CN104874020A - 具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法 - Google Patents

Abstract

一种具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：取健康成年的哺乳动物麻醉后，注射抗凝药物，打开腹腔选取小肠段，进行动、静脉血管插管固定并在近心端结扎离断血管。步骤二：夹闭小肠段的两端部，离断小肠段的两端部并分别插管固定，分离肠系膜，完整取下所需肠管及肠系膜血管，置于低温环境中，用生理盐水反复冲洗。步骤三：依次使用磷酸盐缓冲液、含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲液、十二烷基硫酸钠溶液、磷酸盐缓冲液、聚乙二醇辛基苯基醚溶液、磷酸盐缓冲液分别灌注动脉、静脉、肠管。步骤四：灌注完成后消毒。本发明的方法制得的小肠脱细胞支架能够保留完整的支架结构。

Description

具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，属于生物技术领域。 

背景技术

组织创伤或缺损是临床上常见的病症，如创伤引起的器官组织部分缺损，疝气、体表皮肤损伤、烧伤等，严重影响病人的生活质量，是医学上必须面对和亟待解决的难题。目前市场上用于组织修复的材料主要有两类：一类是聚丙烯、聚酯、聚四氟乙烯等高分子合成材料，但因其都是细菌良好的粘附载体，细菌粘附于其上后即可产生使其免受宿主免疫防御机制和抗生素作用的生物被膜，从而得以在局部长期成活并导致伤口的慢性感染，另外其生物相容性不佳，细胞难以长入，无法达到有效的结构和功能重建；另一类是生物衍生材料，由人的异体或哺乳类动物的膜状或者片状组织经理化处理而成的细胞外基质构成，其在组织相容性、稳定性上较合成材料都有较为显著的改善，但是临床应用效果不明显。原因是其制备过程破坏了天然的组织结构及其富含的生长因子等，从而延长组织修复时间或无法达到长期的组织结构替代和功能替代的作用。因而，需要一种生物相容性良好、具备天然组织的三维结构并且富含生长因子的支架材料来满足临床的需要。 

理想的组织工程修复与支架材料应该具备如下的条件：1.有良好的生物相容性和无抗原性，不会与受体发生免疫排斥反应；2.可降解性和降解速率可控性；3.维持生长在其上的细胞形态和表型，并增进细胞的粘附和生长，诱导组织再生最终形成完整的生物组织；4.有一定的空隙率便于组织间的营养和物质空气的交换；5.有一定的机械强度能够对组织起到支持的作用。 

目前关于小肠脱细胞支架的制备工艺过程简单，多局限在单独脱细胞上，总体来说都会存在脱细胞或者消毒不充分的问题，从而导致材料存在一定的免疫原 性和抗原性，同时现有的技术多采用物理和化学联合方法处理小肠，以达到脱细胞去抗原的目的。文献报道，物理和化学联合的方法处理小肠，能够完全去除小肠黏膜中的细胞成分，但同时也存在不少的缺点，如现有技术中机械刮除方法可导致组织结构破坏，支架材料撕裂或破损，甚至断裂，影响后续工艺进行，降低效率。而反复的化学处理可导致支架内的天然生长因子丢失，从而影响细胞生长及组织再生。并且由于传统的方法得到的小肠脱细胞支架没有完整的脉管网络，因此在进行大面积的组织修补时难以形成新生血管，修补的成功率低，效果差。 

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法。本发明所采用的技术方案如下： 

一种具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 

步骤一：取健康成年的哺乳动物麻醉后，肌肉注射抗凝药物，打开腹腔选取一段血供丰富的小肠段，分离小肠的肠系膜根部的动、静脉血管，进行动、静脉血管插管固定并在近心端结扎离断血管； 

步骤二：夹闭小肠段的两端部，离断小肠段的两端部并分别插管固定，分离肠系膜，完整取下所需肠管及肠系膜血管，置于低温环境中，用生理盐水反复冲洗； 

步骤三：依次使用磷酸盐缓冲液、含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲液、十二烷基硫酸钠溶液、磷酸盐缓冲液、聚乙二醇辛基苯基醚溶液、磷酸盐缓冲液分别灌注动脉、静脉、肠管； 

步骤四：灌注完成后使用过氧乙酸和乙醇混合液浸泡消毒，得到小肠脱细胞支架。 

另外，本发明的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤三中所有的PBS溶液的灌注时间为动脉、静脉、肠管各30min，动脉和静脉的灌注速度为3-15ml/min，肠管的灌注速度为50-500ml/min。 

另外，本发明的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，还可以具有这样的特征：其中，含乙二胺四乙酸的胰蛋白溶液的质量体积比为0.25%，灌注时所需温度为37℃，灌注时间为动脉、静脉、肠管各30min，动脉和静脉的灌注速度为3-15ml/min，肠管的灌注速度为50-500ml/min。 

另外，本发明的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，还可以具有这样的特征：其中，十二烷基硫酸钠溶液的质量体积比为0.1%，肠管的灌注时间为8小时，动脉和静脉的灌注时间均为4小时，动脉和静脉的灌注速度为3-15ml/min，肠管的灌注速度为50-500ml/min。 

另外，本发明的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，还可以具有这样的特征：其中，聚乙二醇辛基苯基醚溶液的质量体积比为1%，pH值为11.4，肠管灌注时间为4小时，灌注速度为50-500ml/min，动脉和静脉的灌注时间分别为1小时，灌注速度均为3-15ml/min。 

另外，本发明的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，还可以具有这样的特征：其中，过氧乙酸和乙醇的混合液 中过氧乙酸的终浓度为0.1-0.5%（V/V）乙醇的终浓度为2-10%（V/V），浸泡时间为3小时。 

另外，本发明的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，还可以具有这样的特征：其中，哺乳动物为实验用哺乳动物大鼠、犬、猪、兔之中的任意一种。 

另外，本发明的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，还可以具有这样的特征：其中，麻醉采用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。 

另外，本发明的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，还可以具有这样的特征：其中，抗凝药物为注射用低分子肝素，剂量为1000U/kg。 

发明作用与效果 

根据本发明的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，由于采取了联合供应血管一同获取小肠，经脱细胞处理后即可获得具有完整脉管网络的小肠脱细胞支架，具有完整的脉管网络可以使得在小肠脱细胞支架用于大面积修补的时候利于血管的形成，从而保证大面积修补的成功率和修补效果。另一方面，由于采用了合适灌注流量控制因此能够保持小肠脱细胞支架的完整性。另外，由于利用灌注法联合使用胰酶、SDS、Triton脱细胞达到了在较短时间内对小肠进行整体脱细胞的效果，同时保留了小肠的完整三维结构。 

附图说明

图1是本发明实施例二中大鼠小肠脱细胞支架电泳检测结果； 

图2是本发明实施例二中的大鼠小肠脱细胞支架的HE染色示例图； 

图3是施例二中大鼠小肠脱细胞支架的Masson染色图； 

图4是施例二中大鼠小肠脱细胞支架粘膜面的扫描电镜图； 

图5是实施例三中采用小肠脱细胞支架修复大鼠腹壁部分缺损及术后8周HE染色结果； 

图6是实施例三中采用小肠脱细胞支架修复大鼠腹壁部分缺损术后8周Masson染色图； 

图7CD31免疫荧光结果； 

图8是本发明实施例三中采用小肠脱细胞支架修复大鼠腹壁部分缺损术后8周CD3结果； 

图9是本发明实施例三中采用小肠脱细胞支架修复大鼠腹壁部分缺损术后8周CD68免疫组化结果； 

图10是本发明实施例二中的生长因子VEGF的含量图； 

图11是本发明实施例二中的生长因子b-FGF的含量图； 

图12是本发明实施例二中的生长因子TGF-β的含量图；以及 

图13是本发明实施例二中的体外成纤维细胞和支架共培养实验结果图。 

具体实施方式

实施方式中所使用的试剂的配方： 

磷酸盐缓冲液（PBS溶液），磷酸二氢钾(KH2PO4)0.24g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.44g，氯化钠(NaCl)8.0g，氯化钾(KCl)0.2g，加水至1000mL。 

本发明具体实施方式中未详细描述的实验方法均采用《分子生物学》，《细胞生物学》中所记载的常规实验方法和常规试剂完成。 

<实施例一> 

取成年大鼠，体重300～350g，称重后固定于实验台上，3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量为1ml/kg，待麻醉完全后肌肉注射低分子肝素500U全身抗凝处理。腹部消毒后铺手术巾，打开腹腔后选取一段血供丰富的空肠段，仔细分离所选取的空肠肠系膜根部的动、静脉血管，依次进行动、静脉血管插管固定并在近心端结扎离断血管。肠钳夹闭所需肠管两端，注意避开分支血管。离断肠段两端并分别插管固定，分离肠系膜完整取下所需肠管及肠系膜血管。用生理盐水反复冲洗，清除肠内外壁粘附的肠内容物及血迹，将肠段置于碎冰上进行下列操作：肠系膜动、静脉及肠管两端接入灌注泵，采用灌注流量：动脉、静脉流量为10ml/min，肠管流量为：50ml/min，依次使用PBS溶液灌注冲洗肠管及动、静脉各30分钟，0.5%（w/v）的EDTA和0.25%（w/v）的胰蛋白酶混合溶液灌注肠管及动、静脉各1个小时后使用PBS溶液灌注冲洗肠管及动、静脉冲洗残留的EDTA和胰蛋白酶，冲洗完成后使用0.1%SDS溶液（w/v）灌注冲洗肠管8小时，动脉和静脉各4小时，再使用1xPBS溶液灌注冲洗残留的SDS，1% Triton-X100溶液（w/v）灌注冲洗肠管4小时、动脉和静脉各1小时，PBS溶液依次灌注动脉端、静脉端、肠管各30分钟冲洗干净残留化学试剂，冲洗完成后使用0.5%（v/v）过氧乙酸和10%乙醇混合液（v/v）灌注浸泡消毒3小时，无菌1xPBS缓冲液水化保存，或者真空冻干（-80℃预冻4小时，-55℃冻干48小时）保存。 

<实施例二> 

采用实施例一的方法制备的小肠脱细胞支架经过一系列的体外检测实验，如DNA浓度检测，HE染色，Masson三色染色，扫描电镜，单轴力学性能测定。检测过程及检测结果如下： 

2-1.琼脂糖凝胶电泳检测实验： 

本发明制备的小肠脱细胞支架与正常未脱细胞处理的小肠DNA电泳实验，其结果如图1所示，图中Fresh表示正常未脱细胞处理的小肠样品，Trypsin（胰蛋白酶），SDS（十二烷基硫酸钠）和Triton（聚乙二醇辛基苯基醚）分别表示依次经过相应试剂处理后支架材料的DNA含量，可见经本发明制备的小肠脱细胞支架无DNA残留存在。 

2-2.HE染色实验： 

实施例一制备的小肠脱细胞支架经过HE染色后的试验结果如图2所示，可见本方法制得的小肠脱细胞支架保留了小肠的天然结构，而无细胞残留。 

2-3.Masson染色实验： 

实施例一制备的小肠脱细胞支架经过Masson染色后的试验结果如图3所示，可见本方法制得的小肠脱细胞支架主要成分为胶原。说明小肠脱细胞支架保留的为细胞外基质，免疫原性低。 

2-4.扫描电镜实验： 

本发明制备的小肠脱细胞支架经2.5%的戊二醛固定，进行扫描电镜检查，检查结果如图4，为放大一万倍的结果，可见，本方法制备的小肠脱细胞支架具有天然小肠的皱襞及凹陷结构。说明其保留了天然小肠粘膜面的三维超微结构。 

2-5.单轴力学实验： 

本发明制备的小肠脱细胞支架经单轴拉伸力学实验检测，测试结果如下表。 

可见本方法制备的小肠脱细胞支架较新鲜小肠力学强度更高，并具有较高的弹性系数。说明其可应用于修复一些对力学强度有要求的组织缺损，如体壁缺损等。 

2-6.生长因子含量测定： 

实验组为灌注法脱细胞小肠（简称PD-SIS），材料来源为大鼠，对照组为酸碱法脱细胞小肠粘膜下层（简称SIS），材料来源为大鼠。具体方法如下：取出预先消毒的研钵，将研钵放置于碎冰上预冷保持低温状态，取100mg材料，用干净的无菌纱布将水分吸干，放入研钵中加2ml预先冰冻的PBS溶液冰上研磨10min，重复3次。使组织 样品成匀浆状，用2ml吸管吸取匀浆至15ml离心管中，3000rpm离心10分钟，取上清放入4℃冰箱备用。配制1NHCL，100ml,1.2NNaOH/0.5MHEPES，100ml,滤器过滤除菌备用。取100μl组织匀浆上清液至1.5ml离心管中，加入20μl 1N HCL，充分混合，室温放置10min后，取20μl 1.2NNaOH/0.5M HEPES至上清液中，充分混匀，室温放置10min。取出试剂盒内已包被的酶标板根据样本空数计算酶标板数目，加样孔划分并标记，其余放回4℃冰箱。将试剂盒内的试剂取出按实验需要及说明书进行标准品及试剂的复溶、稀释备用。按预先设定的实验加样分别每孔加入50μl实验稀释液，相应标记孔分别加50μl标准品、阳性对照、样品，加样过程中防止气泡产生，加样完成后，轻拍酶标板1min，使每孔样品充分混匀，密封，室温孵育2小时。洗板4次，每孔加400μl洗板液，静置1分钟，最后一次确保酶标板无液体残留。每孔加100μl酶标抗体，加样过程中防止气泡产生，加样完成后，轻拍酶标板1min，使每孔样品充分混匀，密封，室温孵育2小时。洗板4次，每孔加400μl洗板液，静置1分钟，最后一次确保酶标板无液体残留。每孔加100μl显色剂混合溶液，室温下避光孵育30min后，每孔加100μl终止液，轻拍混匀。使用酶标仪检测OD值，30min内完成检测。 

结果如图10、图11和图12所示： 

Elisa检测提示本技术获得小肠脱细胞支架（图中PD-SIS）较传统方法获得的小肠支架（图中SIS），生长因子VEGF、b-FGF和TGF-β的含量更高。 

2-7.细胞生长实验： 

材料冻干切成2cm直径的圆片，γ射线消毒。小鼠成纤维细胞培养于DMEM(辅以10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素，95%空气/5%二氧化碳)将冻干消毒的材料放入6孔板，在种细胞前用无菌的hank式溶液湿化。将10⁶个小鼠成纤维细胞种入每孔。24小时后更换培养液。7天后，移除培养液，用10%中性缓冲福尔马林固定材料18h。固定后，用石蜡包埋材料，切片，计数。 

结果如图13所示： 

体外成纤维细胞和支架共培养实验，证明本技术获得小肠脱细胞支架较传统方法获得的小肠支架（简称SIS），细胞生长更佳。 

2-8.热原试验： 

在试验前7天选3只家兔，雌雄不限，雌兔未孕，且测温前7天内应在同一环境条件下用同一饲料饲养，在此期间家兔体重无减轻，精神、食欲、排泄等无异常。预测体温时用肛温计插入家兔肛门，深度约6cm，时间为2min，取出肛温计并记下读数。每隔1h测量1次，共测4次，体温均在38.0～39.6℃的范围内，且最高最低温度的差数不超过0.4℃，则符合热原试验要求。3天后将家兔固定于固定器内。30min后开始第1次测量，30min后再测1次。两次体温之差不超过0.2℃，以两次体温的平均值为该兔的正常体温。且当日使用家兔的体温在38.0～39.6℃的范围内，各兔间的正常体温之差不超过1℃。在家兔正常体温符合要求后15min内，自耳缘静脉缓慢注入预 热38℃的PD-SIS浸提液，剂量10ml/kg。注射后每隔1h测量体温1次，6次体温中最高的1次减去正常体温为试验家兔体温升高值。 

结果：3只家兔体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高总和低于1.4℃，说明本技术制备的小肠脱细胞支架对家兔无热原作用。 

2-9.皮肤刺激实验： 

浸提液的制备：将灌注法脱细胞小肠（简称PD-SIS）切成30mm×5mm条状，置于去热原的25ml锥形瓶中，按受试材料3cm²:1ml生理盐水注射液的比例，取一定量的生理盐水注射液于锥形瓶中，置于37℃电热恒温培养箱中浸提72h。72h后将浸提液转移至另一去热原的锥形瓶中，调节pH值为7.0左右，4℃保存备用。 

受试豚鼠3只，2只雄性，1只为雌性，实验前24h，脊柱两侧各选两个3cm×3cm面积的去毛区，用8％的硫化钠溶液去毛，其中一侧皮肤保持完整，另一侧用20ml注射器针头造成“井”字形皮肤破损，仅损伤豚鼠表皮，且避免出血。用75％乙醇消毒背部去毛区，用2.5cm×2.5cm滤纸块浸泡于PD-SIS浸提液中至饱和，贴敷于试验部位。材料贴敷于皮肤后，立即用3cm×3cm纱布块覆盖，最外层用胶布固定。贴敷固定24h后，移去贴敷物，用温水清洁贴敷区并吸干，观察移去贴敷物后24，48和72h皮肤的红斑及水肿情况。 

结果：PD-SIS浸提液贴敷豚鼠皮肤后24，48和72h，完整皮肤处与破损皮肤处均未见红斑，且无水肿形成，皮肤刺激积分为0，说明本技术制备的小肠脱细胞支架对豚鼠皮肤无刺激反应。 

2-10.急性全身毒性试验： 

将健康小白鼠随机分为试验材料组和对照两组，每组5只。试验组动物由尾静脉注射PD-SIS浸提液，剂量为50ml/kg。对照组动物由尾静脉注射生理盐水，剂量为50ml/kg。注射后于24，48和72h观察记录试验组和对照组动物的一般状态、毒性表现和死亡动物数。 

结果：尾静脉注射PD-SIS浸提液后24，48和72h，小鼠情况良好，无任何毒性反应，说明PD-SIS无急性全身毒性。 

<实施例3> 

3-1.腹壁部分缺损修复实验： 

采用3%的戊巴比妥钠腹腔注射SD大鼠进行腹壁部分缺损修复实验。方法：取SD大鼠麻醉后，固定于实验台上，腹部剃毛备皮，碘伏棉球消毒铺巾，切开皮肤后完全暴露腹壁肌肉，过腹中线剪下约2*2cm大小的部分腹壁肌包括腹外斜肌及部分腹直肌，剪取约大于腹壁缺损1cm大小的按照实施例1中所描述的方法制备的犬小肠脱细胞支架覆盖于缺损部位，无菌缝线连续缝合固定，对齐切开的皮缘，缝合。放入饲养笼中分笼饲养。SD大鼠的样本量为40例，术后大鼠均存活良好，无死亡，术后1、2、4、8周观察，脱细胞支架在大鼠腹壁上生长良好，未见感染及明显的组织排异反应。 

分别于1、2、4、8周时对实验大鼠进行处死解剖取材，进行以下实验，观察小肠脱细胞支架对大鼠腹壁缺损的修复情况，组织相容性、炎症反应及新生血管情况等。 

3-2.大鼠部分腹壁缺损后修复区的HE染色实验 

用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色2分钟。酸水及氨水中分色，各15秒钟。流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。入70％和90％酒精中脱水各10分钟。入酒精伊红染色液染色2～3分钟。染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。 

实验结果如图5所示，本发明制备的小肠脱细胞支架修复大鼠部分腹壁缺损后修复区胶原排列有序，细胞长入良好，说明采用实施例一中所描述的方法所制备的小肠脱细胞支架的组织相容性好。 

3-3.采用小肠脱细胞支架修复大鼠腹壁部分缺损术后8周后的Masson染色实验 

步骤如下：石蜡切片脱蜡至水。依次自来水和蒸馏水洗。用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5-10min。蒸馏水洗。用Masson丽春红酸性复红液5-10min。以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。1%磷钼酸水溶液分化3-5min。不经水洗，直接用苯胺蓝或光绿液染5min。以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。 

实验结果如图6所示，本发明制备的小肠脱细胞支架修复大鼠部分腹壁缺损后由胶原层积和基质再生重塑，在支架材料与腹壁交界区，可见肌肉组织长入支架材料。 

3-4.免疫组化和免疫荧光实验 

免疫组化：术后4周和8周分批处死动物（每个时间点每组5只），将修补区域连同周围1cm正常肌肉组织整块切除。石蜡包埋切片（5μm厚），石蜡切片脱蜡至水，0.3%TritonX-100室温30min，0.3％甲醇双氧水室温30min，正常羊血清封闭37℃30min，滴加CD3、CD68小鼠抗大鼠IgGI抗，4℃孵育24h，II抗37℃孵育30min，SABC复合物37℃孵育30min，每步间用0.01mol/LPBS洗5min共3次，DAB室温显色5min，蒸馏水终止反应，常规脱水、透明、封固、镜检。结果如图7所示。CD31用于证明血管内皮组织的存在，图7中具有大量的CD31显色，因此证明修补区域中长入了大量新生血管。 

免疫荧光：切片固定后，滴加CD31小鼠抗大鼠IgGI抗在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2 PBS洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。再滴加间接荧光抗体，荧光抗体为兔抗人γ-球蛋白荧光抗体，染色30min，37℃，缓冲盐水洗两次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。结果如图8和图9所示，本发明制备的小肠脱细胞支架修复大鼠部分腹壁缺损后修复区有较多新生微血管形成，局部炎症细胞浸润较轻。CD3和CD68染色阳性细胞为炎症细胞，其中CD3表达于胞膜，CD68表达于 胞浆，阳性表达的细胞表现为细胞浆呈棕黄色。炎症细胞为图中箭头所指的细胞。 

实施例的作用与效果 

根据本实施例的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，由于采取了联合供应血管一同获取小肠，经脱细胞处理后即可获得具有完整脉管网络的小肠脱细胞支架，具有完整的脉管网络可以使得在小肠脱细胞支架用于大面积修补的时候利于血管的形成，从而保证大面积修补的成功率和修补效果。另一方面，由于采用了合适灌注流量控制因此能够保持小肠脱细胞支架的完整性。另外，由于利用灌注法联合使用胰酶、SDS、Triton脱细胞达到了在较短时间内对小肠进行整体脱细胞的效果，同时保留了小肠的完整三维结构。在实施例中也进行了血管新生以及免疫实验，证明了本实施例中所记载的方法得到的小肠脱细胞支架具有良好的生物相容性，使用它进行大面积组织修补的效果很好。 

本发明中对于灌注速度的选择不仅仅是上述实施例中的固定值，它具有一定的范围：动脉和静脉的灌注速度为3-15ml/min，肠管的灌注速度为50-500ml/min，其中流量选择为根据供体相应灌注管道对力学的承受能力而定，如大鼠其小肠动静脉对力学的承受能力较弱，因此灌注流量不超过3ml/min，其小肠管的灌流流量不超过50ml/min，否则会导致管道结构破坏。 

上述实施例仅是本发明的示例，因而本发明权利要求所保护的范围并不仅仅以此处公开的特定实施方案来限定。任何等同的实施方 案将被认为在本发明的范围之内。任何修改和变动对于本领域的技术人员来讲都将是可能的，但如前所述所有这种修改和变化也都将落在本发明所附权利要求的范围之内。 

Claims (9)

1.一种具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：取健康成年的哺乳动物麻醉后，肌肉注射抗凝药物，打开腹腔选取一段血供丰富的小肠段，分离所述小肠的肠系膜根部的动、静脉血管，进行动、静脉血管插管固定并在近心端结扎离断血管；

步骤二：夹闭所述小肠段的两端部，离断所述小肠段的两端部并分别插管固定，分离肠系膜，完整取下所需肠管及肠系膜血管，置于低温环境中，用生理盐水反复冲洗；

步骤三：依次使用磷酸盐缓冲液、含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲液、十二烷基硫酸钠溶液、磷酸盐缓冲液、聚乙二醇辛基苯基醚溶液、磷酸盐缓冲液分别灌注动脉、静脉、肠管；

步骤四：所述灌注完成后使用过氧乙酸和乙醇混合液浸泡消毒，得到小肠脱细胞支架。

2.如权利要求1所述的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，其特征在于：

其中，所述步骤三中所有的所述PBS溶液的灌注时间为动脉、静脉、肠管各30min，所述动脉和所述静脉的灌注速度为3-15ml/min，所述肠管的灌注速度为50-500ml/min。

3.如权利要求1所述的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，其特征在于：

其中，所述含乙二胺四乙酸的胰蛋白溶液的质量体积比为0.25%，灌注时所需温度为37℃，灌注时间为所述动脉、所述静脉、所述肠管各30min，所述动脉和所述静脉的灌注速度为3-15ml/min，所述肠管的灌注速度为50-500ml/min。

4.如权利要求1所述的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，其特征在于：

其中，所述十二烷基硫酸钠溶液的质量体积比为0.1%，所述肠管的灌注时间为8小时，所述动脉和所述静脉的灌注时间均为4小时，所述动脉和所述静脉的灌注速度为3-15ml/min，所述肠管的灌注速度为50-500ml/min。

5.如权利要求1所述的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，其特征在于：

其中，所述聚乙二醇辛基苯基醚溶液的质量体积比为1%，pH值为11.4，所述肠管灌注时间为4小时，灌注速度为50-500ml/min，所述动脉和所述静脉的灌注时间分别为1小时，灌注速度均为3-15ml/min。

6.如权利要求1所述的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，其特征在于：

其中，所述过氧乙酸和乙醇的混合液中过氧乙酸的终浓度为0.1-0.5%（V/V）乙醇的终浓度为2-10%（V/V），浸泡时间为3小时。

7.如权利要求1所述的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，其特征在于：

其中，所述哺乳动物为实验用哺乳动物大鼠、犬、猪、兔之中的任意一种。

8.如权利要求1所述的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，其特征在于：

其中，所述麻醉采用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。

9.如权利要求1所述的具有完整三维结构和脉管网络的小肠脱细胞支架制备方法，其特征在于：

其中，所述抗凝药物为注射用低分子肝素，剂量为1000U/kg。