-Laminin-Matrix zur Heilung von Geschwüren, Verbrennungen und Wunden der menschlichen Haut, einschließlich der Gewinnung einer gewebetechnischen Wundkomposition durch Kombination von Techniken zur Extraktion von Kollagen aus Rattenschwanzsehnen, Bildung von Kollagenmatrizen, Kultivierung immortalisierter Keratinozyten der Haut der HaCaT-Linie auf einem Kollagensubstrat, dadurch gekennzeichnet, dass mit Hilfe einer Lösung der Detergenzien SDS (Natriumdodecylsulfat) und Triton-X-100 (Octylphenylpolyoxyethylen) eine Dezellurisierung (Entfernung von Zellen aus dem Endprodukt) des gebildeten Kollagenfilms unter Erhaltung von Laminin (dem Hauptprotein der Basalmembran), das von den Zellen der HaCaT-Linie synthetisiert wird, auf seiner Oberfläche erfolgt.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf medizinische Biotechnologien, d.h. Zelltechnologien und Gewebetechnik (Tissue-Engineering)-Ansätze für Aufgaben der regenerativen Medizin. Die Methode besteht darin, dass neben konservativen Behandlungsmethoden die Substitutionstherapie von Hautschäden mit Hilfe von Polymermatrizen, die histotypisch den Körpergeweben ähnlich sind, mit biologisch aktiven Wirkstoffen: Zellderivate - Kollagen und Laminin, die zur strukturellen Funktion des geschädigten Bereichs beitragen, bereitgestellt werden.
Der wichtigste und sich am schnellsten entwickelnde Bereich der modernen regenerativen Medizin ist die Anwendung der Zelltechnologie. Die Aufgabe der Zelltechnologien besteht in diesem Fall nicht nur darin, lebende Zellen in den Defektbereich zu transplantieren, sondern auch die Struktur und Funktion der Haut vollständig wiederherzustellen, regenerative Prozesse zu stimulieren und eine Mikroumgebung zur Realisierung des Potenzials der eigenen Gewebe und Zellen zu schaffen. Zur Lösung solcher Probleme werden Methoden des Tissue Engineering eingesetzt [8]. Das Tissue Engineering soll viele Probleme der regenerativen Medizin lösen, die sich mit der Verbesserung der menschlichen Lebenserwartung und Lebensqualität durch die Wiederherstellung verloren gegangener Strukturen und Funktionen von Organen und Geweben befasst. Die Anwendung neuer Materialien, die auf der Basis von Zelltechnologien geschaffen werden, kann ein vielversprechender Weg zur Behandlung und Wiederherstellung von Geweben sein [2, 3, 5, 6].
Gegenwärtig werden Ansätze auf der Basis dermatotroper biomedizinischer Zellprodukte entwickelt, um lang anhaltende, nicht heilende Wunden (trophische Geschwüre, Verbrennungen) zu behandeln und ausgedehnte Hautareale wiederherzustellen oder vorübergehend zu verschließen. Die Anwendung von Zelltechnologien zur Stimulation der Geweberegeneration besteht in der Verwendung von Zellen verschiedener Typen, Biomatrixen und Tissue-Engineering-Konstruktionen in verschiedenen Varianten und Kombinationen.
Es ist bekannt, wie ausgedehnte Verbrennungen mit epidermalen Autografts abgedeckt werden können. Wenn jedoch epidermale Beläge zur Behandlung verbrannter Patienten verwendet werden, gibt es Schwierigkeiten mit der Akzeptanz, im Falle allogener Transplantate mit der Immunogenität und Verfügbarkeit. Verschiedene andere Zelltypen - dermale Fibroblasten, mesenchymale Knochenmarkstammzellen, die durch pluripotente Stammzellen induziert werden - wurden erfolgreich in präklinischen und klinischen Studien eingesetzt. Dieser Therapieansatz erfordert jedoch in der Regel eine große Menge an Zellmaterial. Dies ist kein großes Problem bei der Behandlung kleiner Wunden, kann aber zu einem Problem bei der Behandlung umfangreicher Schäden werden [8].
Es ist bekannt, dass Kollagengele, Schwämme, die durch natürliche und synthetische Polymere von Kollagensubstraten modifiziert sind, für die Hautregeneration von dermalen Komponenten wirksam eingesetzt werden können, aber die Regenerationsprozesse werden durch die geringe Stabilität und Biokompatibilität erschwert [9].
Klinische Studien mit positiven Ergebnissen beim Verschluss relativ kleiner Wunden zeigen die Verwendung von epidermalen und dermalen Hautäquivalenten aus Rinderkollagen mit humanen neonatalen Fibroblasten (Apligraf), allogenen Vorhautfibroblasten von Neugeborenen auf einem synthetischen Substrat (Dermagraft), dreidimensionalen Kollagengelen mit Fibroblasten, jedoch gibt es bei diesen Variationen Schwierigkeiten mit Infektion, Immunogenität, Lagerung und Transport von Tissue-Engineering-Strukturen [8,10] .
Die angemeldete Vorgehensweise ist wie folgt. Das Kollagen des ersten Typs wird aus den Sehnen von Rattenschwänzen herausgelöst. Dies erfordert erwachsene Ratten der Wistar-Linie (oder Analoga) mit einem Gewicht ab 300 Gramm, die in Labor-Vivarien gehalten werden, die das Vorhandensein von Infektionen, Parasiten usw. ausschließen. Rattenschwänze können nach dem Einschläfern der Tiere mehrere Jahre lang bei -20°C unter Tiefkühlbedingungen gelagert werden. Vor der Kollagenextraktion werden die Schwänze mit Standard-Detergenzien gereinigt und vor der Kollagenextraktion 24 Stunden lang mit 70%igem Ethanol sterilisiert. Dann werden alle Handgriffe unter sterilen Bedingungen durchgeführt (in Laminarschränken der Biosicherheitsklasse 1 oder 2). Die Haut wird mit einem Skalpell und einer Pinzette vom Schwanz entfernt, der Schwanz wird in 2-3 cm große Stücke geschnitten. Die so erhaltenen Schwanzstücke werden erneut 15 Minuten lang in 70%igem Ethanol inkubiert. Dann werden die Sehnen mit einer Pinzette aus dem Schwanz herausgezogen, in dünne Fasern gespalten und in ein Gefäß mit einer sterilen Lösung aus 0,1%iger Eisessigsäure gelegt. Das Kollagen wird fast sofort in die Lösung extrahiert, die Lösung wird zähflüssig und verfärbt sich wie ein bläulich schillernder Dunst. Um die richtige Konzentration und Konsistenz der Lösung zu erhalten, sollten die Sehnen eines Schwanzes in 100-150 ml der Lösung aufgelöst werden. Dann wird die Lösung einen Monat lang bei +4°C inkubiert. Wenn möglich, sollte die Flasche mit der Lösung entnommen und der Grund aufgerührt werden. Das Ergebnis ist eine dicke viskose Flüssigkeit mit unlösbarem Grund am Boden. Die Kollagenlösung wird dann zentrifugiert (1 Stunde bei 1500g~4000 U/min mit einem Rotorradius von 10 cm, bei Raumtemperatur), um ungelöste Kollagenfasern auszufällen. Der Überstand wird in sterile Lagertanks gegossen. Die Konzentration der Lösung kann berechnet werden, indem der Wasseranteil im Trockenluftthermostat verdampft und der entstehende Restschlamm/Restgrund gewogen wird. Eine Kollagenlösung kann als akzeptabel angesehen werden, wenn die Kollagenkonzentration nicht unter 1 mg/ml liegt (üblicherweise ergeben sich 3-5 mg/ml) .
Für die Kollagenpolymerisation sollte die saure Lösung mit Essigsäure neutralisiert werden. Zu diesem Zweck wird Kollagenlösung in eine sterile Petrischale gegossen (Becherradius erforderlichenfalls - 3 cm, 6 cm oder 10 cm) und unter Rühren die entsprechende Menge 0,1M NaOH-Lösung zugegeben, um eine pH-Gesamtlösung ~ 7,0-7,2 zu erhalten. Die Acidität der Lösung kann leicht durch Zugabe eines Mittelkonzentrats M199, das phenolischen roten Farbstoff enthält, dessen Farbe je nach pH-Wert variiert, bestimmt werden. Die erforderliche Farbe der Lösung ist Scharlachrot. Durch Variation der Menge an Kollagenlösung ist es möglich, Matrizen unterschiedlicher Dicke herzustellen. Die Kollagenpolymerisation dauert 3-5 Minuten, daher sollten alle Verfahren schnell durchgeführt werden, vorzugsweise auf Eis. Nach Zugabe aller notwendigen Zutaten und Rühren wird die Petrischale mit Kollagengel für einige Stunden (am besten am Tag) in einen Inkubator bei +37°C gestellt.
Am nächsten Tag werden die Zellen der HaCaT-Linie auf Kollagengel in einer Dichte von 10-40 Tausend Zellen pro cm² ausplattiert. Bei den Zellen der HaCaT-Linie handelt es sich um immortalisierte menschliche Keratinozyten, die sich gut vermehren und in der wissenschaftlichen Forschung weit verbreitet sind. Die erforderliche Menge an Vollwachstums-Kulturmedium für HaCaT-Zellen wird von oben zugegeben und die Zusammensetzung weiter mehrere Tage lang inkubiert, bis eine dichte und superdichte Zellmonoschicht erreicht ist. Während dieser Zeit synthetisieren die HaCaT-Zellen die Lamininschicht der Basalmembran auf der Geloberfläche.
Nachdem die erforderliche Zelldichte erreicht ist, wird die entstandene Matrix mit 4% Paraformaldehyd für 1 Tag bei +4°C fixiert. Auf diese Weise werden alle Proteine der Zusammensetzung zu einem unlöslichen Einzelkomplex vernetzt, und die Zellen werden inaktiviert. Nach der Fixierung wird das Transplantat mit einer sterilen Lösung aus Phosphat-Salz-Puffer (PBS) dreimal für 15 Minuten unter Schwenken auf dem Orbitalschüttler von Formaldehyd befreit. Dann erfolgt die Phase der Matrixdezellurisierung mit Hilfe von SDS und Triton X-100 Detergenslösung, über einen Tag bei +4°C. Während dieses Prozesses werden die Verbindungen zwischen Lipiden, Fetten und Proteinen zerstört, alle intrazellulären Komponenten werden freigesetzt und ausgewaschen, es kommt zum DNA- und RNA-Abbau der Zellen. Nach der Dezellurisierung wird das Transplantat mit einer sterilen Lösung aus Phosphat-Salz-Puffer (PBS) 6-mal für 1 Stunde unter Schwenken auf einem Orbitalschüttler von Detergenzien befreit. Der letzte Waschschritt wird tagsüber bei +4°C durchgeführt. Danach kann die Matrix einen Monat lang bei +4°C in PBS-Lösung oder zwei Jahre trocken bei -20°C im Gefrierfach gelagert werden.
Die entstandene Matrix ist eine Eiweißzusammensetzung, die aus zwei Hauptkomponenten besteht - Kollagen des ersten Typs und Basalmembran-Laminin, die in einer vollständigen histotypischen Ähnlichkeit mit der Struktur der menschlichen Haut stehen. Das Kollagen bildet das Stroma des Transplantats, während das Laminin das Stroma in Form der Basalmembran bedeckt. Die Matrix ist steril, immunotolerant (da Kollagen ein sehr konservatives und immunotolerantes Protein ist und Laminin menschlichen Ursprungs ist) und enthält keine zellulären Bestandteile, was sie zu einem Medizinprodukt macht und das Registrierungsverfahren stark vereinfacht. Zur endgültigen Zusammensetzung der Matrix können verschiedene Zusätze (Antibiotika, Wachstumsfaktoren, Zytokine) hinzugefügt werden, was sie zu einem praktischen Basismodell mit großem Entwicklungspotenzial macht. Die HaCaT-Zelllinie kann gegen andere immortalisierte Epithelzelllinien ausgetauscht werden, die andere Laminin-Typen produzieren, wodurch die Matrix für die Behandlung anderer Epithel-Mesenchymdefekte (Harnleiter-Ureterie, Larynxepithel, Darmepithel usw.) verwendet werden kann.
Durchgeführte in-vitro-Studien ermöglichten es mit Hilfe zellulärer Technologien und der Anwendung von Bipolymersubstraten, Daten über die Möglichkeit der Bildung einer stabilen gewebetechnischen histotypischen Zusammensetzung auf der Grundlage einer extrahierten und in Form eines Gelfilms vorliegenden Kollagenmatrix mit einer dezellulgierten Lamininoberfläche zu erhalten. Die immunhistochemische Fluoreszenzanalyse hat die Expression von Kompositproteinen identifiziert - Kollagen Typ I und Laminin sowie Pancytokeratin - ein Marker von Epithelzellen. Somit ist die vorgeschlagene Variante der dreidimensionalen Matrix eine Proteinzusammensetzung, die aus zwei Hauptkomponenten besteht - Kollagen des ersten Typs und Laminin der Basalmembran, die in voller histotypischer Ähnlichkeit mit der Struktur der menschlichen Haut sind. Die Familien der Kollagen- und Lamininproteine sind die beiden häufigsten Proteintypen in der menschlichen Haut. Kollagen ist die Grundlage der mesenchymalen Komponente der Hautdermis und sorgt für ihre mechanische Festigkeit und Elastizität. Laminin ist die Basis aller Basalmembranen von Organen, einschließlich der Basalmembran der Haut [1, 7].
Die Ergebnisse der kontrollierten Studien über die Dynamik des Verlaufs des simulierten Wundprozesses über 21 Tage, die am Modell der Patchwork-Haut-Muskel-Wunde bei den Ratten der Wistar-Linie gewonnen wurden, deuten darauf hin, dass in Gruppen, die die Kollagen-Lamin-Matrix während 7, 14 Tagen verwendeten, die Dynamik der Reduktion der Wunddefektfläche beschleunigt wurde. Das Wachstum von Granulationsgewebe wurde von der Unterseite der Wunde aus beobachtet, und in den Bindegewebsneubildungen wurde eine Vaskularisierung beobachtet.
Die gewonnenen Daten zur Wiederherstellung der Hautintegrität bezeugen, dass die geschaffene reparative Zusammensetzung eine hohe Effizienz der Wundheilung aufgrund des gezielten Wachstums des regenerierenden Gewebes unter Aufrechterhaltung der Vaskularisierungsprozesse aufweist. Das entwickelte biokompatible Kollagen-Laminin-Wundheilungsmaterial, das auf einer Kombination aus einem polymeren Substrat und einem Produkt der Synthese menschlicher Keratinozyten basiert und gleichzeitig frei von einer zellulären Komponente ist, ist gekennzeichnet durch eine vergleichsweise einfache Herstellung, eine lange Haltbarkeit, was es erlaubt, dieses für die Anwendung und Umsetzung zu empfehlen.
Literatur

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Claims

Verfahren zur Herstellung einer Kollagen-Laminin-Matrix zur Heilung von Geschwüren, Verbrennungen und Wunden der menschlichen Haut, einschließlich der Gewinnung einer gewebetechnischen Wundkomposition durch Kombination von Techniken zur Extraktion von Kollagen aus Rattenschwanzsehnen, Bildung von Kollagenmatrizen, Kultivierung immortalisierter Keratinozyten der Haut der HaCaT-Linie auf einem Kollagensubstrat, dadurch gekennzeichnet, dass mit Hilfe einer Lösung der Detergenzien SDS (Natriumdodecylsulfat) und Triton-X-100 (Octylphenylpolyoxyethylen) eine Dezellurisierung (Entfernung von Zellen aus dem Endprodukt) des gebildeten Kollagenfilms unter Erhaltung von Laminin (dem Hauptprotein der Basalmembran), das von den Zellen der HaCaT-Linie synthetisiert wird, auf seiner Oberfläche erfolgt.