KR20210074316A - 탈세포화된 근육 매트릭스 - Google Patents

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Abstract

본원에서는 하나 이상의 탈세포화된 근육 매트릭스를 포함하는 근육 임플란트, 및 근육 임플란트를 제조하는 방법을 개시한다. 근육 매트릭스는 주사 또는 이식에 적합한 미립자 형태로 제공될 수 있다.

Description

탈세포화된 근육 매트릭스
본 출원은 35 U.S.C. §119 하에 2019년 5월 30일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/854,647, 및 2018년 10월 11일 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/744,204의 이익을 주장한다. 상기 언급된 가출원 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용은 일반적으로 복벽 및 다른 근육 결함의 복구, 재생, 및/또는 치료에서 탈세포화된 근육 매트릭스를 제조 및 사용하는 방법에 관한 것이다.
각종 손상, 질환, 및 외과 수술은 근육량, 특히, 골격근의 손실을 초래한다. 예를 들어, 연조직 육종 및 골육종의 외과적 제거는 벌크 근육의 손실을 초래할 수 있다. 다른 외과 수술 및 미용 시술, 예컨대, 탈장 복구 및 근육 강화는 장기간의 근육 함량 관리를 필요로 한다. 근육 손상은 또한 둔기 외상 및 총상과 같은 부상으로부터 초래될 수도 있다.
현행 근육 재생 수술은 (예를 들어, 환자 상의 공여 부위로부터 또는 시신으로부터 대둔근을 수거하는) 근육 동종이식편의 사용 또는 완전히 탈세포화된 진피 및 다른 조직 매트릭스를 포함하는 이종이식편의 사용에 초점을 맞추고 있다. 그러나, 근육 이식편의 사용은 과도한 염증을 일으킬 수 있고 (이는 반흔 조직 형성 및 잠재적 거부를 초래할 수 있으며), 환자로부터 수거된 경우에는 공여 부위에 근육 손실이라는 문제를 제기하게 된다. 따라서, 기능성 근육량 생성을 포함한, 장기간의 근육 복구 및 재생 관리를 위한 개선된 방법 및 조성물이 계속해서 요구되고 있다. 게다가, 예를 들어, 기능적 특징 또는 심미성 (예를 들어, 근육량이 낮은 개체, 또는 근력 또는 근육량 증가를 원하는 개체의 경우)을 개선시키기 위해 근육량을 증가시키는 방법도 여전히 요구되고 있다.
따라서, 본원에서는 프로세싱 이전에 근육 조직에서 정상적으로 발견되는 근섬유 또는 다른 근육 구조적 단백질의 적어도 일부를 보유하는 탈세포화된 근육 매트릭스를 포함하는 근육 임플란트, 및 근육 복구, 치료, 증강, 강화, 및/또는 재생을 개선시키기 위한 그의 용도를 개시한다. 다양한 실시양태에서, 근육 임플란트를 제조하는 방법을 제공한다. 본 방법은 적어도 하나의 근육 샘플을 제공하는 단계; 적어도 하나의 근육 샘플을 효소와 접촉시키는 단계; 적어도 하나의 근육 샘플을 탈세포화하여 적어도 하나의 탈세포화된 근육 매트릭스를 생성하는 단계; 및 탈세포화 이전에 근육 샘플에서 정상적으로 발견되는 근섬유의 적어도 일부를 보유하기 위해 효소의 노출 지속기간 및/또는 농도 및 탈세포화 프로세스를 제어하는 단계를 포함할 수 있다.
근력을 개선시키는 시트 조직 생성물을 또한 제공한다. 시트 생성물은 탈세포화된 근육 매트릭스 및 탈세포화된 진피 매트릭스를 포함할 수 있다. 매트릭스는 복합체가 형성될 수 있도록 하기 위해 층상화될 수 있다. 상기 매트릭스를 사용하는 방법을 통해 기능적인 근육의 생성을 필요로 하는 복합적인 손상을 치료할 수 있게 된다. 진피 매트릭스는 근육 재생 동안 하중-지지를 위한 구조적 지지부를 제공할 수 있고, 새 근육 주변 또는 그 인근의 결합 조직의 재생을 위한 기질을 제공할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 미립자 또는 시트 탈세포화된 근육 매트릭스를 포함하는 근육 임플란트를 제공한다. 매트릭스는 프로세싱 이전에 근육 조직에서 정상적으로 발견되는 근섬유의 적어도 일부를 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 근육은 미오신의 특정 백분율을 유지하는 것을 특징으로 할 수 있다. 추가로, 근육이, 비록 근섬유 및/또는 미오신을 보유하기는 하지만, 조직학적 염색에 의해 측정되는 바와 같이 탈세포화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 탈세포화된 근육 매트릭스는 프로세싱 이전에 근육 조직에서 정상적으로 발견되는 근섬유 또는 미오신의 약 20-80% 이하로 함유한다. 특정 실시양태에서, 근육 임플란트는 미립자 형태로 존재한다. 특정 실시양태에서, 근육 임플란트는 동결건조되거나 또는 수용액으로 제공된다.
다양한 실시양태에서, 상기 기재된 근육 임플란트 중 하나를 환자 내로 주사 또는 이식하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 근육 임플란트는 임플란트 부재 하에서의, 또는 무손상 근육을 포함하거나, 또는 실질적으로 모든 근섬유 또는 미오신을 결여한 탈세포화된 근육을 포함하는 임플란트 존재 하에서의 재생 속도 및/또는 전체량과 비교 시, 환자 내로의 이식 후 천연 근육 재생의 증가된 속도 및/또는 전체량을 촉진시킨다. 특정 실시양태에서, 근육 임플란트는 골격근 결함 예컨대 복부 탈장, 복부 손상, 외과적 손상, 총상, 또는 둔기 외상을 치료하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 근육 임플란트는, 예를 들어, 근육 소모성 장애에 기인하거나 또는 (예를 들어, 육종 또는 골육종의 치료로부터) 환자로부터 천연 근육 조직의 외과적 제거에 기인하는 벌크 근육 손실 후에 사용된다. 특정 실시양태에서, 근육 임플란트는 임플란트 부위에서 근육 조직의 외관 및/또는 부피를 증강시키는데 사용된다. 근육 임플란트는 미립자 근육 매트릭스의 1회 또는 다회 주사로 제공될 수 있다.
근육 임플란트는 수축력에 의해 측정되는 바와 같이 기능적 근육 재생 또는 강화를 제공하는데 사용될 수 있다.
도 1은 개시된 근육 매트릭스를 생성하는 예시적인 방법을 예시한 흐름도이다.
도 2A 및 2B는 다양한 개시된 실시양태에 따라 제조된 바와 같은, 신선한 돼지 근육 및 돼지 무세포 근육 매트릭스의 조직학적 영상이다.
도 3은 시트 또는 미립자 형태의 돼지 무세포 근육 매트릭스 (pAMM)의 미오신 함량 대비 신선한 돼지 근육의 미오신 함량을 제시하는 막대 그래프이다.
도 4A 및 4B는 결함 생성 및 돼지 무세포 진피 매트릭스, 또는 돼지 무세포 진피 매트릭스 및 돼지 무세포 근육 매트릭스의 조합을 이용한 치료 후 6주째의 래트 복직근 결함의 트리콤-염색된 섹션이다.
도 5는 비복근 결함이 비처리 상태로 방치된 래트 또는 pAMM을 이용하여 복구된 래트의 러닝 거리로 측정된 바와 같은 기능적 근육 회복의 그래프이다.
도 6은 비복근 결함이 비처리 상태로 방치된 래트 또는 pAMM을 이용하여 복구된 래트의 수축력으로 측정된 바와 같은 기능적 근육 회복의 막대 그래프이다.
도 7A 및 7B는 결함 생성 후 3주째의 래트 전경골 (TA) 근육 결함의 트리콤-염색된 영상을 제공한다. 결합부를 비복구 상태로 방치하거나 (A), 또는 결함 생성 후 즉시 주사가능한 pAMM을 이용하여 복구시켰다 (B).
도 8은 결함 생성 후 3주째의 주사가능한 pAMM을 이용하여 복구되거나 또는 복구되지 않은 TA 근육 중량으로서, 반대측 근육과 비교된 것을 예시한 막대 그래프이다.
도 9A 및 9B는 결함 생성 후 12주째의 영장류 비복근 결함의 트리콤-염색된 영상이다. 결함을 비복구 상태로 방치하거나 (A), 또는 결함 생성 후 즉시 pAMM을 이용하여 복구시켰다 (B).
도 10A 및 10B는 주사 후 1 또는 3주째의 pAMM 주사를 맞은 래트 TA 근육의 육안적 횡단면 영상을 제공한다.
도 11은 이식 후 3주째의 pAMM 주사를 맞은 래트 TA 근육의 H&E 섹션으로서, 새 근육 형성을 입증하는 것이다.
도 12는 처리 후 3주째의 pAMM 주사를 맞거나 또는 맞지 않은 래트 TA 근육의 막대 그래프로서, 기존 근육량을 강화시킬 수 있는 pAMM의 능력을 제시하는 것이다.
도 13은 주사 후 9주째 1, 2, 또는 3회의 처리 동안 pAMM 주사를 맞은 래트 TA 근육의 막대 그래프이다.
도 14는 실시예 8에 기재된 바와 같이, 주사를 맞은 근육에 상응하는 반대측 근육과 비교하여 상기 주사를 맞은 근육의 중량 증가의 백분율을 예시한 것이다.
도 15는 실시예 8에 기재된 바와 같이, 주사 후 3주째의 다양한 pAMM 제제로 주사를 맞은 근육의 트리콤 염색된 영상을 제공하는 것이다. 제제 1 pAMM의 잔류량은 검출이 불가능한 반면, 소량의 제제 2 및 3 pAMM이 검출가능하다.
도 16은 실시예 8에 기재된 바와 같이, 주사 후 6주째의 다양한 pAMM 제제로 주사를 맞은 근육의 트리콤 염색된 영상을 제공하는 것이다. 제제 1 또는 제제 2 pAMM의 잔류량은 검출이 불가능한 반면, 소량의 제제 3 pAMM이 검출가능하다.
도 17A-17E는 트립신 처리된 돼지 근육 조직의 육안적 영상을 제공하는 것이다.
도 18은 다양한 농도의 트립신으로 처리된 돼지 근육 조직 중 잔류 미오신에 대한 막대 그래프이다.
도 19A-19J는 트립신 처리된, 브로멜라인 처리된, 및 비처리된 돼지 근육 조직의 육안적 영상을 제공하는 것이다.
도 20은 다양한 농도의 브로멜라인으로 처리된 돼지 근육 조직 중 잔류 미오신에 대한 막대 그래프이다.
이제 본 개시내용에 따른 특정의 예시적인 실시양태에 대해 상세하게 언급할 것이며, 그의 특정 예는 첨부 도면에 예시되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "근섬유"는 근육 수축에 관여하는 막대 모양의 구조이며, 미오신, 트로포닌, 트로포미오신, 및 액티닌과 같은 단백질을 포함한다. 긴 근섬유 쇄는 장방형 근육 세포 (근세포)에서 및 그들 사이에서 발견된다.
본원에 사용된 바와 같이, "근육 결함"은 이식된 근육 매트릭스에 의해 복구, 개선, 증강, 재생, 호전, 및/또는 치료될 수 있는 임의의 근육 이상 또는 손상이다. 근육 결함은 근육에 대한 변경을 초래하는 질환, 외상, 또는 외과적 개입으로부터 초래된 임의의 이상 또는 손상을 포괄한다. 본원에 사용된 바와 같이, "벌크" 근육 조직의 제거 또는 손실은 감지가능하고 측정가능한 부피의 근육 조직, 예를 들어, 적어도 약 0.5 ㎤ 부피의 손실을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "탈세포화된 조직"은 조직의 세포외 매트릭스에서 성장하는 것으로 정상적으로 발견되는 세포 대부분 또는 그들 모두가 제거된 제거된 것인 임의의 조직 (예를 들어, 천연 세포의 약 80, 85, 90, 95, 99, 99.5, 또는 100%를 결여한 조직) (또는 상기 백분율 사이의 임의의 값을 결여한 조직)이다. 세포 제거는 H&E 섹션을 이용하여 광학 현미경검사에 의해 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "천연 세포" 및 "천연 조직"이라는 용어는 근육 임플란트 이식 이전의 수용자 조직/기관에 존재하는 세포 및 조직, 또는 이식 후 숙주 동물에 의해 생산된 세포 또는 조직을 의미한다.
본원에 사용된 섹션 표제는 단지 조직화 목적을 위한 것이며, 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 특허, 특허 출원, 논문, 서적 및 학술서를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 본 출원에서 인용된 모든 문헌, 또는 문헌들의 일부분은 임의의 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 명백하게 포함된다. 참조로 포함된 공개문헌 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 포함된 본 발명에 상반되는 경우, 본 명세서가 임의의 상반되는 소재를 대체하게 될 것이다.
본 출원에서, 단수 형태의 사용은 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 복수 형태를 포함한다. 또한, 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 게다가, "포함한"이라는 용어 뿐만 아니라, "포함한다" 및 "포함된다"와 같은 다른 형태의 사용은 비제한적이다. 본원에 기재된 임의의 범위는 종점 및 이들 종점 사이의 모든 값을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본원에서는 하나 이상의 탈세포화된 근육 매트릭스를 포함하는 근육 임플란트를 개시한다. 근육 매트릭스는 주사에 적합한 미립자 매트릭스를 포함할 수 있다. 주사는 큰 근육을 포함한 다수의 해부 부위 (예를 들어, 사지, 복부, 목, 몸통), 또는 괄약근, 안면 근육, 혀, 또는 손을 포함한 더 작은 근육을 치료하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 매트릭스는 시트, 또는 탈세포화된 근육 및 탈세포화된 진피, 또는 근육 및 다른 물질 예컨대 폴리프로필렌 메쉬의 조합을 갖는 시트를 포함할 수 있다. 매트릭스는 이식될 수 있고, 기능적 근육 재생 또는 강화를 유도할 수 있다.
개시된 근육 매트릭스는 도 1의 흐름도에 예시된 예시적인 프로세스의 변형법을 이용하여 제조될 수 있다. 제시된 바와 같이, 본 프로세스는 일반적으로 근육을 수득하는 단계 (단계 110), 근육을 원하는 크기로 커팅하는 단계 (단계 120), 및 임의적으로, 적혈구를 포함한 특정 세포를 용해시키거나 또는 파괴하는 단계 (단계 130)를 수행하는 것을 포함한다. 본 방법은 조직을 효소 예컨대 트립신으로 처리하는 단계 (단계 140), 조직을 탈세포화하는 단계 (단계 150), 및 임의적으로, 조직의 성분들을 제거하거나 또는 붕괴하는 추가 단계 (단계 160)를 수행하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이어서, 조직을 프로세싱하여 미립자를 형성할 수 있다 (단계 170). 이어서, 조직을 최종 저장 및 멸균 배치를 위해 보호 또는 저장 용액 중에서 제조한 후 (단계 180), 최종 멸균 (단계 190)을 수행할 수 있다. 상기 단계들에 관한 상세한 설명은 하기에서 제공한다.
단계 110은 근육 조직을 받거나 또는 수득하는 단계를 포함한다. 조직은 다수의 상이한 동물 또는 동물 상의 해부 부위로부터 수득된 골격근을 포함할 수 있다. 대안적으로, 조직은 평활근 또는 심장근을 포함할 수 있다.
조직은 인간 또는 비-인간 포유동물로부터 수득될 수 있다. 게다가, 근육은 임의의 적합한 근육을 포함할 수 있지만, 대개는 효율적인 프로세싱을 허용하는데 적합한 부피를 제공할 수 있도록 선택될 것이다. 적합한 근육은, 예를 들어, 동물 다리, 팔, 또는 몸통 근육, 예컨대, 예를 들어, 측복근, 직근, 배근, 경골근, 또는 유사 근육을 포함할 수 있다.
개시된 근육 매트릭스는 의도된 수용자 동물과 동일한 종의 하나 이상의 공여자 동물로부터 유래될 수 있지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 따라서, 예를 들어, 탈세포화된 근육 조직은 돼지 조직으로부터 제조되고 인간 환자에 이식될 수 있다. 탈세포화된 근육 조직의 공여자 및/또는 수용자로서의 역할을 할 수 있는 종은, 제한 없이, 포유동물, 예컨대 인간, 비인간 영장류 (예를 들어, 원숭이, 개코원숭이, 또는 침팬지), 돼지, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 토끼, 기니 피그, 저빌, 햄스터, 래트, 또는 마우스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 초과의 공여자 동물로부터의 근육 조직이 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 항원성 에피토프를 결여하도록 유전적으로 변형될 수 있는 동물이 근육 매트릭스를 위한 조직 공급원으로서 선택될 수 있다. 예를 들어, 말단 α-갈락토스 모이어티의 발현을 결여하도록 유전적으로 조작된 동물 (예를 들어, 돼지)은 조직 공급원으로서 선택될 수 있다. 이종이식을 위해 적절한 동물 및 트랜스제닉 동물을 생성하는 방법에 관한 설명을 위해, 2014년 8월 12일 등록된 미국 특허 번호 8,802,920 (발명의 명칭: "Acellular Tissue Matrices Made from Alpha-1,3-Galactose Deficient Tissue")을 참조하고, 상기 특허는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 대안적으로, 조직은, 예를 들어, 알파-갈락토시다제 처리에 의해 말단 α-갈락토스 모이어티를 제거하기 위해 처리될 수 있다.
근육을 수득한 후에 그러나 사용 이전에, 손상 또는 비바람직한 변화를 방지하기 위해 조직을 저장할 수 있다. 예를 들어, 조직을 극저온 온도에서 동결시키고, 동결-해동 사이클 손상을 방지하기 위하여 서서히 해동시킬 수 있다. 예를 들어, 조직을 -60℃에서 동결시키고, 원하는 경우, 6-12시간 동안에 걸쳐 해동시킬 수 있다.
근육 수득 후, 근육을 원하는 크기로 커팅하여 추가 프로세싱을 촉진시킬 수 있다 (단계 120). 예를 들어, 다양한 용액을 이용하여 프로세싱할 수 있도록 하기 위해, 근육을 원하는 두께 또는 크기의 조작 또는 시트로 커팅할 수 있다. 커팅에 적합한 크기는 약 0.5 mm 두께의 스트립 또는 시트를 포함할 수 있지만, 더 작거나 또는 더 큰 크기가 사용될 수 있다.
초기 커팅 후, 조직 샘플을 프로세싱하여 혈액 또는 혈액 성분 예컨대 적혈구 ("RBC")를 제거할 수 있다 (단계 130). 예를 들어, 조직 샘플을 세포 용해 용액에 노출시켜 세포 예컨대 적혈구를 제거할 수 있다. 예를 들어, 용액 예컨대 염화암모늄, 저장성 또는 고장성 염수, 계면활성제, 또는 다른 공지된 혈액 제거 조성물을 포함한, 다양한 혈액 세포 제거 또는 용해 용액이 사용될 수 있다. 추가로, 예를 들어, 1 내지 10회의 세척 단계, 또는 그 사이의 임의의 적합한 횟수의 세척 단계를 포함한, 다회의 인큐베이션 및/또는 세척 단계에서 용액이 사용될 수 있다. 용해된 RBC 물질 제거를 위해 조직은 세정될 수 있다.
혈액 용해 후, (예를 들어, 근섬유 중 미오신 분자를 절단함으로써) 근섬유 다발을 분해시키기 위해, 및/또는 다른 비-원하는 성분을 제거하기 위해 조직 샘플을 효소를 포함하는 용액과 접촉시킬 수 있다 (단계 140). 예를 들어, 효소는 하나 이상의 프로테아제, 예컨대 세린 프로테아제를 포함할 수 있고, 프로테아제는 세포 제거 또는 붕괴, 변성된 또는 손상된 콜라겐 단편의 제거, 또는 특정 항원 예컨대 알파-갈락토스의 제거에 도움을 줄 수 있다.
일부 실시양태에서, 용액은 효소 예컨대 트립신 또는 세린 프로테아제를 포함할 수 있다. 적합한 효소는, 예를 들어, 파파인, 브로멜라인, 피신, 또는 알칼라제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 트립신 또는 상기 열거된 다른 효소는 후속 탈세포화 동안 근섬유 분해 및 근세포 제거 속도 및/또는 정도를 증가시킴으로써 탈세포화 프로세스를 촉진시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 근육 샘플을 약 10-10-0.5% (예를 들어, 약 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 또는 0.5 퍼센트), 또는 10-8-10-4%, 또는 10-7-10-5%, 또는 10-4-10-2%, 또는 그 사이의 임의의 퍼센트의 범위의 농도의 트립신에 노출될 수 있다. 상기 언급된 농도는 10-6%가 대략 120-130 BAEE 유닛에 상응하도록 하는 효소 활성을 갖는 트립신에 적합한 것으로 간주될 수 있으며, BAEE 유닛은 Nα-벤조일-L-아르기닌 에틸 에스테르 (BAEE)를 기질로 사용하는 트립신 활성에 대한 사양이 있는 효소에 대해 결정된다. 본 방법은 하기 반응에 기반한 연속 분광광도 속도 결정 (ΔA253, 광 경로 = 1 cm)이다:
BAEE + H2O 트립신 > Nα-벤조일-L-아르기닌 + 에탄올, 여기서:
BAEE = Nα-벤조일-L-아르기닌 에틸 에스테르; 및
BAEE 유닛은 1 BAEE 유닛의 트립신 활성이 3.20 ml의 반응 부피 중 25℃ 하에 pH 7.6에서 기질로서 BAEE를 사용하여 분당 0.001의 ΔA253을 생성하도록 정의된다.
다수의 적합한 트립신이 사용될 수 있지만, 적절할 수 있는 하나의 예시적인 트립신은 소 췌장 트립신, 인간 췌장 트립신, 돼지 췌장 트립신, 재조합 인간 트립신, 및 재조합 돼지 트립신을 포함한다.
일부 실시양태에서, 근육 샘플은 약 5 유닛/리터 내지 200 유닛/리터 범위 농도의 브로멜라인에 노출될 수 있다.
특정 실시양태에서, 근육 샘플은 적어도 약 15분 또는 최대 약 24시간 (예를 들어, 약 15분, 30분, 45분, 60분, 75분, 90분, 105분, 120분, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간 또는 임의의 중간 시간)까지 그 기간 동안 트립신 또는 다른 효소에 노출될 수 있다. 특정 실시양태에서, 근육 샘플은 적어도 약 15분 또는 최대 약 48시간 (예를 들어, 약 15분, 30분, 45분, 60분, 75분, 90분, 105분, 120분, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간, 48시간 또는 임의의 중간 시간)까지 그 기간 동안 효소에 노출될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 탈세포화는 트립신처리 (또는 다른 효소 처리) 이전, 트립신처리 이후, 또는 트립신처리 이전 및 이후 둘 다의 시점에 수행될 수 있다.
효소 처리 후, 조직 샘플을 프로세싱하여 탈세포화된 매트릭스를 생성할 수 있다. 본원에 논의된 바와 같이, "탈세포화된" 조직은 광학 현미경검사에 의해 결정되는 실질적으로 모든 세포가 제거된 근육 매트릭스를 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 그러나, 본원에 논의된 바와 같이, 근육 매트릭스는 새 근육 조직의 성장을 허용하는데 중요한 것으로 밝혀진, 미오신을 포함한 수축성 단백질을 보유할 수 있다. 비록 미오신 및 다른 단백질이 세포 내에 포함될 수 있지만, 본원에 언급된 "탈세포화된" 또는 "무세포" 근육 매트릭스는, 헤마톡실린 및 에오신 광학 현미경검사에서 시각적으로 조직에 세포가 없는 한, 탈세포화된 또는 무세포인 것으로 이해될 것이다.
조직 샘플은 근육 조직 내 세포외 매트릭스의 생물학적 및/또는 구조적 완전성을 손상시키지 않으면서, 근육 조직으로부터 생존가능 및 비-생존가능한 세포를 제거하기 위해 탈세포화 용액에 노출될 수 있다. 탈세포화 용액은 적절한 완충제, 염, 항생제, 하나 이상의 계면활성제 (예를 들어, TRITON X-100™ 또는 다른 비이온성 옥틸페놀 에톡실레이트 계면활성제, 소듐 도데실 술페이트 (SDS), 소듐 데옥시콜레이트, 또는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트), 가교 결합을 방지하기 위한 하나 이상의 작용제, 하나 이상의 프로테아제 억제제, 및/또는 하나 이상의 효소를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 탈세포화 용액은 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 또는 임의의 중간 백분율의 TRITON X-100™, 및 임의적으로, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 또는 임의의 중간 농도의 EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산)를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 탈세포화 용액은 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 또는 임의의 중간 백분율의 소듐 데옥시콜레이트, 및 임의적으로, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 또는 임의의 중간 농도의 EDTA를 함유하는 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 또는 20 mM HEPES 완충제 (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 근육 조직은 탈세포화 용액 중 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 또는 42℃ (또는 그 사이의 임의의 온도)에서 인큐베이션될 수 있고, 임의적으로, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 150 rpm (또는 그 사이의 임의의 rpm)으로 부드럽게 진탕시키는 것인 적용될 수 있다. 인큐베이션은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 또는 96시간 (또는 그 사이의 임의의 시간) 동안 이루어질 수 있다.
탈세포화 용액 및/또는 계면활성제 또는 다른 탈세포화 작용제의 농도에의 노출 시간의 길이는 탈세포화 정도 및 근육 조직으로부터의 근섬유 또는 미오신 제거를 제어하기 위해 조정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 계면활성제는 근육 조직으로부터 세포를 제거하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 소듐 데옥시콜레이트, SDS, 및/또는 TRITON X-100™은 세포외 조직 매트릭스로부터 원치않는 조직 성분을 탈세포화하고 분리하는데 사용될 수 있다.
조직 샘플을 탈세포화하는 방법은 일부 실시양태에서, 프로세싱 이전에 조직 샘플에서 정상적으로 발견되는 근섬유의 적어도 일부를 보유하도록 제어될 수 있다. 예를 들어, 탈세포화 용액 및/또는 트립신 용액의 노출의 길이 및/또는 농도는 근섬유 제거 정도를 제어하기 위해 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 지속기간 및/또는 농도는 트립신 처리/다른 효소 처리 및 탈세포화 이전에 근육 조직에서 정상적으로 발견되는 근섬유의 약 20-80%를 제거하도록 선택된다. 특정 실시양태에서, 지속기간 및/또는 농도는 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90 퍼센트의 근섬유 (또는 그 사이의 임의의 백분율)를 제거하도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 15분 내지 24 또는 48시간 동안 조직 샘플을 10-10-0.5% 범위의 농도의 트립신에 노출시킴으로써 및/또는 0.1-72시간 동안 근육 조직 샘플을 약 0.1-2.0%의 탈세포화 작용제 (예를 들어, TRITON X-100™ 또는 다른 비이온성 옥틸페놀 에톡실레이트 계면활성제, 소듐 도데실 술페이트, 소듐 데옥시콜레이트, 또는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)에 노출시킴으로써 약 20-80%의 근섬유가 제거된다.
근섬유의 양은 다수의 방식으로 분석될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 잔류 근섬유는 광학 현미경검사를 사용하여 평가될 수 있다.
대안적으로, 근섬유를 보유하기보다는, 본원에 기재된 근육 매트릭스는 원하는 양의 잔류 미오신을 생성하도록 처리될 수 있다. 미오신은 근섬유 함량과 상관관계를 가질 수 있지만, 효소-연관 면역흡착 검정법 (ELISA)을 이용하여 직접 측정될 수 있다. 따라서, 다양한 실시양태에 따라, 본원에 기재된 근육 매트릭스를 신선한 근육에서 발견되는 미오신 중 10-50%, 신선한 근육에서 발견되는 미오신 중 20-30%, 또는 특정 미오신 농도 (예를 들어, 50-150 μg/ml 또는 75-150 μg/ml)를 갖도록 처리될 수 있다. 상기 근섬유 또는 미오신 함량은 광학 현미경검사에 의해 측정되는 바, 실질적으로 무세포가 되도록 프로세싱된 조직을 이용하여 수득될 수 있다.
다른 실시양태에서, 프로세싱 이전에 조직 샘플에서 정상적으로 발견되는 근섬유의 적어도 일부를 보유하면서, 조직 샘플을 탈세포화하는 방법은 탈세포화 또는 효소 용액의 부피 대비 조직 질량의 비 (예를 들어, 트립신 또는 다른 효소 및/또는 탈세포화 작용제를 함유하는 용액의 부피당 조직 질량)를 조정함으로써 제어될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용액의 부피 대비 조직의 비가 낮을수록 근섬유 제거 프로세스의 효율은 증가될 수 있고, 따라서, 더 적은 양의 무손상 근섬유를 보유하는 탈세포화된 매트릭스를 초래할 수 있다. 다른 실시양태에서, 용액의 부피 대비 조직의 비가 높을수록 근섬유 제거 프로세스의 효율은 감소될 수 있고, 따라서, 더 많은 양의 무손상 근섬유를 보유하는 탈세포화된 매트릭스를 초래할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 탈세포화된 근육 조직 내의 세포외 스캐폴드는 콜라겐 (특히, 콜라겐 타입 I 또는 타입 III), 엘라스틴, 근섬유, 및/또는 다른 섬유 뿐만 아니라, 프로테오글리칸, 폴리사카라이드, 및/또는 성장 인자 (예를 들어,IGF, EGF, Ang 2, HGF, FGF, 및/또는 VEGF)를 포함할 수 있다. 근육 매트릭스는 자연적으로 탈세포화 이전에 근육에서 발견되는 세포외 매트릭스 성분 중 일부 또는 그들 모두를 보유할 수 있거나, 또는 다양한 비바람직한 성분은 화학적, 효소적, 및/또는 유전적 수단에 의해 제거될 수 있다. 일반적으로, 근육 세포외 매트릭스는, 환자에서의 이식 후에 그 내부로 천연 세포 및 혈관구조가 이동, 성장, 및 증식할 수 있는, 섬유, 프로테오글리칸, 폴리사카라이드, 및 성장 인자를 포함하는 구조적 스캐폴드를 제공한다. 세포외 매트릭스의 정확한 구조적 성분은 선택된 근육 및/또는 근막의 유형 및/또는 탈세포화된 조직을 제조하는데 사용된 프로세스에 의존하게 될 것이다.
특정 실시양태에서, 근육을 포함한 조직 샘플은 세포 제거 이전, 그 동안, 또는 그 이후에 생화학적 및/또는 구조적 분해를 회피하기 위하여 조직을 안정화시키도록 화학적으로 처리될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 안정화 용액은 삼투성, 저산소성, 자가용해성 분해를 정지 및 방지할 수 있고/거나; 미생물 오염으로부터 보호할 수 있고/거나; 탈세포화 동안 발생할 수 있는 기계적 손상을 감소시킬 수 있다. 안정화 용액은 적절한 완충제, 하나 이상의 항산화제, 하나 이상의 삼투압제, 하나 이상의 항생제, 하나 이상의 프로테아제 억제제, 및/또는 하나 이상의 평활근 이완제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 안정화 용액은 글루타티온, n-아세틸시스테인, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 카탈라제, 또는 글루타티온 퍼옥시다제를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 하나 이상의 자유 라디칼 제거제를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 근육 임플란트는 하나 이상의 추가 작용제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 작용제(들)는 항염증제, 진통제, 또는 임의의 다른 원하는 치료적 또는 유익한 작용제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가 작용제(들)는 적어도 하나의 첨가되는 성장 또는 신호전달 인자 (예를 들어, 소세포 성장 인자, 혈관신생 인자, 분화 인자, 시토카인, 호르몬, 및/또는 케모카인)를 포함할 수 있다. 이들 추가 작용제들은 천연 근육 이동, 증식, 및/또는 혈관형성을 촉진시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 성장 또는 신호전달 인자는 발현 벡터 내에 함유되어 있는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 본원에 사용된 바와 같이, "발현 벡터"라는 용어는 세포에 의해 흡수될 수 있고, 원하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 함유하며, 세포에 의한 원하는 단백질의 적어도 최소 발현을 보장하는 다른 필요한 핵산 서열 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 개시 및 종결 코돈 등)을 함유하는 임의의 핵산 구축물을 지칭한다.
탈세포화 후, 추가의 프로세싱 단계를 수행할 수 있다 (단계 160). 특정 실시양태에서, 매트릭스는 비바람직한 항원, 예를 들어, 수용자 동물에 의해서는 정상적으로 발현되지 않고, 따라서, 면역 반응 및/또는 거부를 일으킬 가능성이 있는 항원을 제거하기 위해 하나 이상의 효소로 처리될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 근육 조직은 알파-갈락토스 (α-gal) 모이어티를 제거하기 위해 알파-갈락토시다제로 처리될 수 있다. 일부 실시양태에서, α-gal 에피토프를 효소적으로 제거하기 위해, 염수로 근육 조직을 철저히 세척한 후, 샘플 중에 존재한다면, 조직에 대해 하나 이상의 효소 처리를 수행하여 α-gal 항원을 제거할 수 있다. 특정 실시양태에서, α-gal 에피토프를 실질적으로 제거하기 위해 근육 및/또는 근막 조직을 α-갈락토시다제 효소로 처리할 수 있다. 추가로, 알파-1,3-갈락토스 모이어티를 감소 또는 제거하기 위해 조직을 프로세싱하는 특정의 예시적인 방법은 문헌 [Xu et al., "A Porcine-Derived Acellular Dermal Scaffold That Supports Soft Tissue Regeneration: Removal of Terminal Galactose-α-(1,3)-Galactose and Retention of Matrix Structure" Tissue Engineering Part A, Vol. 15(7), 1807-1819 (2009)]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 탈세포화 후, 근육 조직은 철저히 세척된다. 임의의 생리학적으로 화합성인 용액이 세척에 사용할 수 있다. 적합한 세척 용액의 예는 증류수, 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS), 또는 임의의 다른 생체적합성 염수 용액을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척 용액은 살균제 예컨대 약산을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 이종발생성 또는 동종 물질이 사용될 때, 탈세포화된 근육 조직은 데옥시리보뉴클레아제 (DNase) 용액으로 (예를 들어, 실온에서 밤새) 처리된다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 DNase 용액으로 처리된다. 임의적으로, 항생제 용액 (예를 들어, 젠타마이신)이 DNase 용액에 첨가될 수 있다. 임의의 적합한 DNase 완충제 및/또는 항생제가 사용될 수 있다
다양한 실시양태에서, 미립자 탈세포화된 근육 매트릭스를 포함하는 근육 임플란트가 개시된다. 따라서, 효소 및 탈세포화 단계 이전 또는 이후, 조직은 미립자로 형성될 수 있다 (단계 170). 예를 들어, 상기 기재된 탈세포화된 근육 매트릭스는 커팅, 블렌딩, 동결파쇄, 또는 다르게는 균질화되어 미립자 매트릭스를 형성할 수 있으며, 이는 동결건조 및 건식 저장되거나, 또는 겔, 히드로겔, 또는 다른 수용액 중 현탁되어 저장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 미립자 탈세포화된 근육 매트릭스는 쉽게 몰딩되어 임플란트 부위를 충전시킬 수 있는 유동가능한 및/또는 주사가능한 조성물로서 사용될 수 있고, 근육 결함을 복구시키거나, 약화된 근육 조직을 벌크 업하거나, 또는 건강한 근육 조직을 증강시키는데 사용될 수 있다.
미립자는 다수의 프로세싱 단계를 사용하여 형성될 수 있다. 예를 들어, 미립자를 생성하는데 적합한 방법은 동결밀링, 동결분쇄, 생검 펀칭, 육류 분쇄기, 수동식 초핑, 또는 건식 밀링을 포함할 수 있다. 미립자 형성을 위한 구체적인 방법은 원하는 크기 범위를 생성할 수 있도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 미립자 크기는 표준 크기의 시린지 또는 캐뉼라를 사용하여 주사할 수 있도록 선택될 수 있다. 적합한 입자의 크기 범위는 약 3 μm 내지 약 5,000 μm일 수 있다. 추가로, 입자는 입자 크기 범위를 생성할 수 있도록 분류 또는 (예를 들어, 체를 이용하여) 여과될 수 있다. 바람직한 크기 범위는 100 μm (동결밀링 방법) 내지 800 μm (동결분쇄 방법)이다. 입자 크기는 다양한 인자 또는 사용 의도에 기반하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 미용용 주사제는 우선적으로 더 큰 크기 예컨대 700-800 μm를 요구할 수 있는 반면, 매우 작은 바늘을 요하는 적응증 (예를 들어, 괄약근 주사제)는 더 작은 크기 예컨대 50-200 μm를 필요로 할 수 있다.
입자 형성 후 또는 시트 조직을 이용하여, 저장 및 멸균을 위해 조직을 제조할 수 있다. 예를 들어, 단계 (180)에 명시된 바와 같이, 조직을 저장 또는 보호 용액 중에 배치할 수 있다. 적합한 보호 용액은 수용액 또는 동결보호제, 항박테리아제, 방사선 보호 물질, 또는 조직을 안정화시키는 물질을 포함하는 용액을 포함할 수 있다. 적합한 저장 용액은, 예를 들어, 2014년 5월 27일 등록되고, 발명의 명칭이 "Acellular Tissue Matrix Preservation Solution"인 미국 특허 8,735,054에 기재되어 있다.
용액 중에 배치한 후, 조직을 최종적으로 멸균시킬 수 있다 (단계 190). 멸균은 화학적 멸균 또는 방사선 (예를 들어, 감마, e-빔, 또는 UV)을 이용하여 수행될 수 있다. 적합한 멸균 프로세스는 상기 언급된 미국 특허 8,735,054에서 논의된 바 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
사용 방법
다양한 실시양태에서, 근섬유의 적어도 일부를 보유하는 탈세포화된 근육 매트릭스를 포함하는 근육 임플란트는 (예를 들어, 벌크 근육 손실 부위를 충전시키기 위해 또는 근육 조직을 미용상 증강시키기 위해) 환자 내로 이식될 수 있다. 일부 실시양태에서, 근육 매트릭스 중 잔류 근섬유는 임플란트 부위에서 염증 반응을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 염증 반응은, 증가된 반흔 조직 형성 및/또는 임플란트 거부를 초래할 수 있는 과도한 염증을 유발하지 않으면서, 환자의 근육 복구 기구를 개시 및/또는 증강시키는데 충분하다. 일부 실시양태에서, 염증 반응 유도는, 예를 들어, 근육 매트릭스에 침투하는 대식세포 및 근모세포를 동원함으로써, 및 근육 매트릭스에 의해 제공되는 스캐폴드 내에서 근육으로 분화하는 위성 세포를 활성화시켜, 이로써, 임플란트를 근육 조직으로 리모델링함으로써 환자에서 근육 복구를 개시 및/또는 증강시킨다. 다양한 실시양태에서, 선천 근육 복구 기구의 활성화는 임플란트 부위에서의 근육 복구/재생의 정도 및/또는 동역학적 성질을 증가시킨다. 그에 반해, 임플란트 부재 하에서, 또는 정상 근섬유 함량 또는 임의의 근섬유를 결여한 탈세포화된 조직을 포함하는 임플란트를 사용할 때의 근육 복구는 더욱 느린 근육 복구 속도 및 더 낮은 수준의 근육 조직 형성 (및 이에 동반하여 결합 및/또는 반흔 조직 형성 증가)을 초래한다.
일부 실시양태에서, 미립자 근육 임플란트는 근육 조직에서 공극 공간을 충전시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 수용액 중 미립자 근육 임플란트는 임플란트 부위로 유동되어 원하는 공간을 충전시키고/거나 근육 조직의 벌크를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 미립자 근육 임플란트는 임플란트 부위를 더욱 완전하게 충전시키기 위해 비-미립자 근육 임플란트 주변의 공간을 패킹하는데 사용될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같이, 근육 임플란트는 근육 조직의 복구, 변경, 재생, 및/또는 증강이 요구되는 임의의 외과 수술에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 근육 임플란트는 복벽 결함의 복구 (예를 들어, 탈장 복구, 총상, 또는 다른 복부 외상)에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 근육 임플란트는 또한 벌크 근육 조직의 외과적 제거 후에 (예를 들어, 육종 또는 골육종을 제거하는 외과적 개입 후에) 사용될 수 있다. 이들 실시양태에서, 근육 임플란트는 환자의 근육 복구 경로를 동원하는 (예를 들어, 대식세포/근모세포 동원 및 위성 세포 활성화) 역할을 하는 염증을 충분한 (그러나, 과도하지 않은) 수준으로 유도함으로써 근육 복구를 개시 및/또는 근육 복구의 속도 및 전체 부피를 개선시킬 수 있다. 그에 반해, 근육 임플란트를 받지 않은 환자에서 및 임의의 잔류 근섬유를 결여한 무손상 근육 또는 탈세포화된 조직을 포함하는 임플란트를 받은 환자에서는 근육 복구의 속도 및 전체 부피가 감소된다. 유사하게, 환자에서 또 다른 위치로의 이식을 위해 근육 조직이 한 근육으로부터 수거되는 외과 수술에서, 상기 기재된 바와 같은 근육 임플란트는 이식 수술 이후 수거 부위에서의 근육 복구의 속도 및 전체 정도를 촉진시키는데 도움을 줄 수 있도록 수거 부위에 배치될 수 있다.
일부 실시양태에서, 근육 임플란트는 천연 근육 부피를 증강시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 근육 임플란트는 근육 소모성 질환 치료의 일부로서 사용될 수 있으며, 이로써, 복구 및 재생 속도는 증강되고/거나, 임플란트 부위의 근육의 전체 부피는 증가될 수 있다. 또 다른 예에서, 임플란트는 임플란트 부위에서 추가의 근육 부피 성장을 촉진시킴으로써 근육 조직의 외관을 미용상 증강시키는데 사용될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 근육 매트릭스는 시트 또는 미립자 형태로 제공될 수 있다. 시트 형태로 제공될 때, 매트릭스는 진피 매트릭스 (예를 들어, 알로덤(ALLODERM)® 또는 스트래티스(STRATTICE)), 또는 생물학적, 합성 (예를 들어,폴리프로필렌), 생분해성, 또는 생체흡수성 메쉬와 조합될 수 있다. 조합될 때, 근육 및 진피 물질의 시트는, 예를 들어, 접착, 봉합, 또는 다르게는, 연결시킴으로써 층상화 및 부착될 수 있다.
이식될 때, 시트 물질은 단독으로 또는 진피 매트릭스, 또는 생물학적, 합성 (예를 들어,폴리프로필렌), 생분해성, 또는 생체흡수성 메쉬와 조합되어 근육 결함에 배치될 수 있다. 진피 매트릭스가 사용된다면, 진피 매트릭스는 구조적 지지부를 제공할 것이며, 이는 결합 조직의 재생을 위한 기재를 제공할 수 있다. 예를 들어, 근육/진피 물질은 기능적 근육이 요구되는 부위에 인접한 근육과 함께 복부 결함에 배치될 수 있고, 진피 물질은 복부 근막 층이 정상적으로 존재하게 되는 위치에 배치될 수 있다.
미립자 근육 매트릭스는 다수의 방식으로 이식될 수 있다. 예를 들어, 언급된 바와 같이, 미립자는 근육 결함에 제공될 수 있거나, 또는 천연 근육을 증강 또는 확장시키기 위해 제공될 수 있다. 추가로, 미립자는 단일 주사제 또는 주사제들로 근육 부위에 제공될 수 있거나, 또는 다회 주사가 수행될 수 있다. 예를 들어, 주사제는 후속 치료 동안, 예를 들어, 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 그 초과의 다양한 간격을 두고 투여될 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 다회 주사는 단일 치료 시간에 수행될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 개시내용을 예시하는 역할을 하며, 어느 방식으로든 제한하는 것은 아니다.
실시예 1: 근육 임플란트 제조 및 기계적 분석
돼지 골격근을 절개하고, 사용할 준비가 될 때까지 동결 저장하였다. 이어서, 조직을 세척하고, 5 mm 두께의 슬라이스 또는 시트로 커팅하고, 염화암모늄 용해 완충제로 세척하여 RBC를 제거하였다. 근육 샘플을 트립신으로 처리하였다. 이어서, 샘플을 HEPES 용액 중에서 세척하기 전에, 계면활성제를 함유하는 탈세포화 용액 중에 배치하였다. 샘플을 DNase로 처리하여 조직 중 잔류 임의의 DNA를 제거한 후, 이어서, 알파-갈락토시다제로 밤새 처리하여 조직 상의 알파 gal 에피토프를 제거하였다. 샘플을 약산에 노출시키고, 세척하고, e-빔 방사선에 노출시켰다.
트립신에의 및 탈세포화 용액에의 노출을 제거함으로써 근섬유 제거 정도를 조정하였다.
이어서, 탈세포화된 근육 매트릭스에 대해 다양한 크기 축소 프로세스를 수행하여 주사에 적합한 미립자 매트릭스를 생성하였다. 크기 축소는 동결밀링, 동결분쇄, 생검 펀칭, 육류 분쇄기, 또는 건식 밀링을 사용하여 수행하였다. 입자는 또한 수동식 초핑에 의해, 예를 들어, 스칼펠을 이용하여 형성될 수 있다.
크기 축소 후, 입자 크기를 분석하였다. 간략하면, 탈이온수 중 5%의 pAMM 고용체로 이루어진 10 mL 샘플을 제조하고, 호리바 파티클 애널라이저(Horiba Particle Analyzer)를 이용하여 제조사의 지침서에 따라 분석하였다. 샘플당 3회 실행하였고, 평균값을 결정하였다. 하기 표 1은 각 크기 축소 방법에 대한 입자 크기 정보를 제공한다.
표 1. 다양한 크기 축소 방법을 이용하여 생성된 주사가능한 입자에 대한 크기 범위
Figure pct00001
상이한 입자를 사용하여 주사가능성의 용이성을 평가하기 위해, 주사력을 측정하였다. 간략하면, 100 N 로드 셀 및 50 N 압반을 이용하여 인스트론(Instron) 기계적 시험 시스템을 셋업하였다. 시린지를 베이스 플레이트 상에 로딩하고, 25 mm에 대해 1 mm/sec로 시린지의 플런저를 압축시켜 생성된 힘을 측정하였다. 하기 표 2는 주사력 데이터를 제공한다.
표 2. 다양한 방법을 이용하여 생성된 크기가 축소된 pAMM 슬러리를 1 mL 시린지를 통해 주사하는데 필요한 최대 힘
Figure pct00002
제시된 바와 같이, 최저 주사력은 동결밀링된 생성물인 경우에 생성되었다.
프로세싱, 잔류 DNA 함량을 분석하였고, 프로세싱된 조직의 DNA를 약 20 ng/mg으로 감소시켰다. 추가로, 조직 샘플을 분석하여 무세포성을 확인하였다. 도 2A 및 2B는 프로세싱된 근육 (생검 펀칭된 샘플)과 비교하여 신선한 근육을 제시하는 것이다. 제시된 바와 같이, 신선한 근육 (샘플 A)은 핵 (흑색 반점)을 보여하는 반면, 핵의 결여에 의해 나타나는 바와 같이, 프로세싱된 근육 (샘플 B)은 무세포이다.
추가로, 시트 또는 미립자 형태 중 pAMM의 잔류 미오신 함량을 ELISA로 분석하고, 신선한 근육의 것과 비교하였다. 도 3에 제시된 바와 같이, 시트 및 미립자 근육 매트릭스의 미오신 함량은 상대적으로 유사하였고, 신선한 근육의 것보다는 유의적으로 더 낮았다. 본 결과는 근육 형성을 유도하는데 필요한 근섬유 잔류를 시사한다.
실시예 2: 돼지 무세포 진피 매트릭스 ( pADM ) 및 ( pAMM )가 근육 재생에 미치는 효과.
15 x 5 x 5 mm (길이 x 너비 x 깊이) 크기로 측정되는 근육 조각을 제거하여 래트 직근에 결함을 생성하였다. 돼지 무세포 진피 매트릭스 (pADM) (스트래티스®) 또는 pADM 및 시트 pAMM의 조합을 이용하여 결함을 복구시켰다.
도 4A 및 4B는 결함 생성 및 돼지 무세포 진피 매트릭스 (도 4A), 또는 돼지 무세포 진피 매트릭스 및 돼지 무세포 근육 매트릭스의 조합 (도 4B)을 이용한 치료 후 6주째의 래트 복직근 결함의 트리콤 염색된 섹션이다. pADM만을 이용한 경우에는 복구된 결함에서 최소 근육 재생이 검출되었다. 그러나, pADM 및 pAMM의 조합을 이용한 경우에는 결함 생성 및 복구 후 6주째 복구된 결함에서 상당한 근육 재생이 검출되었다. 결합 조직은 청색으로 염색되고, 근섬유는 적색으로 염색된다.
pAMM은 래트에서 근육 재생을 지지한다. 게다가, 오직 근육 매트릭스만이 근육 재생을 지지할 수 있다.
실시예 3: 래트에서의 근육 기능성 회복.
pAMM-지지된 근육 재생이 기능 개선으로 바뀔 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 연속 러닝 휠 및 수축력을 연구하였다. 대략 10 x 8 x 4 mm (길이 x 너비 x 깊이) 크기 및 20 질량%의 근육 조각을 제거하여 각 래트의 한쪽 다리의 비복근에 결함을 생성하였다. 결함을 비복구 상태로 방치하거나 또는 시트 pAMM을 이용하여 복구시켰다. 각 동물의 나머지 다른 한쪽 다리의 비복근은 손대지 않고 그대로 두었고, 이는 반대측 대조군으로서의 역할을 하였다.
컴퓨터 인터페이스에 연결된 전자식 카운터가 장착된 러닝 휠을 동물 케이지에 배치하여 결함 생성 및 복구 이후 그의 자발적 활동 및 휠 사용을 모니터링하였다. 추가적으로, 비복근을 통해 흐르는 좌골 신경의 경피적 전기 자극법에 의해 외과적으로 이환된 근육 및 반대측 근육 둘 다에 근육 수축을 유도하였다. 이어서, 수축력을 측정하였다.
도 5는 비복근 결함이 비처리 상태로 방치된 래트 또는 pAMM을 이용하여 복구된 래트의 러닝 거리로 측정된 바와 같은 기능적 근육 회복의 그래프이다. 도 6은 반대측 래트 근육에 의해 가해진 힘과 비교하여, 비복구 상태로 방치된 또는 pAMM을 이용하여 복구된 결함을 함유하는 래트 근육에 의해 가해진 수축력의 백분율에 의해 측정된 바와 같은 기능적 근육 회복의 그래프이다. 결함이 pAMM 이용으로 복구된 래트 (pAMM 이용 그룹)는 결함이 비복구 상태로 방치된 래트 (pAMM 비이용 그룹)보다 더 이른 시점에 러닝을 시작하였고, 더 많이 러닝하였다. 게다가, 결함이 pAMM 이용으로 복구된 근육 (pAMM 이용 그룹)은 결함이 비복구된 근육보다 더 큰 힘을 가하였다. 특히, 다른 연구는 새 근육의 신경 분포의 증거를 제공하였다.
실시예 4: 근육이 손상된 래트에서의 주사가능한 매트릭스의 생체내 효과
래트 모델을 이용하여, 상기 기재된 바와 같이 제조된 주사가능한 근육 매트릭스를 연구하였다. 육류 분쇄기 방법을 이용하여 미립자 조직을 제조하였다. 15 x 4 x 4 mm (길이 x 너비 x 깊이) 크기의 근육 조각을 제거하여 각 래트의 한쪽 다리의 전경골 (TA) 근육에 결함을 생성하였다. 결함을 비복구 상태로 방치하거나 또는 주사가능한 pAMM을 이용하여 복구시켰다. 각 래트의 나머지 다른 한쪽 다리의 TA 근육은 손대지 않고 그대로 두었고, 이는 반대측 대조군으로서의 역할을 하였다. 동물을 희생시킨 후, 양쪽 다리 모두로부터 TA 근육을 잘라내고, 근육 중량 및 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 및 트리콤 염색을 이용하는 조직학적 염색에 대해 평가하였다.
도 7A 및 7B는 결함 생성 후 3주째의 래트 전경골 (TA) 근육 결함의 트리콤-염색된 영상을 제공한다. 결함을 비복구 상태로 방치하거나 (A), 또는 결함 생성 후 즉시 주사가능한 pAMM을 이용하여 복구시켰다 (B). 비복구된 결함은 결합, 반흔 조직으로 충전되었고, 새 근육은 거의 형성되지 않았다. 주사가능한 pAMM을 이용하여 복구된 결함은 새 근육이 형성되었음을 보이는 뚜렷한 증거를 나타내었다.
도 8은 결함 생성 후 3주째의 주사가능한 pAMM을 이용하여 복구되거나, 또는 복구되지 않은 TA 근육 중량으로서, 반대측 근육과 비교된 것을 예시한 막대 그래프이다. pAMM을 받은 TA 근육의 중량은 거의 반대측 근육만큼의 중량인 반면, 결함이 비복구된 TA 근육의 중량은 반대측 근육보다 유의적으로 더 적은 중량이었다. 따라서, 주사가능한 pAMM은 래트 결함 부위에서 근육 재생을 지지한다. 그래프에 표시된 백분율은 각 그룹에서 반대측 TA 근육과 비교한 TA 근육 중량의 비를 나타내는 것이다.
실시예 5: 근육이 손상된 영장류에서의 주사가능한 매트릭스의 생체내 효과
대략 42 x 12 x 7 mm (길이 x 너비 x 깊이) 크기 및 20 질량%의 근육 조각을 제거하여 각 영장류 (아프리카 녹색 원숭이)의 한쪽 다리의 비복근에 결함을 생성하였다. 결함을 비복구 상태로 방치하거나 (음성 대조군 그룹), 시트 또는 주사가능한 pAMM (수동식 초핑에 의해 제조됨)을 이용하여 복구시키거나, 또는 민싱된 자가조직 영장류 근육을 이용하여 복구시켰다 (양성 대조군 그룹).
도 9A 및 9B는 결함 생성 후 12주째의 영장류 비복근 결함의 트리콤-염색된 영상이다. 결함을 비복구 상태로 방치하거나 (A), 또는 결함 생성 후 즉시 pAMM을 이용하여 복구시켰다 (B). 연구 결과는 비처리 상태로 방치된 결함에서는 최소 근육 재생이 일어난 것으로 제시하였다. 결함 부위는 결합 반흔 조직으로 충전되었다. 그에 반해, 어느 형태든 pAMM (시트 또는 주사가능한 것)으로 복구된 결함에서는 다중의 새 근육 다발이 검출가능하였다. 일부 경우에서, 재생 정도는 민싱된 자가조직 영장류 근육을 이용하여 복구된 결함에서 관찰된 것과 유사하였다. pAMM은 영장류에서 근육 재생을 지지할 수 있다.
실시예 6: 근육이 손상되지 않은 래트에서의 새 근육 형성을 지지하는 주사 가능한 매트릭스의 생체내 효과
실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 동결밀링된 주사가능한 돼지 무세포 근육 매트릭스 (pAMM)를 (결함이 없거나 또는 결함이 생성되지 않음) 각 래트의 우측 다리의 정상 전경골 (TA) 근육에 주사하였다. 좌측 다리의 TA 근육은 어떤 pAMM도 받지 않았고, 이는 각 동물에 대한 반대측 대조군으로서의 역할을 하였다. 동물을 1주, 2주, 및 3주째에 희생시켰다. 주사를 맞은 다리 및 반대측 다리 둘 다로부터 TA 근육을 잘라내고, 육안적 관찰, 근육 중량 및 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 및 트리콤 염색을 이용하는 조직학적 염색에 대해 평가하였다.
도 10A 및 10B는 주사 후 1 또는 3주째의 pAMM 주사를 맞은 래트 TA 근육의 육안적 횡단면 영상을 제공한다. 이식된 pAMM은 1주째인 시점에는 쉽게 관찰되었지만, 연구 기간 내내 감소하였다. 3주째인 시점에는 육안으로는 어떤 pAMM도 검출되지 않았지만, 조직학상으로는 잔류량이 검출가능하였다.
게다가, 트리콤 및 H&E 염색된 외식편 평가 시, 조사된 모든 시점에 새 근섬유의 증거가 나타났다. 도 11은 이식 후 3주째의 pAMM 주사를 맞은 TA 근육의 H&E 염색된 횡단면 영상을 도시한 것이다. 3주째, 천연 근육 중의 것과 크기가 유사한 새 근섬유의 큰 다발이 특히 잔류 pAMM 주변 부위에서 검출가능하였다. 다수의 새 근섬유 다발은 새로 형성된 다발 및 성숙한 다발의 특징이 되는 특성인, 중앙에 위치한 핵을 함유하였다.
3주째, pAMM을 받은 TA 근육의 중량은 반대측 근육의 중량보다 더 컸다. 도 12는 처리 후 3주째의 pAMM 주사를 맞거나 또는 맞지 않은 래트 TA 근육의 막대 그래프로서, 기존 근육량을 강화시킬 수 있는 pAMM의 능력을 제시하는 것이다. (육안적으로 또는 조직학적으로) 검출가능한 반흔 조직이 없고, 오직 잔류량의 pAMM만이 검출가능하였는 바, 추가 중량은 오직 새 근육에 기인하는 것일 수 있다. 주사가능한 pAMM은 근육이 손상되지 않은 래트에서 근육 형성 (재생)을 지지한다.
실시예 7: 반복 처리에 대한 연구
pAMM을 이용한 반복 처리가 새 근육의 형성량을 증가시키는지 여부를 결정하기 위해 추가 연구를 수행하였다.
래트를 3개 그룹으로 나누었다. 모든 그룹에서, pAMM (돼지 무세포 근육 매트릭스)을 래트의 우측 다리의 정상 TA 근육에 주사하였다. 좌측 다리의 TA 근육은 어떤 주사도 받지 않았고, 이는 반대측 대조군으로서의 역할을 하였다. 각각의 3개 그룹 중의 동물은 하기와 같이 상이한 시점에 상이한 횟수로 처리를 받았다:
그룹 1 - T = 0에서 pAMM 주사를 받은 동물
그룹 2 - T = 0 및 T = 3주째에 pAMM 주사를 받은 동물
그룹 3 - T = 0, T = 3주 및 T = 6주째에 pAMM 주사를 받은 동물
매회 처리 시 131 +/- 15 mg (평균 +/- stdev)의 pAMM을 동물에 주사하였다. T = 0에서의 제1 처리 후 9주째에 모든 동물을 희생시켰다.
9주 후, 1회 처리를 받은 근육의 중량은 그의 반대측 근육보다 평균 197 mg 더 컸다. 그러나, 3회 처리를 받은 근육의 중량은 그의 반대측 근육보다 평균 292 mg 더 컸다 (도 13).
제1 처리 후 9주째 주사를 맞은 근육과 반대측 TA 근육 사이의 중량 차이를 도시한 막대 그래프인 도 13에 예시된 바와 같이, 주사를 맞은 근육과 반대측 TA 근육 사이의 평균 중량 차이는 처리 횟수가 증가함에 따라 증가한다.
실시예 8: 입자 크기가 부피 잔류에 미치는 효과
더 큰 매트릭스 입자는 주사하기가 쉽지 않을 수도 있다는 것 (즉, 더욱 큰 바늘 또는 더 높은 주사력이 요구될 수 있다는 것)이 알려져 있다. 그러나, 입자 크기가 매트릭스 부피 잔류에 미치는 효과는 전반적으로 명확하지 않다. 따라서, 상이한 입자 크기를 이용하여 주사제를 제조하였다.
따라서, 본 연구의 목적은 pAMM 입자 크기가 (1) pAMM 생체내 잔류의 동역학적 성질, 또는 (2) 새 근육 형성 정도에 영향을 미치는지 여부를 결정하고자 하는 것이었다.
래트를 4개 그룹으로 나누었다. 모든 그룹에서, pAMM (돼지 무세포 근육 매트릭스)을 래트의 우측 다리의 정상 TA 근육에 주사하였다. 좌측 다리의 TA 근육은 어떤 주사도 받지 않았고, 이는 반대측 대조군으로서의 역할을 하였다. 각 그룹 중의 동물은 하기와 같이 상이한 물질을 받았다:
그룹 1 - 동결분쇄된 pADM을 받은 동물
그룹 2 - 동결밀링된 pAMM - ~100um 입자 크기 (제제 1)의 것을 받은 동물
그룹 3 - 동결분쇄된 pAMM - ~600um 입자 크기 (제제 2)의 것을 받은 동물
그룹 4 - 생검 펀칭된 pAMM - ~1.5mm 입자 크기 (제제 3)의 것을 받은 동물
대략 150 mg의 물질을 각 동물에 주사하였다. 각 그룹에 대해, 동물 중 절반은 주사 후 3주째에 희생시켰고, 동물 중 절반은 주사 후 6주째에 희생시켰다.
도 14는 주사를 맞은 근육에 상응하는 반대측 근육과 비교하여 상기 주사를 맞은 근육의 중량 증가의 백분율을 도시한 막대 그래프이다. 제제 1 주사를 맞은 근육은 3주 및 6주째 각각 그의 반대측 근육보다 중량이 22% 및 10% 더 컸다. (3주째 제제 1에 대한 그래프에 기록된 13% 차이는 본 연구로부터의 값과, 제제 1 물질을 또한 사용한 또 다른 연구로부터의 3주째 시점의 값의 평균이다). 제제 2 주사를 맞은 근육은 3주 및 6주째 각각 그의 반대측 근육보다 중량이 21% 및 17% 더 컸다. 제제 3 주사를 맞은 근육은 3주 및 6주째 각각 그의 반대측 근육보다 중량이 20% 및 11% 더 컸다.
제제 1 주사를 맞은 근육의 트리콤 염색된 영상은 주사 후 3주째에 어떤 잔류 pAMM도 검출가능한 것으로 나타나지 않은 반면, 제제 2 & 3 주사를 맞은 근육의 트리콤 염색된 영상은 주사 후 3주째에 소량이지만, 검출가능한 잔류량의 pAMM 3을 나타낸다 (도 15). 제제 1 또는 제제 2의 경우, 주사 후 6주째에 어떤 잔류 pAMM도 검출가능하지 않았다. 주사 후 6주째에 최소량의 제제 3이 여전히 검출가능하였다 (도 16).
pAMM의 생체내 잔류는 입자 크기와 반비례하며, 더 큰 입자가 더 작은 입자보다 더욱 장기간 보유된다. 그러나, 제제 2 pAMM 주사제는 주사 후 3주 및 6주 둘 다의 시점에서 주사를 맞은 근육과 반대측 근육 사이의 가장 큰 중량 차이를 초래하였다.
실시예 9: 트립신 농도가 근섬유 잔류에 미치는 효과
골격근에 적용되는 트립신의 농도가 골격근의 프로세싱, 특히, 근섬유의 잔류에 영향을 미칠 수 있다는 것은 알려져 있다. 따라서, 상이한 농도의 트립신을 사용하였고, 프로세싱된 샘플의 균일성을 각 조각 내에서 및 다른 것들과 비교하여, 이 둘 다의 방식으로 연구하였다. 조직의 균일성을 모든 프로세싱 단계 종료 시에 시각적 검사로 결정하였다.
돼지 근육 조직을 5 cm x 10 cm x 5 mm 크기로 슬라이싱하였다. 이어서, 조직 샘플을 동결시키고, 커팅하고, 보호 용액으로 처리하고, 트립신으로 처리하고, 탈세포화하고, PBS로 세척하고, 냉장고에서 저장하였다. 일단 커팅하고 나면, 조직 샘플을 실온에서 처리하였다. 대조군 조직은 트립신으로 처리하지 않았고, 대신 추가 기간 동안 PBS 중에 놓았다.
도 17A는 농도가 10-4 중량/부피인 트립신으로 처리된 조직 샘플을 도시한 것이다. 도 17B는 농도가 10-5 중량/부피인 트립신으로 처리된 조직 샘플을 도시한 것이다. 도 17C는 농도가 10-6 중량/부피인 트립신으로 처리된 조직 샘플을 도시한 것이다. 도 17D는 농도가 10-7 중량/부피인 트립신으로 처리된 조직 샘플을 도시한 것이다. 도 17E는 농도가 10-8 중량/부피인 트립신으로 처리된 조직 샘플을 도시한 것이다.
본 연구의 결과는 프로세싱 종료 시에 탈세포화된 조직의 시각적 검사 및 시차주사 열량측정법 측정에 의해 결정하였다. 본 연구에서, 연구된 트립신 농도의 범위는 돼지 조직 내에서 근섬유의 잔류를 제어할 수 있다는 점에서 적합한 것으로 보인다. 최종의 조직 외관은 각 조각에서 균일하였고, 조각마다 일관되었다. 고농도에서 (10-4에서 시작), 조직은 메쉬-유사한 형태적 특징을 발생시켰다. 10-7 내지 10-8 범위의 농도에서, 프로세싱된 근육 조직은 실험 프로세스 종료 시 그의 근섬유 대부분을 보유할 수 있는 것으로 보였다.
실시예 10: 트립신 농도 및 처리 시간이 미오신 잔류에 미치는 효과
다양한 시간 동안 상이한 트립신 농도에서 실시예 9에 기재된 연구를 반복하였다. 도 18은 트립신 처리 후 측정된 미오신 농도를 도시한 것이다.
6-8시간 동안 10-6 중량/부피인 농도의 트립신으로 처리하였을 때, 신선한 프로세싱되지 않은 근육 조직의 것의 40-60% 미오신 농도를 보유한 조직이 생성되었다. 6-8시간 동안 10-4 중량/부피인 농도의 트립신으로 처리된 조직은 밤새 동일한 트립신 농도로 처리된 조직과 비교하여 더 많은 미오신을 보여하였지만, 6-8시간 동안 10-6 중량/부피인 농도로 처리된 조직보다는 더 적게 보유하였다. 이들 결과는 미오신 농도가 시간 및 효소 농도에 의존한다는 것을 제안하는 것이다.
실시예 11: 트립신 및 브로멜라인이 근섬유 잔류에 미치는 효과
10-2 또는 10-4 중량/부피인 트립신 농도를 이용하여 실시예 9에 기재된 바와 같이 8 mm 및 5 mm의 돼지 근육 조직 샘플을 처리하였다. 일부 샘플은 10 유닛/리터 (U/L) 농도의 브로멜라인으로 처리하였다. 트립신으로 처리된 샘플을 4℃ 또는 실온인 온도에서 처리하였다. 트립신으로 처리된 샘플 일부는 횡단면을 따라 커팅하였고, 나머지 샘플을 종단면을 따라 커팅하였다.
도 19A는 트립신 또는 브로멜라인으로 처리되지 않은 대조군 조직을 도시한 것이다. 도 19B는 실온에서 10-4 중량/부피인 트립신 농도로 처리된 8 mm 두께의 돼지 근육 조직을 도시한 것이다. 도 19C는 실온에서 10-4 중량/부피인 트립신 농도로 처리된 5 mm 두께의 돼지 근육 조직을 도시한 것이다. 도 19D는 실온에서 10-2 중량/부피인 트립신 농도로 처리된 돼지 근육 조직의 횡단면을 도시한 것이다. 도 19E는 실온에서 10-2 중량/부피인 트립신 농도로 처리된 돼지 근육 조직의 종단면을 도시한 것이다. 도 19F는 4℃ 온도에서 10-2 중량/부피인 트립신 농도로 처리된 돼지 근육 조직의 횡단면을 도시한 것이다. 도 19G는 4℃ 온도에서 10-2 중량/부피인 트립신 농도로 처리된 돼지 근육 조직의 종단면을 도시한 것이다. 도 19H는 실온에서 10 U/L의 브로멜라인으로 처리된 5 mm 두께의 돼지 근육 조직을 도시한 것이다. 도 19I는 실온에서 10 U/L의 브로멜라인으로 처리된 8 mm 두께의 돼지 근육 조직을 도시한 것이다. 도 19J는 실온에서 100 U/L의 브로멜라인으로 처리된 돼지 근육 조직을 도시한 것이다.
돼지 조직 샘플을 프로세싱 종료 시 시각적 검사에 의해 평가하였다. 트립신을 사용하지 않고 프로세싱된 대조군 조직은 프로세싱 동안 근섬유 손실은 거의 없는 것으로 나타났다. 대조군 조직은 조밀하고, 불투명한 색상으로 보였다. 10-2 트립신 농도로 처리된 조직은 메쉬 유사 조직망을 남기면서, 뚜렷한 근섬유 손실을 보였다. 이는 조직이 횡단면 또는 종방향으로 프로세싱되었는지 여부에 관계없이 사실이었고, 4℃ 또는 실온 둘 다에서도 사실이었다. 10-4 트립신 농도를 사용하였을 때, 8 mm 두께의 근육 조직은 5 mm 두께의 근육 조직에 비해 훨씬 더 큰 근섬유 잔류를 보였다. 한편, 10U/L 브로멜라인 용액은 근섬유 제거에 대해 훨씬 더 적은 영향을 미치는 것으로 보였다. 도 20에 제시된 바와 같이, 100 U/L의 브로멜라인으로 처리된 조직은 처리 6시간 후 88%의 근섬유를 보유하였고, 처리 23시간 후에는 32%의 근섬유를 보유하였다.
상기 실시예는 본 개시내용을 예시하는 것이며, 어느 방식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다. 개시된 장치 및 방법의 다른 실시양태는 본원에 개시된 장치 및 방법에 관한 명세서 및 실행을 고려하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.

Claims (29)

  1. 하기 단계를 포함하는, 근육 임플란트를 제조하는 방법으로서:
    적어도 하나의 근육 샘플을 제공하는 단계;
    적어도 하나의 근육 샘플을 프로테아제를 함유하는 용액과 접촉시키는 단계;
    적어도 하나의 근육 샘플을 탈세포화하여 광학 현미경검사로 측정되는 바와 같이 적어도 하나의 탈세포화된 근육 매트릭스를 생성하는 단계; 및
    근육 매트릭스를 프로세싱하여 미립자 매트릭스를 생성하는 단계,
    여기서 프로테아제를 함유하는 용액과 접촉시키는 단계 및 탈세포화 단계가 프로세싱 이전에 근육 샘플에서 정상적으로 발견되는 근섬유의 적어도 일부를 보유하기 위해 제어되는 것인
    방법.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 근육 샘플이 적어도 2개 또는 적어도 3개의 근육 샘플인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 근육 샘플이 샘플을 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 도데실 술페이트, 소듐 데옥시콜레이트, 및 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트 중 적어도 하나를 포함하는 탈세포화 용액과 접촉시킴으로써 탈세포화되는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 용액의 노출 지속기간 및 농도를 제어하는 것이 프로세싱 이전에 근육 샘플에서 정상적으로 발견되는 근섬유의 약 20-80%를 보유하는 적어도 하나의 탈세포화된 근육 매트릭스를 초래하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 근육 샘플을 DNase와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 근육 샘플을 알파-갈락토시다제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 근육 샘플이 실질적으로 모든 알파-갈락토스 모이어티를 결여한 동물로부터의 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 근육 매트릭스를 프로세싱하여 미립자 매트릭스를 생성하는 단계가 근육 임플란트를 블렌딩, 커팅, 균질화, 또는 동결파쇄하여 미립자 근육 임플란트를 형성하는 것을 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 근육 임플란트를 처리하여 바이오버든을 감소시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 근육 임플란트를 e-빔 방사선에 노출시키는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제가 트립신, 세린 프로테아제, 또는 브로멜라인 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 근육 임플란트.
  13. 프로세싱되지 않은 근육 샘플에서 정상적으로 발견되는 근섬유의 적어도 일부를 함유하는 적어도 하나의 탈세포화된 근육 매트릭스를 포함하는 근육 임플란트로서, 여기서 근육 매트릭스는 미립자인 근육 임플란트.
  14. 제13항에 있어서, 적어도 하나의 탈세포화된 근육 매트릭스가 프로세싱되지 않은 근육 샘플에서 정상적으로 발견되는 근섬유의 약 20-80%를 함유하는 것인 근육 임플란트.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 탈세포화된 근육 매트릭스가 실질적으로 모든 알파-갈락토스 모이어티를 결여한 것인 근육 임플란트.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 근육 임플란트가 동결건조되거나 또는 수용액으로 존재하는 것인 근육 임플란트.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 근육 임플란트가 실질적으로 바이오버든을 결여한 것인 근육 임플란트.
  18. 환자 내로 근육 임플란트를 주사하는 단계를 포함하는 치료 방법으로서, 여기서 근육 임플란트는 프로세싱되지 않은 근육 샘플에서 정상적으로 발견되는 근섬유의 적어도 일부를 함유하는 미립자 탈세포화된 근육 매트릭스를 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 적어도 하나의 탈세포화된 근육 매트릭스가 프로세싱되지 않은 근육 샘플에서 정상적으로 발견되는 근섬유의 약 20-80%를 함유하는 것인 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 근육 임플란트가 적어도 하나의 탈세포화된 근육 매트릭스에 연결된 적어도 하나의 탈세포화된 진피 매트릭스를 추가로 포함하는 것인 방법.
  21. 제18항 또는 제19항에 있어서, 근육 임플란트가 적어도 하나의 탈세포화된 근육 매트릭스에 연결된 적어도 하나의 메쉬를 추가로 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 적어도 하나의 메쉬가 합성 메쉬, 생물학적 메쉬, 생분해성 메쉬, 및 생체흡수성 메쉬 중 적어도 하나인 방법.
  23. 제18항 또는 제19항에 있어서, 근육 임플란트가 미립자 형태의 것인 방법.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 근육 임플란트가 골격근 결함을 치료하는데 사용되는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 골격근 결함이 복부 결함인 방법.
  26. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 근육 임플란트가 벌크 근육 조직의 손실 또는 제거 이후에 사용되는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 벌크 근육 조직의 손실이 근육 소모성 장애에 기인하는 것인 방법.
  28. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 근육 임플란트가 건강한 근육 조직을 증강시키는데 사용되는 것인 방법.
  29. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 근육 임플란트가 약화된 근육 조직을 강화시키는데 사용되는 것인 방법.
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