DE69227103T2

DE69227103T2 - Implantierbare gewebegrundlage und verfahren zur reduzierung der immunogenität

Info

Publication number: DE69227103T2
Application number: DE69227103T
Authority: DE
Inventors: E. Christopher Fort Collins Co 80525 Orton
Original assignee: Colorado State University Research Foundation; Colorado State University
Current assignee: Artivion Inc
Priority date: 1991-03-05
Filing date: 1992-03-05
Publication date: 1999-02-25
Anticipated expiration: 2012-03-06
Also published as: EP0574527A1; CA2105478C; EP0574527B1; US5772695A; AU1577792A; US5863296A; CA2105478A1; DE69227103D1; WO1992015259A1; EP0574527A4; ES2122994T3; US5855617A; US5192312A

Description

Während der letzten zwanzig Jahre nahm die Alloimplantations-Herzklappentransplantation in den Vereinigten Staaten von etwa 50 auf 2000 pro Jahr zu. Wegen der Zunahme an Bedarf, besonders in pädiatrischen Fällen, ist nun die Benutzung von Alloimplantations- Herzklappen durch die Lieferung von menschlichen Spenderherzen beschränkt.
Die hier beschriebene Erfindung betrifft transplantierbares Gewebe, wie Herzklappen, welches behandelt wird, um potentiell ungünstige Reaktionen auf das Gewebe zu vermeiden, die sonst beim Transplantat auftreten würden. Implantierbares Gewebe wurde in der Vergangenheit von Patienten entnommen und bei dem gleichen Patienten an einer anderen Stelle wieder implantiert, wie bei Brandopfern, die Hautimplantate erfordern, und Herzbypasspatienten, die einen Herzarterienersatz unter Verwendung von Abschnitten von Saphenous-Venen erfordern.
Ähnlich wurden Organe, wie Nieren, allogen von einem Geschwister einem anderen in der Bemühung transplantiert, immunologisch vermittelte Reaktionen durch den Transplantatrezipienten zu minimieren, die zu einer Organabweisung führen würden. Diese Patienten sowie solche, die Transplantatorgane von anderen Spendern als Geschwistern empfangen, erhalten häufig Arzneimittel verabreicht, um das Immunsystem zu unterdrücken. Obwohl das immunologische Ansprechen auf Transplantatgewebe durch die Verwendung von immununterdrückenden Arzneimitteln unterdrückt werden kann, um Gewebeabweisung zu minimieren, ist immununterdrückende Therapie allgemeiner Natur. Somit neigen immununterdrückende Arzneimittel auch dazu, die Immunreaktion zu unterdrücken, die die Fähigkeit des Transplantationspatienten vermindert, Infektionen zu bekämpfen.
Die Anlieferung und leichte Verfügbarkeit transplantierbarer Organe und von Transplantatgewebe wurde durch die Forderung nach solchem Gewebe während der vergangenen mehreren Jahre weit zurückgelassen, und es besteht ein lange gespürter Bedarf an einer Steigerung der Zufuhr solcher Organe und Gewebe. Dieser Bedarf bleibt in bestimmtem Umfang unbefriedigt, selbst wenn man die verschiedenen synthetischen Gewebe und mechanischen Organe in Rechnung stellt, die derzeit verfügbar sind.
Bioprotheseimplantate sind besser als mechanische Protheseeinrichtungen aus verschiedenen Gründen. Beispielsweise neigen mechanische Herzklappen typischerweise mehr zur Verursachung von Thromboembolie als Bioprotheseimplantate. Außerdem treten Fehler von mechanischen Einrichtungen plötzlich und ohne Vorwarnung auf, was zu Notfallsituationen führt, die chirurgische Eingriff und Ersatz der künstlichen Protheseeinrichtung erfordern. Bioprotheseherzklappenimplantate versagen typischerweise nicht plötzlich, wenn ein Problem auftritt. Vielmehr neigt die Klappe, wenn es einen Sekundärklappenfehler gibt, dazu, allmählich mit der Zeit auszusetzen. Dies gibt dem Patienten und dem behandelnden Arzt einige Vorwarnung, daß wahrscheinlich ein Fehler der Implantatprothese auftritt.
Die hier beschriebene Erfindung betrifft xenogene und allogene Gewebe, die für ein Transplantat in einem Patienten durch Ersatz nativer Zellen in dem Gewebe mit autogenen oder allogenen Zellen geeignet gemacht wurden. Diese modifizierten Implantate vereinigen die Vorteile von Bioprotheseklappen mit immunologischer Toleranz beim Rezipienten und der Fähigkeit, die extrazelluläre Matrix beizubehalten und zu reparieren.
Es wurden Versuche bei der Herstellung künstlicher Gewebe und Organe in der Vergangenheit mit unterschiedlichem Erfolgsgrad gemacht.
Die US-Patentschrift Nr. 4 407 787 von Steinberger betrifft ein Verbandmaterial aus Collagen und einem resorbierbaren Biopolymer. Das Verbandmaterial ist gewebeagglutinierbar, so daß der Verbandstoff an Gewebe anhaftet und Hämostase verursacht.
Die US-Patentschrift Nr. 4 609 551 von Caplan et al. betrifft ein Verfahren zur Stimulierung von Knochen- und Knorpelwachstum unter Verwendung eines löslichen Knochenproteins. Das Knochenprotein wird mit Zellen, wie Fibroplasten, vereinigt, und das Gemisch kann in die Stelle eines artikulären Oberflächendefektes eines Gelenkhohlraumes eingespritzt werden. Alternativ können das Knochenprotein und Zellen in ein Fibrinklümpchen implantiert werden. Die Fibroplasten unterscheiden bei der Bildung von Ersatzknorpelgewebe.
Die US-Patentschrift Nr. 4 642 120 von Nevo et al. betrifft eine gelartige Zusammensetzung zum Reparieren von Knochen- und Knorpeldefekten. Das Gel enthält Mesenchymzellen, die in Knorpelzellen durch den Einfluß von chondrogeninduzierendem Faktor in Verbindung mit Fibrinogen, Antiprotease und Thrombin differenzieren.
Die US-Patentschrift Nr. 4 485 096 von Beil betrifft ein Gewebeäquivalent zur Behandlung von Verbrennungen oder Hautwunden sowie vorgefertigte Prothesen. Ein hydratisiertes Collagengitter wird mit einem Zusammenziehung bewirkenden Mittel, wie Fibroplasten oder Blutplättchen, zusammengezogen, um ein Collagengitter zu erzeugen, um es dann mit Keratinozyten zu besetzen und so ein Hautäquivalent zu bilden. Alternativ können Drüsenzellen, wie Pankreas-beta-Zellen, oder Hepatozyten auf dem Collagengitter gezüchtet werden, um ein Pankreas- oder Lebergewebe-"Äquivalent" zu erzeugen. Knochenäquivalente können auch aus der obenbeschriebenen zusammengezogenen Collagenmatrix in Kombination mit demineralisiertem Knochenpulver gebildet werden.
Die US-Patentschrift Nr. 4 539 716 von Beil betrifft ähnlich synthetisierte Äquivalente für Blutgefäße und Drüsengewebe. Ein Zusammenziehung bewirkendes Mittel wird verwendet, um das Collagengitter um einen inneren Kern axial zusammenzuziehen. Zusätzliche Schichten, die Kapillarlager, Blutgefäße und Drüsenstrukturen enthalten, werden dann konstruiert.
Die US-Patentschrift Nr. 4 546 500 von Beil betrifft die Herstellung von Blutgefäßen und Drüsengeweben unter Benutzung eines um einen inneren Kern axial zusammengezogenen und mit einer plastischen Maschenhülse vereinigten Collagengitters. Die plastische Hülse wird sandwichartig zwischen Schichten der Matrix eingelagert, um die Struktur zu verstärken.
Die US-Patentschrift Nr. 4 835 102 von Beil et al. betrifft allgemein Gewebeäquivalent-Testsysteme und schließt Gewebeäquivalente für Epithel-, Binde-, Knorpel-, Knochen-, Blut-, Organ- und Drüsengewebe sowie Blutgefäße ein. Das Gewebeäquivalent wird aus gezüchteten Zellen aufgebaut, die von dem endogenen Gewebe stammen und in ein Collagengitter eingelagert sind.
Die PCT-Anmeldung Nr. 86/02273 von Beil et al., veröffentlicht am 24. April 1986, betrifft Verfahren zur Bildung von lebenden Gewebeäquivalenten, die eine Collagenmatrix benutzen, welche unter Bildung eines Gitters in einem Nährmedium zusammengezogen ist. Das anfangs saure Collagensystem wird durch genügende Steigerung des pH-Wertes ausgefällt, um Fibrillogenese und die Bildung einer zellhaltigen Gelmatrix einzuleiten. Die europäische Patentanmeldung Nr. 89 3090 972.1 von Beil et al. betrifft Gewebeäquivlante, die Zelltypen haben, welche ohne exogene chemische Induktion von den Zellen des Vorfahren unterschieden sind. Das Gewebeäquivalent liegt in der Form eines Gewebevorläufergemisches vor, welches nicht geliert ist, und das Gemisch wird in den Empfänger eingespritzt. Das Gemisch geliert und ist bei Einspritzung in die geeignete Stelle hohlraumfüllend. Die Zellen müssen die Fähigkeit haben, ohne exogene chemische Induktion bezüglich des Gewebeäquivalentes zu unterscheiden, um wirksam zu sein.
Y. Shing et al., Cell Biology, Band 103, Nr. 5, Pt. 2 Abstract No. 1107, Seite 299a (1986) betrifft einen von einem Chondrosarkom hergeleiteten Wachstumsfaktor, welcher in vivo angiogen ist. Der Chondrosarkom-Wachstumsfaktor wird verwendet, um in vitro eine Endothel-Zell-Vermehrung zu stimulieren.
Beil et al., Science, Band 211, Seiten 1052 bis 1054 (1981) betrifft Hautäquivalent- Transplantate, die mit einem zusammenziehenden Mittel unter Bildung eines Collagengitters behandelt sind. Das Gitter wird mit Epidermiszellen geimpft. Das Gitter gestattet angeblich eine Gefäßbildung des Implantates.
C. B. Weinberg et al., Science, Band 231, Seiten 397 bis 400 (1986) betrifft ein Blutgefäßmodell, das Collagen und gezüchtete Gefäßzellen enthält.
K. C. Kent et al., J. Vascular Surg., Band 9, Nr. 2, Seiten 271 bis 276 (1989), betrifft Endothelimpfung von Gefäßimplantaten bei Hunden und die Bildung der luminalen Monoschicht. Von Rinderaorta, äußerer Halsvene von Hunden und menschlicher Saphenus-Vene geerntete Endothelzellen werden verglichen.
J. Hoch et al. J. Surg. Res., Band 44, Nr. 5, Seiten 545 bis 554, betrifft die Verwendung von Dacron- und Polytetrafluorethylenpolymertransplantaten sowie Rindercarotisarterien-Heteroimplantate, die in vitro verglichen wurden, um das Ausmaß der Endothelzellenanhaftung zu bestimmen.
W. F. Noyes, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Band 144, Nr. 1, Seiten 245 bis 248 (1973) betrifft menschliche Leberzellenkulturen, die Collagen als ein Substrat benutzen. Es wird auch Gelschaumschwamm als ein Substrat verwendet.
Popovich et al., WO 91/l 6009, betrifft ein Verfahren zur Beschichtung der Außenoberflächen von implantierbarer Prothese mit Säugetierzellen, was zu einer Protheseneinrichtung führt, deren Oberfläche mit Säugetierzellen beschichtet ist. Diese beschichteten Oberflächen zeigen verbesserte Verträglichkeit und Thrombogenität.
Czarniecki et al., WO 90/03812, betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Implantaten, wie Geweben oder Organen, vor der Transplantation in einen geeigneten Empfänger. Ein Wachstumsfaktor, TGF-β, wird verwendet, um die Zellen in einem Gewebe zu immunmodulieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft transplantierbares oder implantierbares xenogenes oder allogenes Gewebe mit immunogenen Stellen, welche, wenn unbehandelt, gewöhnlich eine Immunsystemreaktion in dem Patienten einleiten würden, die letztlich zu einer Transplantatabweisung führt. Ähnlich wird ein Verfahren beschrieben, das das transplantierbare Gewebe im wesentlichen nichtimmunogen durch Ersatz nativer Zellen gegen allogene oder autologe Zellen macht, wobei das Erkennen eines transplantierten Implantats als eine Fremdsubstanz ohne allgemeine Unterdrückung des Immunsystems des Patienten reduziert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere transplantierbares Gewebe, welches gemäß den hier beschriebenen Verfahren behandelt werden kann, um ungünstige Immunsystemreaktionen zu vermindern oder zu verhindern, welche der Rezipient in Reaktion auf das Implantat zeigen kann, was seinerseits eine Transplantatabweisung minimiert. Somit besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, die Abweisung von transplantiertem Gewebe durch den Patienten zu vermindern.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Bereitstellung von transplantierbarem Gewebe durch Behandlung von Implantaten zu vermehren, durch welche sie zum Transplantieren in menschliche Patienten bei Bedarf einer solchen Behandlung geeignet gemacht werden.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Verwendung von tierischen Spendern zu erleichtern, was Xenoplantat-Spendergewebe in fast unbegrenzten Mengen bereitstellen kann. Das Spendergewebe kann in menschliche Rezipienten transplantiert werden, nachdem das Gewebe gemäß den hier beschriebenen Methoden behandelt wurde.
Weitere Ziele der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der hier folgenden Beschreiben offenbar.

Zusammenfassung der Erfindung

Die hier beschriebene Erfindung betrifft ein transplantierbares Bioprothese-Implantatgewebe, welches vor der Transplantation mit einem Wachstumsfaktor behandelt wird und dann Zellen ausgesetzt wird, die in das Gewebe angezogen werden und sich in Reaktion auf den Wachstumsfaktor vermehren und eine Population des transplantierbaren Gewebes ergeben. Ersatz von Zellen reduziert wirksam Immunreaktionen auf das Gewebe, was die wirkame Lebensdauer des Implantats verbessert und die Häufigkeit, das Auftreten und die Ernsthaftigkeit von Transplantatabweisung reduziert.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Behandlung von xenogenem transplantierbarem Gewebe, bei dem man es einem Wachstumfaktor aussetzt und dann das Implantatgewebe mit Zellen züchtet, die in Reaktion auf den Wachstumsfaktor wandern und sich vermehren, so daß sich eine Population des Gewebes mit den Zellen bildet, um die wirksame Lebensdauer des Gewebes bei Transplantation zu verbessern und immunologisch vermittelte nachteilige Wirkungen zu reduzieren, die der Transplantatrezipient sonst in Reaktion auf das xogene Gewebe nach Transplantation zeigen würde.
So bekommt man nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein implantierbares Gewebesubstrat mit einer Population von Zellen, die beim Reduzieren einer Immunreaktion auf das Substrat bei Implantation in einen Patienten wirksam ist, wobei dieses Substrat mit einem Wachstumsfaktor behandelt wurde. Bei einer Ausführungsform besteht die Zellpopulation des Substrates aus autologen oder allogenen Zellen. Die Zellen sind vorzugsweise Fibroplastzellen. Nach einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung bekommt man ein Verfahren zur Reduzierung der Fremdkörperreaktion, zur Verbesserung der Langlebigkeit eines Gewebesubstrates oder der Herstellung eines transplantierbaren Gewebes, welches in einen Rezipienten implantierbar ist, indem man das Substrat oder Gewebe mit einen Wachstumsfaktor behandelt, der auf Zellen wirksam ist, die wirksam bei Reduzieren einer Immunreaktion auf das Substrat sind, diese Zeilen so züchtet, daß man eine Population auf dem Substrat oder Gewebe in einer wirksamen Menge bekommt, um die Fremdkörperreaktion des Substrates beim Implantieren in den Rezipienten reduziert.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 ist eine Mikrophotographie eines Kontrollgewebes, das nicht einem Wachstumsfaktor ausgesetzt wurde, und
Fig. 2 ist eine Mikrophotographie von Gewebe, welches basischem Fibroplastwachstumsfaktor ("bFGF") (2500 mg/ml) ausgesetzt und zehn Tage mit Fibroplasten inkubiert wurde.

Detaillierte Beschreibung

Die Begriff "Gewebe", "Organ" und "Organteil" werden hier im allgemeinen Sinn verwendet, um irgendein transplantierbares oder implantierbares Gewebe, Organ oder Organteil zu bedeuten, dessen Lebensdauer durch die hier beschriebenen Methoden bei Implanta tion verbessert wird. Insbesondere werden die Gesamtbeständigkeit und Langlebigkeit des Implantates verbessert und durch das Immunsystem des Rezipienten ermittelte Reaktionen, z. B. Implantatabweisung, in ihrer Stärke sowie Häufigkeit vermindert und können sogar ganz ausgeschaltet werden.
Die Begriffe "Transplantat" und "Implantat" werden austauschbar verwendet, um Gewebe oder Zeilen (xenogene oder allogene) zu bezeichnen, die in den Körper eines Patienten eingeführt werden können, um die Struktur oder Funktion des endogenen Gewebes zu ersetzen oder zu ergänzen.
Der Begriff "autolog" bezeichnet Gewebe oder Zellen, die aus dem Rezipienten stammen oder sich hiervon herleiten, während die Begriffe "allogen" und "Alloimplantat" Zellen und Gewebe bezeichnen, die von einen Spender der gleichen Spezies wie der Rezipient stammen oder von diesem hergeleitet sind. Die Begriffe "xenogen" und "Xenoimplantat" bezeichnen Zellen oder Gewebe, die von einer anderen Spezies als jener des Rezepienten stammen oder sich davon herleiten.
Die hier beschriebene Erfindung ist besonders für Bioprothesexenoimplantate, in welchen die Hauptstrukturkomponente Bindegewebematrix ist, brauchbar. Beispiele solcher Implantate sind etwa Bioprothese-Herzklappen, -Blutgefäße, -Bänder und -Sehnen.
Somit umfaßt ein bevorzugter Aspekt der Erfindung ein Xenoimplantat, das mit einem Wachstumsfaktor behandelt und mit Zellen inkubiert wurde, die in Reaktion auf den Wachstumsfaktor wandern und sich vermehren und so eine Population des Xenoimplantats bilden, wobei dieser Austausch von Zellen wirksam ist, um allergische Komplikationen bei der Transplantation gegenüber unbehandelten Xenoimplantaten zu vermindern.
Bei der Behandlung des Xenoimplantats mit Wachstumsfaktor nach den hier beschriebenen Methoden und nach Bildung einer Population des Xenoimplantats mit allogenen oder autogenen Zellen, die die Lebensfähigkeit des Xenoimplantats nach der Transplantation verbessern und Immunreaktion auf das Xenoimplantat vermindern, gibt es eine verminderte Neigung zur Thromboembolie insbesondere im Vergleich mit mechanischen Herzklappen. Dies führt zu erhöhter Implantatlanglebigkeit, verminderter oder verlangsamter Degenerierung des Implantats und verminderten nachteiligen Immunreaktionen, die sonst zu einer Abweisung im Rezipienten führen können.
Der bevorzugte Wachstumsfaktor für die Verwendung hier ist Fibroplastwachstumsfaktor, insbesondere basischer Fibroplastwachstumsfaktor ("bFGF"). Bei Verwendung zur Behandlung von Xenoimplantaten, wie Herzklappen, kann das Implantat anfangs einem gepufferten Nährstoffmedium ausgesetzt und dann in eine bFGF enthaltende Lösung eingetaucht werden. Das Implantat kann gegebenenfalls unter Verwendung einer wirksamen Strahlungsdosis oder einer zytotoxischen Lösung vor der Behandlung mit bFGF sterilisiert und azellulär gemacht werden.
Die Konzentration von Wachstumsfaktor, der verwendet wird, um das Xenoimplantat zu behandeln, liegt typischerweise im Bereich von etwa 100 bis 10 mg/ml, wobei eine Wachstumsfaktorkonzentration für bFGF von etwa 2,5 mcg/ml am meisten bevorzugt ist.
Das Implantat wird in der Lösung, die Wachstumsfaktor enthält, während einer Zeitdauer gebadet, welche wirksam ist, um Zellen zu veranlassen, in Reaktion auf den Wachstumsfaktor zu wandern und sich zu vermehren, um an der Oberfläche des Xenoimplantats anzuhaften und sie zu durchdringen. Dies bewirkt im Effekt, daß die Zellen eine Population des Xenoimplantats bilden.
Um die Ansiedlung (oder Wiederansiedlung) von Zeilen auf dem Implantat zu bewirken, kann das Implantat gewaschen, in eine Wachstumsfaktor enthaltende Lösung eingetaucht und dann in ein geeignetes gepuffertes Medium gegeben werden, welches die Zellen enthält, die in Reaktion auf den Wachstumsfaktor wandern und sicher vermehren und so eine Population von Zellen auf dem Implantatgewebe bilden. Das Implantat und die Zellen werden zusammen bei einer Temperatur und während einer Zeitdauer gezüchtet, die wirksam sind, um die Zellen zu veranlassen, eine Population zu bilden und an dem Implantat anzuhaften.
Züchtungszeiten liegen im Bereich von etwa 3 bis 21 Tagen. Die Züchtungszeiten können etwas vermindert werden, indem man die Anfangskonzentration der Zellen erhöht.
Wenn Fibroplaste als die Implantat-Populationszellen verwendet werden, kann das Implantat typischerweise in modifiziertes Dulbecco's Eagle-Medium mit 5% Serum eingetaucht werden. Das Implantat wird mit einer primären Fibroplastkultur während etwa 3 Tagen gezüchtet. Außerdem kann das Implantat auf der Kulturplatte befestigt und in einer feuchten Atmosphäre bei etwa 37ºC inkubiert werden, bis das Implantat die Fibroplastpopulation aufweist, z. B. in 5% CO&sub2;/95% Luft. Die Inkubation wird als abgeschlossen angesehen, wenn die Fibroplasten eine Population auf dem Implantat in solcher Weise gebildet haben, daß das Implantat histologisch einem frischen Implantat ähnlich ist (z. B. eine normalen Zellenverteilung).
Im wesentlichen irgendeine gepufferte physiologische Kochsalzlösung, die Proteinträger enthält, kann verwendet werden.
Bevorzugte Puffer für die Verwendung mit dem Wachstumsfaktor schließen Natriumphosphat/Glycerin/Rinderserumalbumin ("BSA") ein. Diese Puffer werden typischerweise verwendet, um einen physiologisch verträglichen pH-Wert zu bekommen, wie etwa 7,0 bis 7,6.
Die Zellen, die zur Bildung der Population auf dem Implantat verwendet werden, können in weiten Grenzen variiert werden, und unterschiedliche Zelltypen können unter unterschiedlichen Umständen benutzt werden, je nach der Stelle und Größe des Transplantats, der Natur des zu ersetzenden Gewebes, der allergischen Empfindlichkeit (oder Hypersensitivität) des Patienten und anderen Faktoren.
Das Implantat kann vor der Behandlung mit dem Wachstumsfaktor sterilisiert oder behandelt werden, um die endogenen Zellen in dem Implantat vor der Behandlung mit Wachstumsfaktor und anschließend an die Implantatpopulationsbildung abzutöten. Dies kann die Wahrscheinlichkeit von Mikroorganismenverunreinigung sowie die Fremdkörperreaktion des Implantats vor der Bildung der Implantatpopulation und der Implantation vermindern. Eine bevorzugte Methode zur Sterilisierung von Implantaten vor der Populationsbildung benutzt Bestrahlung, z. B. mit Röntgenstrahlen, in lethal wirksamen Dosen. Alternativ können Antibiotika, antibakterielle Mittel und zytotoxische Mittel in normalerweise wirksamen Dosen angewendet werden.
Ein bevorzugter Aspekt der Erfindung schließt die Verwendung autogener Zellen in dem hier beschriebenen Verfahren ein. In diesem Fall wird vor der Transplantationschirurgie eine Gewebeprobe von dem Patienten entnommen. Das Gewebe wird gemäß den hier beschriebenen Methoden behandelt, um Fibroplaste oder andere Zellen zu erzeugen, die dann benutzt werden, um auf dem Implantat erneut eine Population zu bilden. Durch Eintauchen des Implantats in Wachstumsfaktor, eine Kultur autogener Zellen und Populationsbildung auf dem Implantat mit Zellen, die sich von dem herausgeschnittenen, von dem Patienten entnommenen Gewebe herleiten, kann eine nachteilige Immunsystemreaktion und letztlich die Implantatabstoßung minimiert oder vermieden werden.
Das Zellquellengewebe kann so ausgewählt werden, daß es zu dem zu transplantierenden Gewebe paßt. Wenn beispielsweise ein Blutgefäß transplantiert werden soll, können Zellen von gesundem Blutgefäß von dem Patienten abgenommen und als die Quelle der Zellen für die Implantatpopulation verwendet werden. Auf diese Weise kann das gesunde Implantat sehr genau zu dem erkrankten Gewebe des Patienten passen.
Dieser Aspekt der Erfindung ist besonders brauchbar, wenn der Transplantationspatient hochallergisch ist oder das Gewebe stark immunogen ist, wie in bezug auf transplantierbare Blutgefäße.
Alternativ können Zellinien verwendet werden, um erneut Population auf dem Implantat zu bilden, die im wesentlichen nichtimmunogen sind. Zellen, die nicht mehr als eine schwache allergische Reaktion hervorrufen, werden verwendet, um die Population auf dem Implantat vor der Transplantation zu erzeugen.

Verfahren zur Isolierung von Fibroplasten

Das Gewebe, wie beispielsweise Haut oder Herklappenplättchen, wird unter Verwendung einer sterilen Präpariertechnik in Stücke von 1 mm³ geschnitten. Gruppen von 10 Stücken werden dann in Gewebekulturschalen von 35 cm² mit etwa 1 ml Kulturmedium (DMEM + 10% FCS) gelegt. Es ist wichtig, daß die Gewebestücke an der Kunststoffoberfläche der Kulturschale befestigt bleiben. Wenn sich das Gewebe löst, sollte die Kulturmedi ummenge vermindert werden. Man inkubiert eine Woche bei 37ºC in einem befeuchteten Kulturinkubator. Nach einer Woche Inkubation ist jedes Gewebestück von einem dichten Auswuchs von Fibroplasten umgeben. Epithelzellen können auch vorhanden sein, gehen aber während der anschließenden Zellzüchtung verloren. Die Fibroplasten werden mit einem Kunststoffschaber oder durch Collagenaseaufschluß nach Spülen der Zellen mit einer calcium- und magnesiumfreien gepufferten Salzlösung entfernt und in größere Zellkulturbehälter mit frischem Kulturmedium angeordnet. Die Zellkulturen können auf diese Weise ausgedehnt werden. Der Inhalt eines Kolbens kann geteilt und in drei größere Behälter gegeben werden, und dieses Verfahren kann etwa einmal je Woche während wenigsten zehn Wochen wiederholt werden. Diese Kolben von Fibroplasten werden dann als eine Zellquelle benutzt. Auf diese Weise erhaltene Zellen sind gegenüber handelsüblichen Zellinien bevorzugt, da die meisten Zellinien genetisch abgewandelt sind und nicht mehr in normaler Weise auf Wachstumsregulatoren (wie FGF) ansprechen.
Die Fibroplasten können entweder immunologisch an allogene Zellen angepaßt werden, so daß sie der Rezipient nicht als fremd erkennt, oder sie können an autologe Zellen angepaßt werden, in welchem Fall der Spender und der Rezipient das gleiche Individuum sind.

Ergebnisse

Eine Untersuchung wurde unter Verwendung von Hundeplättchen und Rinderfibroplasten durchgeführt. Mitralklappenplättchen wurden aseptisch einem Hundekadaver kurz nach seiner Tötung entnommen. Die Plättchen wurden in Abschnitte geteilt und in Petrischalen gegeben, die 5 ml NaH&sub2;PO&sub4;/Glycerin/BSA-Puffer enthielten. Die Plättchen wurden mit 4000 cGy von 6 MV Röntgenstrahlen bestrahlt, um die Spenderzellen abzutöten, und dann in HBSS (Hanks Abgleich-Salzlösung) mit 0,25% Trypsin während 10 min gegeben, um restliche Endothelzellen zu entfernen. Das Trypsin wurde durch Zugabe von kaltem Kulturmedium mit 5 % Serum inaktiviert. Die Plättchen wurden gewaschen und in NaH&sub2;PO&sub4;/Glycerin/BSA-Puffer gegeben. Rekombinantes menschliches bFGF wurde dem NaH&sub2;PO&sub4;/Glycerin/BSA-Puffer in den folgenden Konzentrationen zugesetzt: 0, 50, 500 sowie 2500 ng/ml, und es wurde 4,5 h inkubiert.
Die bFGF-Lagerlösung wurde unter Zusatz von Natriumheparin in einem Verhältnis von 3 : 1 bFGF zu Heparin (Gewicht/Gewicht) hergestellt. Anteile und die bFGF-Lagerlösung wurden bei -70ºC gelagert.
Nach Inkubation wurden die Plättchen in mit Phosphat abgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in DMEM (mit nichtessentiellen Aminosäuren und Penicillin/Streptomycin) mit 0,5%igem Fötuskälberserum ("FCS") angeordnet. Rinderfibroplasten, die vorher von Kälberaorta nach Standardexplantattechniken erhalten worden waren, wurden den Herzklappenplättchen mit 2 · 10&sup4; Zellen/ml zugegeben. Die Herzklappenplättchen wurden dann am Boden der Platte mit kleinen Gewichten befestigt und 10 Tage bei 37ºC in einer befeuchteten Umgebung von 5% CO&sub2; und 95% Luft inkubiert.
Nach der Inkubation wurden Klappenabschnitte für histopathologische Analyse in Formalin gelegt. Die Analyse zeigte, daß es eine von der bFGF-Dosis abhängige Steigerung des Fibroplasteneinwachsens in die Herzklappenplättchen gab. Beispielsweise zeigen repräsentative Mikrophotographien in Fig. 1, daß die nicht bFGF ausgesetzten Kontrollplättchen im wesentlichen azellulär waren, während 2500 ng/ml bFGF ausgesetzte Plättchen, die in Fig. 2 gezeigt sind, eine gute Population mit Zellen hatten. Diese Ergebnisse demonstrieren, daß Fibroplaste ein bestrahltes, mit FGF behandeltes Xenoimplantat bevölkern.
Die hier enthaltene Beschreibung enthält die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung. Zahlreiche alternative Ausführungsformen werden jedoch als unter den Erfindungsgedanken fallend angesehen.

Claims

1. Implantierbares Gewebesubstrat mit einer Zellpopulation, die wirksam beim Reduzieren einer Immunreaktion auf das Substrat bei Implantieren in einen Patienten ist, wobei das Substrat mit einem Wachstumsfaktor behandelt wurde.

2. Substrat nach Anspruch 1, bei dem die Zellen der Population des Substrates autologe oder allogene Zellen umfassen.

3. Implantierbares Gewebesubstrat nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Zellen Fibroblastzellen sind.

4. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches ein implantierbares allogenes oder xenogenes Gewebe ist.

5. Substrat nach Anspruch 4, bei dem das Gewebe eine menschliche Herzklappe oder eine nicht-menschliche Säugetierherzklappe umfaßt.

6. Substrat nach Anspruch 5, bei dem die nicht-menschliche Säugetierherzklappe aus einem Schwein oder Rind stammt.

7. Substrat nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem der zur Behandlung des Substrates verwendete Wachstumsfaktor basischen oder sauren Fibroblastwachstumsfaktor umfaßt.

8. Verfahren zur Reduzierung der Fremdkörperreaktion oder Verbesserung der Lebensdauer eines Gewebesubstrates oder zur Herstellung eines transplantierbaren Gewebes, das in einen Rezipienten implantierbar ist, indem man das Substrat oder Gewebe mit einem Wachstumsfaktor behandelt, der auf Zellen wirksam ist, die wirksam beim Reduzieren einer Immunreaktion auf das Substrat sind, diese Zellen so züchtet, daß man eine Population auf dem Substrat in einer wirksamen Menge bekommt, um die Fremdkörperreaktion des Substrates oder Gewebes beim Implantieren in den Rezipienten zu reduzieren.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem man das Substrat mit dem Wachstumsfaktor vor der Erzeugung der Zellpopulation behandelt.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, bei dem die Zellen Fibroblastzellen sind.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, bei dem das Substrat oder Gewebe eine Säugetierherzklappe ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, bei dem das Substrat oder Transplantatgewebe vor der Behandlung mit dem Wachstumsfaktor sterilisiert wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das Substrat oder Gewebe vor der Behandlung mit dem Wachstumsfaktor Strahlung ausgesetzt wird.