ES2318744T3 - Cultivo de equivalente de piel. - Google Patents

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Abstract

Un método in vitro para formar un equivalente de tejido conectivo, que comprende las etapas de: (i) incubar células productoras de colágeno en o sobre una matriz de soporte; (ii) inducir y/o mejorar la producción de colágeno por las células productoras de colágeno para formar una construcción de tipo colágeno y degradación y reemplazo de la matriz de soporte; (iii) secar por congelación la construcción; y (iv) re-poblar la construcción secada por congelación con células productoras de colágeno y/o células epiteliales y/o células endoteliales y/o células mesenquimales, formando de este modo un equivalente de tejido conectivo, en el que: (a) las células productoras de colágeno son del 90% al 100% fibroblastos; por ejemplo, fibroblastos dérmicos neonatales humanos; (b) la matriz de soporte es una matriz de soporte provisional en la que la matriz de soporte es una matriz de fibrina, por ejemplo, formada por polimerización mediada por trombina de fibrinógeno; y (c) como resultado de la producción de colágeno por las células productoras de colágeno, la matriz de soporte de fibrina provisional se digiere por las células y se sustituye gradualmente por colágeno, de tal forma que la matriz de fibrina provisional se sustituye finalmente por una matriz de colágeno sintetizada in situ por las células.

Description

Cultivo de equivalente de piel.
La presente invención se refiere a métodos para formar composiciones de tejido conectivo blando tales como equivalentes de piel, composiciones preparadas mediante los métodos y sus usos.
A lo largo de las últimas dos décadas han surgido sustitutos de piel creados por bioingeniería genética, con la intención inicial de sustituir autoinjerto, aloinjerto y xenoinjerto en aplicaciones de quemaduras. Los ejemplos de productos de sustituto de piel creados pon ingeniería genética disponibles o previstos en el mercado se muestran en la Tabla 1. Varios de estos productos están formados por colágeno que se ha ensamblado in vitro y sembrado con fibroblastos dérmicos humanos (HDF) autólogos o alogénicos.
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1
Tales sustitutos de piel han encontrado amplia aplicación en el tratamiento activo de úlceras venosas crónicas y diabéticas crónicas en particular, pero en la práctica se ha demostrado que no persisten sobre la herida, de tal forma que no son verdaderos "equivalentes de piel". Aunque las transferencias de tejido autólogo pueden ser muy eficaces para garantizar la cicatrización, tales procedimientos son invasivos, dolorosos y caros y no se pueden realizar por muchos médicos de cicatrización. En términos prácticos, los equivalentes de piel representan de forma ideal alternativas artificiales, comerciales a injertos cutáneos que evitan el dolor y las potenciales complicaciones de la recogida, están siempre disponibles en cualquier cantidad necesaria y se pueden aplicar en un entorno de consultorios.
Un equivalente de piel ideal se adheriría rápidamente a una lesión cutánea tal como una herida y, una vez aplicado, persistiría, imitando la fisiología y algunos de los mecanismos de la piel normal. Además, no estaría sujeto a rechazo inmune por el hospedador y sería altamente eficaz en la aceleración de la regeneración tisular y cicatrización más que en la aceleración de cicatrización por intención secundaria. Desafortunadamente, este equivalente de piel ideal todavía no se ha conseguido.
Diversos estudios han intentando proporcionar un modelo in vitro de fibroplasia, es decir, el proceso de reparación tisular que implica la reorganización de la matriz extracelular (ECM), desarrollo celular y síntesis o depósito de colágeno durante la reparación tisular, para comprender los mecanismos complejos que subyacen al proceso. Tuan et al. (1996, Exp. Cell Res.223: 127-134) han proporcionado un sistema de cultivo en gel de fibrina en el que se estabilizan geles de fibrina que contienen fibroblastos dérmicos humanos en placas de cultivo de plástico como hemiesferas. Los fibroblastos pudieron reorganizar y remodelar la matriz de fibrina y comenzaron con el proceso de síntesis de colágeno para formar un tejido de tipo cicatricial que contiene colágeno. Neidert et al. (2002, Biomaterials 23: 3717-3731), usando un sistema similar a Tuan et al. (1996), han demostrado que fibroblastos sembrados en una matriz de colágeno (como en varios de los productos de equivalente de piel mostrados en la Tabla 1) producen menos colágeno y matriz extracelular (ECM) que fibroblastos en fibrina. En un estudio relacionado, Grassl et al. (2002, J. Biomed. Mater. Res. 60: 607-612) examinaron el uso de fibrina como una alternativa a colágeno para la inmovilización de células de músculo liso aórtico de rata neonatal en la fabricación de equivalentes de medio. Aunque tales estudios han mejorado la comprensión de la fibroplasia, todavía existe una necesidad de productos de tejido conectivo mejorados.
También se conoce de la técnica anterior que muchos factores, incluyendo ácido ascórbico, TGF-\beta, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), L-prolina, insulina y factor de crecimiento similar a insulina, plasmina, fibrina, fenitoína, ácido valproico, ciclosporina A, nifedipina, diltiazem, verapamilo HCl y amlodipina y estrés mecánico influyen en la formación de colágeno por células tales como fibroblastos. Por ejemplo, el documento WO02/49603 describe una composición tópica para la prevención y el alivio de formación de pliegues que comprende uno o dos o más seleccionados del grupo que consiste en fenitoína, ácido valproico, ciclosporina A, nifedipina, diltiazem, verapamilo HCl y amlodipina como un ingrediente activo que tiene un efecto de refuerzo de la síntesis de colágeno cuando se aplica a una superficie de piel que comprende fibroblastos. Sin embargo, las combinaciones óptimas para tales factores, junto con otras variables tales como estimulación concomitante por estrés físico y selección de un protocolo de suministro de medio, todavía no se han determinado para aplicaciones creadas por ingeniería genética de tejidos.
Los presentes inventores han desarrollado un método alternativo para formar una construcción de tejido conectivo que ofrece mejoras con respecto a métodos y construcciones de la técnica anterior.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención se proporciona un método in vitro para formar un equivalente de tejido conectivo, que comprende las etapas de:
(i)
incubar células productoras de colágeno en o sobre una matriz de soporte;
(ii)
inducir y/o mejorar la producción de colágeno por las células productoras de colágeno para formar una construcción de tipo colágeno;
(iii)
secar por congelación la construcción; y
(iv)
re-poblar la construcción secada por congelación con células productoras de colágeno y/o células epiteliales y/o células endoteliales y/o células mesenquimales, formando de este modo un equivalente de tejido conectivo, en el que:
(a)
las células productoras de colágeno son del 90% al 100% fibroblastos; por ejemplo, fibroblastos dérmicos neonatales humanos;
(b)
la matriz de soporte es una matriz de soporte provisional en la que la matriz de soporte es una matriz de fibrina, por ejemplo, formada por polimerización mediada por trombina de fibrinógeno; y
(c)
como resultado de la producción de colágeno por las células productoras de colágeno, la matriz de soporte de fibrina provisional se digiere por las células y se sustituye gradualmente por colágeno, de tal forma que la matriz de fibrina provisional se sustituye finalmente por una matriz de colágeno sintetizada in situ por las células.
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Las etapas del método se pueden combinar y manipular como se describe en este documento para formar un equivalente de tejido conectivo con propiedades apropiadas tales como resistencia, rigidez, elasticidad y/o flexibilidad, propiedades que se pueden variar de acuerdo con las características deseadas del equivalente de tejido.
La construcción de tipo colágeno se puede definir como una construcción que tiene un componente no celular que contiene al menos del 10% al 99% de colágeno.
La construcción secada por congelación se puede re-poblar o sembrar con queratinocitos epidérmicos, por ejemplo, y se puede dejar que tenga lugar la cornificación, para proporcionar resistencia y rigidez adicionales al equivalente de tejido conectivo.
La producción de colágeno se puede inducir y/o mejorar mediante medios químicos y/o medios mecánicos. Los medios químicos pueden comprender un medio inductor de colágeno (expresión que incluye un medio que puede mejorar adicionalmente o alternativamente la producción de colágeno).
El medio inductor de colágeno puede comprender uno o más del grupo que consiste en fenitoína, ácido ascórbico, ácido valproico, ciclosporina A, nifedipina, diltiazem, verapamilo HCl y amlodipina.
Adicionalmente o alternativamente, el medio inductor de colágeno puede comprender uno o más del grupo que consiste en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), medio Hams F-12, suero de ternero recién nacido y/o suero fetal de ternero, L-glutamina, factor de crecimiento epidérmico, hidrocortisona, etanolamina, o-fosforil-etanolamina, transferrina, triiodotironina, selenio, L-prolina y glicina. Se ha demostrado que un "medio Total" que comprende estos componentes es particularmente eficaz para inducir formación de colágeno en la construcción de tejido conectivo.
El medio inductor de colágeno puede comprender además uno o más del grupo que consiste en insulina, factor de crecimiento epidérmico (EGF), TGF-\beta, polietilenglicol (PEG), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y plasmina.
Los componentes del medio inductor de colágeno también se pueden variar para aumentar la cantidad de elastina producida por las células productoras de colágeno.
El medio inductor de colágeno se puede cambiar diariamente, hasta 5 veces por semana, por ejemplo, 3 veces por semana, semanalmente, quincenalmente, opcionalmente con diferente frecuencia de cambios durante la formación de la construcción de tipo colágeno. Los inventores han observado que si se cambia el medio inductor de colágeno tres veces por semana, en comparación con cambios diarios, se producen niveles mayores de colágeno y niveles menores de elastina. Por tanto, el cambio de medio requerido o el protocolo de suministro se puede variar de acuerdo con la resistencia y rigidez deseadas del equivalente de tejido conectivo. Puede ser deseable una combinación de diferentes protocolos de suministro, tal como el cambio inicial de medio inductor de colágeno a lo largo de un periodo más prolongado seguido de cambios más frecuentes o viceversa. Por ejemplo, el medio inductor de colágeno se puede cambiar solamente una vez en una primera semana seguido de tres cambios por semana durante el resto del periodo de formación de la construcción de tipo colágeno.
Adicionalmente o alternativamente, las células productoras de colágeno se pueden incubar en un medio de proliferación antes o durante la incubación en o sobre la matriz de soporte. El medio de proliferación permite que las células productoras de colágeno alcancen un número adecuado o etapa de proliferación o de desarrollo. El medio de proliferación puede comprender uno o más del grupo que consiste en medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), suero de ternero recién nacido, suero fetal de ternero y L-glutamina.
Las células productoras de colágeno se pueden incubar en el medio de proliferación durante un periodo de 0 a 21 días, preferiblemente hasta 7 ó 14 días.
El método puede comprender una etapa adicional de cultivo de las células productoras de colágeno en un medio sin suero antes o durante la incubación en o sobre la matriz de soporte. Por ejemplo, las células productoras de colágeno se pueden cultivar en el medio sin suero durante un periodo de 0 a 7 días, por ejemplo, hasta 2 ó 3 días.
Adicionalmente o alternativamente, los ciclos de incubación en medio sin suero y en medio formador de colágeno se pueden repetir de forma continua durante toda la formación de la construcción de formación de colágeno.
Los tiempos preferidos de incubación total y de inducción de producción de colágeno son: un mínimo de 21 días y un máximo de 63 días: sería más preferible 21-49 días o 21-35 días o 21-29 días.
En una realización preferida, las células productoras de colágeno son del 90% al 100%, preferiblemente del 95% al 99,5% y mucho más preferiblemente del 97,5% al 99% fibroblastos. Los fibroblastos pueden ser fibroblastos dérmicos, preferiblemente fibroblastos dérmicos humanos. Una realización preferida comprende fibroblastos obtenidos de prepucio humano alogénicos.
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La matriz de soporte puede ser una matriz de soporte provisional, por ejemplo, una matriz que se desintegra o disuelve cuando se forma la construcción de tipo colágeno o cuando se seca por congelación la construcción.
La matriz de soporte puede ser una matriz de fibrina, por ejemplo, formada por polimerización mediada por trombina de fibrinógeno.
Un equivalente de tejido conectivo preferido se basa en el moldeo de fibroblastos dérmicos humanos (HDF) en geles de fibrina. El trabajo previo de grupos tales como Tuan et al. (1996) y Neidert et al. (2002) ha demostrado que en composiciones similares, los HDF se inducen para depositar colágeno y otros materiales de matriz extracelular y, cuando la construcción madura, la fibrina original se sustituye por colágeno que se convierte o se puede inducir para convertirse en reticulado. El colágeno producido por HDF alogénicos incluidos inicialmente en el gel de fibrina se auto-sintetizaría y, por tanto, se parecería más probablemente a, por ejemplo, colágeno depositado en un proceso de cicatrización auténtico.
La matriz de soporte se puede moldear sobre una superficie de base. Esta superficie de base puede ser una forma, por ejemplo, y se podría usar para aplicación y/o manipulación posterior de la construcción de tejido conectivo (por ejemplo, durante terapia).
La superficie de base puede ser una construcción secada por congelación como se define en este documento. Las ventajas de una superficie de base de este tipo se describen más adelante. En un aspecto, el equivalente de tejido conectivo se forma usando dos o más construcciones secadas por congelación apiladas. Al menos dos de las dos o más construcciones secadas por congelación se pueden separar por una sustancia intercalada. La sustancia intercalada puede comprender fibrina. La sustancia intercalada puede proporcionar, por ejemplo, rigidez al equivalente de tejido.
El equivalente de tejido conectivo puede ser una válvula cardiaca o una válvula sanguínea de sustitución. En un aspecto preferido de la invención, el equivalente de tejido conectivo es un equivalente de piel.
El equivalente de piel en una realización preferida que comprende HDF en un gel de fibrina difiere de productos de la técnica anterior tales como ApliGraf (véase la Tabla 1) debido a que, por ejemplo, el colágeno producido por HDF alogénicos incluidos inicialmente en el gel de fibrina se auto-sintetizaría y, por tanto, se parecería más probablemente a colágeno depositado en el proceso de cicatrización auténtico.
El equivalente de tejido conectivo tiene preferiblemente al menos un, al menos dos, tres o todos los bordes laterales sustancialmente lineales. Por tanto, el equivalente puede ser sustancialmente cuadrado o rectangular en una vista en planta. Tal geometría permite que dos o más equivalentes de tejido conectivo se puedan conectar a lo largo de sus bordes laterales.
Los medios mecánicos para inducir y/o mejorar la producción de colágeno pueden comprender uno cualquiera o más del grupo que consiste en estimulación eléctrica, tensión, movimiento, ultrasonidos y luz infrarroja.
Una lesión de piel adecuada para el tratamiento por el equivalente de piel incluye una úlcera venosa, úlcera diabética, escara por presión, quemadura o herida por raspado iatrogénica.
Diversos grupos han usado medios y componentes para estimular la síntesis de colágeno. Por ejemplo, Organogenesis (solicitud de Estados Unidos Nº 20020172705) usó el siguiente medio:
una mezcla base 3:1 de DMEM: medio Hams F-12 (Quality Biologics, US),
GlutaMAX (Gibco) 4 mM,
5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (Upstate Biotechnology, US),
0,4 mg/ml de hidrocortisona (Sigma),
etanolamina 1x10^{-4} M (Fluka),
o-fosforil-etanolamina 1x10^{-4} M (Sigma),
5 mg/ml de insulina (Sigma),
5 mg/ml de transferrina (Sigma),
triiodotironina 20 pM (Sigma),
6,78 ng/ml de selenio (Sigma),
50 ng/ml de ácido L-ascórbico (WAKO Chemicals, US),
0,2 \mug/ml de L-prolina (Sigma),
0,1 mg/ml de glicina (Sigma) y
polietilenglicol (PEG) al 0,05% (Sigma).
Neidert et al. (2002) usaron medio M199 (Gibco) suplementado con los siguientes ingredientes:
50 U/ml de penicilina,
50 \mug/ml de estreptomicina,
fungizona al 1% (Gibco),
L-glutamina 2 mM,
FBS al 10% y
50 mg/ml de ascorbato (Sigma),
que incluye opcionalmente FBS al 10% adicional, 5 ng/ml de TGF-\beta1 activo (R&D Systems), 2 \mug/ml de insulina (Sigma) y/o 0,01 U de plasmina (Calbiochem) por ml (fibrina).
El medio inductor de colágeno usado en la presente invención puede comprender los ingredientes combinados de Organogenesis (solicitud de Estados Unidos Nº 20020172705) y Neidert et al. (2002), preferiblemente sin duplicación de ingredientes comunes, opcionalmente en combinación con fenitoína y/o PDGF y/o VEGF.
Discusión de técnica anterior y la presente invención
D1- Hansbrough JF, Morgan JL, Greenleaf GE and Bartel R. (1993). Composite grafts of Human keratinocytes grown on a poliglactina mesh-cultured fibroblast dermal substitute function as a bilayer skin replacement in full-thickness wounds on athymic mice. J. Burn Care and Rehab. 14 (5), 485-494.
D2- Geesin et al, Regulation of Collagen Synthesis in human dermal fibroblasts in contracted collagen gels by ascorbic acid, growth factors, and inhibitors of lipid peroxidation. Experimental Cell Research 206, 283-290.
D3- Documento WO 03/41568 (University of New Jersey, Hewitt et. Al) A Three dimensional matrix for producing living tissue equivalents.
Revisión de Cultivo de Equivalente de Piel ICX-SKN, de acuerdo con la Invención
Se ha diseñado ICX-SKN como una terapia celular activa que consiste en fibroblastos dérmicos humanos (HDF) incluidos en geles de fibrina que se dejan madurar a lo largo de varias semanas. Un aspecto clave de este periodo de maduración es que en tales condiciones, el gel de fibrina original se sustituye gradualmente o se aumenta sustancialmente por colágeno y otros componentes de la matriz extracelular (ECM) conduciendo a un producto que finalmente está compuesto por matriz extracelular auto-fabricada por HDF.
Después de la maduración, ICX-SKN se puede tratar de varios modos:
\bullet
Envasar en medio de transporte (solamente dermis)
\bullet
Poblar con Queratinocitos antes del envasado
\bullet
Secar por congelación y envasar (y almacenar potencialmente hasta 18 meses)
\bullet
Secar por congelación y re-poblar con células para envío (o madurar después de repoblación)
La aplicación de queratinocitos epidérmicos a la construcción de colágeno y dejar que tenga lugar la cornificación in situ podría proporcionar resistencia, rigidez y función adicionales particularmente en defectos de gran superficie.
ICX-SKN se puede distinguir de otros productos disponibles basándose en que el colágeno producido por HDF alogénicos se auto-sintetiza por los HDF y, por tanto, se parecerá más probablemente a colágeno depositado en el proceso autentico de cicatrización/cierre de heridas. La aplicación pretendida de ICX-SKN se puede distinguir de otros productos disponibles actualmente porque, siendo equivalente a un injerto de piel, ICX-SKN no cicatrizaría por intención secundaria después de la descomposición del producto in situ. Tampoco se pretende que ICX-SKN sea una cubrición temporal de la herida. De hecho, ICX-SKN tiene por objeto ser una terapia de cierre de heridas que actuaría como un injerto de piel y que se ha previsto que tendría un efecto permanente similar.
Matriz de Fibrina
La presente invención se refiere a métodos para formar un equivalente de piel que se cura por intención primaria. A diferencia de otros equivalentes de piel, el producto final descrito en este documento se auto-sintetiza de forma eficaz por las células que se moldean en un armazón provisional (fibrina) durante una etapa temprana durante el proceso de fabricación.
La matriz de fibrina provisional en la que se moldean las células sirve a tres objetivos:
1.
La fibrina sirve como un armazón provisional que permite la distribución tridimensional de HDF dentro de las construcciones, lo que es fisiológicamente pertinente para el entorno auténtico de cicatrización dérmica que proporciona estructura y alineamiento a células y fibras.
2.
La fibrina proporciona señales que estimulan a las células para depositar colágeno que forma una matriz más permanente y persistente.
3.
El método de moldeo del molde de fibrina como se describe en este documento proporciona restricción y tensión mecánica que también es un estimulante para el depósito de colágeno por células y ayuda al alineamiento correcto de células y fibras.
El armazón de fibrina provisional se puede remodelar de forma suficiente por fibras de colágeno formadas recientemente durante el periodo de maduración en medio de refuerzo de colágeno.
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Sumario de D1
Hansbrough et al, han desarrollado un producto de "sustitución de piel" combinando queratinocitos epidérmicos humanos con el producto disponible en el mercado Dermagraft. Dermagraft es un armazón bioabsorbible de poliglactina-910 (Vicryl) sembrado con fibroblastos dérmicos humanos que se maduran posteriormente durante 2-3 semanas antes de que se crioconserven. Durante el proceso de maduración, los fibroblastos se diferencian y producen proteínas de matriz extracelular, que se secretan al interior del armazón.
Hansbrough sembraron prepucio neonatal humano sobre una malla quirúrgica compuesta por poliglactina-910. Se dejaron proliferar las células y confluir a lo largo de un periodo de maduración de 2-3 semanas, después de lo cual se crioconservaron a -70ºC en DMEM-FBS al 20%-DMSO al 10%. Para preparar su equivalente de piel, Hansbrough et al descongelaron una pieza de Dermagraft y sembraron 1,4x10^{8} células por 100 cm^{2} y dejaron que las células epidérmicas se convirtieran en confluentes a lo largo de un periodo de cultivo de 4-6 días. Después de este periodo de cultivo, los equivalentes de piel se trasplantaron a ratones atímicos a los que se había retirado un trozo de 2x2 cm de espesor completo de piel de la superficie dorsolateral. Los animales se examinaron después de 10 y 20 días post-trasplante mediante microscopía óptica e inmunohistoquímica.
Los autores también sugieren que Dermagraft sembrado con queratinocitos ofrece ventajas en términos de capacidad de manipulación y capacidad de apilado/suturado local. Además, los autores sugieren que Dermagraft provoca cicatrización reforzando la entrada de células epiteliales en los intersticios de la malla en vez de por cierre de la herida por sí.
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Red sintética pre-formada
Dermagraft se forma sembrando fibroblastos dérmicos humanos (HDF) y, en esta publicación, queratinocitos humanos (HK) sobre una malla quirúrgica de poliglactina-910. A lo largo del tiempo, la malla se reabsorbe en el cuerpo. El objeto de esta invención requiere que, antes de la colocación en la herida, se sintetice una matriz sustancial por los propios fibroblastos. En vez de sembrar HDF en un sustrato fabricado preformado, los HDF se siembran en una matriz provisional que comprende fibrina y se maduran durante 21-63, preferiblemente 49 días. En el proceso de cicatrización, la fibrina está presente en la herida e induce la migración de fibroblastos al interior de la herida. Una vez en ese lugar, los fibroblastos digieren la fibrina y, a la vez, la sustituyen por colágeno y otros componentes de ECM. En la presente invención, este proceso se reproduce en el laboratorio y da como resultado una matriz que se produce de un modo que se puede reconocer como una imagen especular del proceso natural y que tiene lugar antes de la colocación sobre la herida. Durante este periodo de incubación, la matriz de fibrina original se remodela y se infiltra por depósito de colágeno extendido por fibroblastos. En el momento del injerto, la matriz original se ha infiltrado por colágeno autosintetizado y el producto está sustancialmente hecho de células.
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Dermagraft se crioconserva
El proceso de fabricación de los productos de la técnica anterior presenta un escenario por el que el producto final (con o sin queratinocitos) se conserva en una solución de crioconservación en la que se envasa y se presenta al usuario final.
El objeto de la presente invención se seca por congelación en el momento de la fabricación en el que el producto en la técnica anterior se crioconservaría. Sin embargo, en vez de presentar el producto secado por congelación de esta invención como el producto fabricado final, se proporciona por el proceso de secado por congelación y esterilización posterior como un material sin procesar en nuestro proceso de fabricación final. Durante las etapas de secado por congelación/esterilización, los HDF presentes originalmente en el producto de esta invención se inactivan. Una vez pasado por este proceso, el producto de esta invención se puede mantener en inventario. En la fase final de la fabricación, que se puede terminar a discreción siempre que se requieran reservas, el producto secado por congelación/esterilizado se re-siembra con fibroblastos (con o sin queratinocitos), se madura (por ejemplo, durante un mínimo de cinco días), después se envía en medio de envío al usuario final. Como consecuencia, este producto está preparado para el uso por el usuario final y no requiere procesamiento adicional para liberar el producto de solución de crioconservación.
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Curación por intención secundaria
En la Introducción, los autores de D1 indican que "estudios iniciales demostraron que Dermagraft podría vascularizar por debajo de injertos de piel en malla para cerrar heridas de espesor completo en animales y en seres humanos y para reforzar el cierre epitelial de los intersticios del injerto de malla". La visión de los propios autores es que Dermagraft provoca curación reforzando la entrada de células epiteliales a los intersticios de la malla en vez de por cierre de la herida por sí. El objeto de la invención que se describe es provocar cierre de herida, con o sin queratinocitos aplicados, en vez de estimular la cicatrización. La novedad de esta invención es la curación por primera intención.
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Sumario de D2
Geesin et al. han examinado si la presencia de una matriz de colágeno influye en las respuestas de fibroblastos dérmicos a ácido ascórbico. En resumen, los autores mezclaron fibroblastos y colágeno, dejaron que los mismos se contrajeran durante 6 días para formar una matriz y después examinaron la concentración y dependencia del tiempo del ácido ascórbico para afectar a la síntesis de colágeno. El resultado de estos experimentos fue que el ácido ascórbico estimula la síntesis de colágeno en fibroblastos (de un modo similar al observado en fibroblastos en monocapa).
Este artículo meramente subraya la importancia del ácido ascórbico y su efecto sobre la síntesis de colágeno. ICX-SKN incorpora el uso de ácido ascórbico en su medio. Sin embargo, a diferencia del trabajo de Geesin et al, ICX-SKN consiste en fibroblastos en una matriz de fibrina durante las etapas tempranas, NO fibroblastos dentro de una matriz contraída de colágeno.
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Sumario de D3
El documento WO 03/41568 se refiere a una matriz 3-d, un equivalente de tejido vivo y métodos para preparar los mismos. La matriz 3-d comprende plasma sanguíneo, trombina y fibroblastos. Se suspendieron fibroblastos humanos en una solución de plasma y se pusieron en placas de cultivo de 12 pocillos. Se añadió solución de trombina a cada pocillo, dando como resultado la formación de una matriz 3d. Los cultivos se desarrollaron en medio de cultivo de fibroblastos convencional durante 10 días con cambios de medio cada día. Después del periodo de cultivo de 10 días los HK se pusieron sobre la parte superior de las matrices y se realizaron varios cambios de medio suplementado. Se realizó análisis inmunohistoquímico para determinar los niveles de Colágeno.
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Sustitución de fibrinógeno con colágeno
De acuerdo con la presente invención, la matriz de soporte provisional se degrada y reemplaza cuando se forma la construcción de tipo colágeno. El equivalente de tejido conectivo se basa en el moldeo de fibroblastos dérmicos humanos (HDF) en geles de fibrina. Los HDF se inducen para depositar colágeno y otros materiales de matriz extracelular y, cuando la construcción madura, la fibrina original se sustituye por colágeno que se convierte o se puede inducir a convertirse en reticulado. El producto final de la invención puede estar de forma eficaz libre de fibrina, en el que la matriz original se ha descompuesto y reemplazado con colágeno.
La descripción de Hewitt et al describe la formación de la matriz de colágeno "incluyendo fibroblastos en una mezcla de coágulo hemostático...donde el fibrinógeno polimeriza y reticula para producir una matriz de fibrina insoluble". Evidentemente, la intención en la invención descrita por Hewitt et al es que el coágulo (de fibrina) hemostático pueda persistir en presencia de colágeno.
La estrategia utilizada por Hewitt difiere claramente del mecanismo en ICX-SKN. En particular, de la presente solicitud en la que se usa TGF-\beta como un medio para inhibir multiplicación rápida de fibroblastos que, de este modo, evita la destrucción del coágulo hemostático. Además, en esta invención se realiza que se puede incluir plasmina en el medio de cultivo de las construcciones ya que la plasmina es un medio específico para facilitar la descomposición o disolución de coágulos de fibrina.
Formación de la construcción de fibrina
Un aspecto clave en el proceso de moldeo de ICX-SKN es que la mezcla líquida (fibrinógeno, células + medio, trombina) no se pone en contacto con las paredes de soporte del recipiente en el que se moldea ya que esto rompe la tensión superficial y permite que la mezcla líquida "trepe" hacia arriba por las paredes del recipiente. Esto da como resultado una conformación cóncava en vez de la convexa deseada y pérdida de altura de la construcción. La agitación descrita en Hewitt et al. (pág. 19, [57]) daría como resultado la pérdida de la tensión superficial que es importante para formar la construcción de fibrina de esta invención y, por tanto, liberaría la "compactación restringida" importante para formar construcciones creadas por ingeniería genética de tejido de suficiente consistencia y resistencia.
Maduración y estructura de construcciones de tipo colágeno
En la descripción de ICX-SKN se han ilustrado ejemplos para incubar construcciones que tienen por objeto formar "equivalentes de piel viva" durante 49 días para producir una matriz de colágeno con suficiente integridad estructural mediante la formación de reticulaciones entre y dentro de moléculas de colágeno para que actúen sustancialmente como un reemplazo dérmico en un "equivalente de piel viva". Además, se añaden ácido ascórbico y otros ingredientes al medio de cultivo para que tengan lugar las modificaciones post-traduccionales necesarias en el colágeno en el intervalo del periodo de maduración largo que se describe. Además, se describe la aplicación de estrés físico (mecánico, ultrasonidos, etc) a estas construcciones para producir aún más colágeno y estructura auxiliar para mejorar adicionalmente sus propiedades. El secado por congelación de las construcciones, como se ha descrito, añade más estabilidad y resistencia a las construcciones de esta invención.
Los ejemplos descritos en Hewitt et al (página 20, [59]) sugieren que la matriz se incuba solamente durante diez días, seguido de la etapa adicional de poner con esperanza queratinocitos humanos en la parte superior de una capa epidérmica. Hewitt et al indican además que la adición de Vitamina C (página 13 [42]) es opcional ya que está implicada en modificaciones post-traduccionales de colágeno requeridas para la formación de la "estructura final de la molécula de colágeno". Aunque se acepta que el colágeno se producirá en el periodo de incubación (10 días) como se describe por Hewitt et al, sin adición de medios sustanciales para sintetizar u obtener ácido ascórbico (vitamina C), es dudoso que el colágeno obtendrá su estructura final que es crucial para su función en piel, tendón, etc. Además, dentro de la incubación de 10 días descrita en Hewitt et al., es improbable que se forme estructura suficiente en y entre fibras de colágeno para que la construcción resultante sea útil como un "equivalente de piel viva".
Producto final de tratamiento
Los coágulos hemostáticos descritos en Hewitt et al. se pueblan con fibroblastos y, de forma secundaria, por queratinocitos para formar un "equivalente de piel viva" en su invención. Está implícito que los productos de su invención formarían la base para el uso directamente como tratamiento.
Por el contrario, los productos de la presente invención se pueden usar como tratamiento una vez que ha madurado la matriz de tipo colágeno, se ha secado por congelación (y esterilizado) y repoblado con células nuevas, más probablemente fibroblastos o fibroblastos y queratinocitos. El producto de la presente invención se puede almacenar como una matriz de tipo colágeno secada por congelación intermedia que se puede reconstituir siempre que se desee para formar el "equivalente de piel viva" funcional usado como un tratamiento en el cierre de heridas.
Figuras
A continuación se describen aspectos adicionales de la invención así como realizaciones específicas de la invención solamente a modo de ejemplo con referencia a las figuras adjuntas, de las que:
La Figura 1 muestra ejemplos de construcciones basadas en fibrina. A) una construcción basada en fibrina moldeada sobre un cubreobjetos esterilizado de 13 mm de diámetro (día 0); B) una construcción basada en fibrina moldeada sobre un cubreobjetos esterilizado de 2 cm x 2 cm (día 0); C) Ocho construcciones basadas en fibrina moldeadas directamente sobre plástico de cultivo tisular (día 42) en los pocillos de una placa de cultivo tisular de ocho pocillos; D) una construcción de fibrina (aproximadamente 2 cm x 2 cm) moldeada directamente sobre la superficie inferior de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos;
La Figura 2 muestra maduración de construcciones basadas en fibrina a lo largo de 49 días. A) una construcción basada en fibrina de 2 cm x 2 cm el día 0 (d0, día de moldeo); B) 17 días post-moldeo; y de nuevo C) 43 días post-moldeo. D) una segunda construcción liberada de restricción el día 17 post-moldeo; E) la construcción en (C) liberada de restricción el día 43. F) una segunda construcción d0 manipulada con pinzas; y G) construcción de día 49 manipulada con pinzas;
La Figura 3 ilustra propiedades de construcciones maduras. A) vistas macroscópica (izquierda) y microscópica (derecha) de secciones incluidas en parafina de construcciones maduradas durante 49 días post-moldeo y teñidas con Tricrómico de Masson que tiñe colágeno (azul). B) una construcción similar moldeada sobre un cubreobjetos de vidrio de 2 cm x 2 cm, madurada durante 49 días y secada por congelación in situ y C) una construcción similar a (B), pero retirada del cubreobjetos de soporte antes de secarse por congelación. D) la misma construcción que (C) observada bajo aumentos y a través de luz polarizada.
La Figura 4 muestra disminución de escala de construcciones. A) cuatro construcciones individuales moldeadas sobre cubreobjetos de 2 cm x 2 cm, con fibrina sin células moldeada entre cada construcción y B) aumento de la unión entre dos cubreobjetos de este tipo aproximadamente 14 días post-moldeo;
La Figura 5 ilustra las influencias de la composición del medio y el protocolo de suministro sobre la contracción de las construcciones;
La Figura 6 muestra una estimación de contenido de colágeno en construcciones maduras. La Figura ilustra que construcciones basadas en fibrina (barra derecha) acumulan considerablemente más colágeno que construcciones sin fibrina moldeadas directamente en transwell (barra izquierda).
La Figura 7 muestra el efecto de fenitoína sobre el contenido y la contracción de colágeno. A) contenido de colágeno (\mug/ml) de fibroblastos en monocapa tratada con fenitoína durante 21 días. B) efecto de fenitoína sobre la contracción de construcciones basadas en fibrina;
La Figura 8 muestra el efecto del soporte de moldeo sobre la resistencia de la construcción. Esta serie de figuras ilustra una construcción sometida a ensayo mecánico para determinar su resistencia a la tracción final de una construcción moldeada sobre un portaobjetos de vidrio (5 cm x 2 cm); y
La Figura 9 muestra tinción inmunofluorescente para Colágeno I en una construcción.
La Figura 10 muestra que una construcción (A) de acuerdo con la invención tiene un alto grado de maduración fibrilar de colágeno en comparación con construcción de fibrina (B).
La Figura 11 muestra que el contenido de colágeno aumenta con el tiempo.
La Figura 12 muestra construcciones secadas por congelación y re-hidratadas de la invención. (A) una construcción ilustrativa de la invención, matriz de construcción observada bajo iluminación UV en la que es evidente la naturaleza fibrosa de la estructura. (B) una construcción ilustrativa de la invención secada por congelación, rehidratada y repoblada a lo largo de 2 días con HDF marcados fluorescentemente que se han unido de forma exitosa a la construcción. Las células son visibles como objetos con forma de huso brillantes. (C) actividad metabólica de la construcción secada por congelación y re-hidratada medida por Alamar Blue^{TM} y presentada como el porcentaje de reducción de Alamar Blue a lo largo de tiempo (es decir, como la pendiente del gráfico); (D) actividad metabólica de una construcción secada por congelación de la invención después de rehidratación y re-repoblación con HDF a lo largo de 2 días a 37ºC, incubador de CO_{2} al 5% presentada como una función del porcentaje de reducción de Alamar Blue^{TM} a lo largo del tiempo (como anteriormente).
La Figura 13 muestra remanentes celulares en construcciones secadas por congelación. La tinción nuclear (DAPI) observada como puntos brillantes ilustra que están presentes restos nucleares en las construcciones secadas al aire (A) y secadas por congelación (B) de la invención. Aunque los restos permanecen, las construcciones carecen de actividad celular como se ilustra en la Figura 12 (B).
La Figura 14 muestra una imagen de MEB de una sección a través de una construcción no repoblada secada por congelación de la invención. Una imagen de microscopio electrónico de barrido de sección transversal de una construcción de la invención parece mostrar las fibras de tejido conectivo densamente empaquetadas típicas de la capa dérmica de la piel. A modo de referencia véase, por ejemplo, Kessel y Kardon [Tissues and organs: a text-atlas of scanning electron microscopy (1979). Publishers WH. Freeman and Co. p149.]. Aumento 835x.
Parte Experimental
Un propósito del presente estudio fue investigar los requerimientos básicos para y la fiabilidad de producir un equivalente de tejido conectivo o "construcción", tal como un producto de cicatrización que se parecería estrechamente a un injerto de piel o un equivalente de piel viva para el uso en sustitución de tejido perdido. A diferencia de otras aplicaciones disponibles actualmente o previstas en el mercado avanzado de cicatrización (véase, por ejemplo, la anterior Tabla 1), la presente construcción de tejido conectivo de forma ideal sería equivalente a un injerto de piel en cuanto a capacidad de cicatrización y tendría un rendimiento similar.
En términos generales, se puede entender que un reemplazo de piel o equivalente de piel de la presente invención debe tener preferiblemente una o más de las siguientes amplias especificaciones:
(1)
Intervalo de tamaño (4 cm^{2}-100 cm^{2});
(2)
Lados rectos;
(3)
Menos de 2 mm de grosor;
(4)
No se tiene que plegar sobre sí mismo;
(5)
Debe adaptarse al sitio de la herida;
(6)
Se tiene que poder suturar, apilar, poner en malla; y
(7)
Reemplazo permanente o efecto de curación permanente.
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La piel tiene flexibilidad, resistencia a la tracción y elasticidad características. Estas características todavía no se han conseguido in vitro mediante la creación por ingeniería genética de tejidos hasta el mismo alcance de lo que tiene lugar de forma natural en la piel. El equivalente de tejido conectivo tal como un equivalente de piel viva tiene preferiblemente una o más de las siguientes características que se piensa que son deseables, por ejemplo, en la formulación de un reemplazo de piel creado por ingeniería genética de tejido:
(1)
Resistencia, rigidez, elasticidad, flexibilidad máxima;
(2)
Que se puede suturar, apilar, poner en malla;
(3)
Contracción de construcción mínima;
(4)
Colágeno insoluble máximo u óptimo (especialmente colágeno I);
(5)
Componentes de ECM máximos u óptimos (especialmente colágeno III, elastina);
(6)
Potencial de vascularización;
(7)
Potencial para formar un reemplazo de piel permanente;
(8)
Estable en almacenamiento; y
(9)
Que se puede cambiar de escala.
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Varios modos para conseguir estos criterios de valoración se han explorado por los presentes inventores y entran dentro de una o más de las siguientes amplias categorías:
(1)
Componentes de medio (agentes químicos, factores de crecimiento, exclusión por volumen);
(2)
Estimulación física (eléctrica, tensión, movimiento, ultrasonidos, luz infrarroja);
(3)
Condiciones de biorreactor (confluencia, protocolo de suministro, geometrías); y
(4)
Sistemas de soporte (monocapa, fibrina, capa secada por congelación).
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Se realizaron experimentos preliminares en los que se sembraron HDF en o sobre geles de fibrina. Los geles se moldearon en placas de Petri (aproximadamente 8,3 cm de diámetro) o en TransWell (aproximadamente 7,5 cm de diámetro) en los que el gel/los fibroblastos se asientan sobre un filtro de policarbonato. Fue evidente a partir de estos experimentos preliminares que, a menos que se anclaran en TransWell, los geles se contrajeron inmediatamente después de la gelificación de la fibrina y continuaron encogiéndose de forma máxima hasta una esfera de 1 mm de diámetro. El que los fibroblastos en estos geles permanecieron viables se demostró por migración de los HDF de los geles y proliferación durante su tiempo en cultivo para formar una lámina de fibroblastos. La contracción de la propia lámina de fibroblastos se observó a lo largo del periodo de cultivo de cuatro semanas. Por el contrario, los geles moldeados en TransWell no se contrajeron durante aproximadamente 3 semanas en cultivo tisular a menos que se retiraran de la membrana de filtro de policarbonato, punto en el que los mismos se contrajeron hasta el mismo alcance que geles de fibrina/HDF preparados recientemente. Sin embargo, la contracción se evitó fijando estas construcciones en formalina antes de la retirada de la
membrana de TransWell. De forma natural, la fijación con formalina también convierte las células en no viables.
Basándose en los experimentos preliminares, se diseñaron experimentos adicionales como se señala a continuación.
Materiales, Métodos y aspectos Técnicos Parámetros de moldeo
Se han explorado y se están explorando varios prototipos para moldear fibroblastos en fibrina:
(1)
Cubreobjetos de vidrio esterilizados de 2,2 cm x 2,2 cm (cuadrado);
(2)
2 cm x 2 cm (aproximadamente), moldeados (a pulso) directamente sobre la superficie del fondo de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos;
(3)
2,7 cm x 3,3 cm (rectangular) moldeados directamente sobre la superficie del fondo de una placa de cultivo de tejidos de 8 pocillos.
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Otras geometrías/variaciones han incluido:
(1)
Fibroblastos/fibrina moldeados sobre portaobjetos de vidrio esterilizados de 2 cm x 5 cm;
(2)
Fibroblastos/fibrina moldeados dentro de rectángulo (2 cm x 5 cm) inscrito sobre membrana de policarbonato (tamaño de poro 0,4 \mum);
(3)
Fibroblastos/fibrina o solamente fibrina moldeados sobre una base de construcciones de fibroblastos/fibrina moldeados previamente: y
(4)
Fibroblastos/fibrina moldeados sobre una base de construcciones de fibroblastos/fibrina (previamente moldeados y madurados) secadas por congelación.
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Adicionalmente se han moldeado fibroblastos (sin fibrina) directamente sobre:
\quad
Transwell de policarbonato de 24 mm de diámetro, tamaño de poro 0,4 \mum.
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El protocolo de moldeo de la presente invención se ha desarrollado a partir de Tuan et al. (1996) y Neidert et al. (2002), que describen inscribir un círculo (diámetro 8 mm) sobre el fondo de una placa de cultivo de tejidos de plástico para servir como una restricción de moldeo para una mezcla (en una proporción de 4:1:1) de fibrinógeno, células en medio de cultivo tisular y trombina. Inicialmente, el moldeo de la mezcla líquida en el centro del círculo inscrito como se ha descrito en la técnica anterior dio como resultado la formación de una "bóveda" limitada por el círculo inscrito mediante la tensión superficial en su límite. Sin embargo, la trombina escinde el fibrinógeno y las moléculas de fibrina resultantes se ensamblan para provocar gelificación conservando de este modo la forma "abovedada" de la construcción. Esta característica permite la "compactación restringida mecánicamente" requerida para la fabricación de equivalentes creados por ingeniería genética de tejidos de suficiente "consistencia y resistencia" (Neidert et al., 2002). La matriz de fibrina proporcionada como el medio de moldeo para estas construcciones proporciona una red fibrilar que se puede alinear por las células en la construcción. Finalmente, el gel de fibrina se remodela y la fibrina se sustituye por colágeno I, el componente principal de matriz extracelular (ECM) en piel y otros componentes de la ECM.
Las construcciones que se moldean de acuerdo con las geometrías del prototipo novedoso que se han descrito anteriormente son versiones aumentadas en escala de las construcciones de Tuan/Neidert (véase la siguiente Tabla 2) en las que se estima que la altura de las construcciones es 1500 \mum.
Se ha observado que, además de círculos, las construcciones se pueden moldear como cuadrados o rectángulos sobre soportes pre-fabricados (por ejemplo, cubreobjetos, portaobjetos o membranas) o moldear independientemente de soporte directamente sobre plástico de cultivo tisular. Sin embargo, es importante que durante el moldeo, la mezcla líquida (fibrinógeno, células + medio, trombina) no se ponga en contacto con las paredes de soporte del recipiente en el que se moldea ya que esto rompe la tensión superficial y permite que la mezcla líquida "trepe" hacia arriba por las paredes del recipiente. Esto da como resultado una conformación cóncava en vez de la convexa deseada y pérdida de altura de la construcción.
Antes del moldeo, el fibrinógeno, la trombina y la mezcla celular se mantienen en frío (sobre hielo) para retardar el proceso de gelificación y para proporcionar una "ventana" adecuada para permitir el moldeo en la forma deseada. Generalmente, el moldeo se realiza del mejor modo por moldeo en el centro de la restricción de moldeo y avanzando hacia el exterior de tal forma que tenga lugar suficiente "dispersión" de la mezcla antes de la gelificación. Se prevé que las dimensiones de moldeo que se han descrito anteriormente se podrán cambiar de escala aumentando el volumen de moldeo para preparar láminas mayores o usando fibrina como adhesivo para unir entre sí varias construcciones menores (véase a continuación).
TABLA 2 Parámetros de aumento de escala para construcciones basadas en fibrina
3
Método de moldeo
Las construcciones que se han descrito en Tuan et al. (1996) y Neidert et al. (2002) usaron 100 \mul de fibrinógeno (5 mg/ml), células en medio (0,5x10^{6}/ml) y trombina (25 unidades/ml) en una proporción de 4:1:1. Usando la misma fórmula se moldearon construcciones de acuerdo con un aspecto de la presente invención sobre cubreobjetos de vidrio (estériles) o membranas de policarbonato (tamaño de poro 0,4 \mum) o directamente sobre plástico de cultivo tisular. Alternativamente, otros materiales de soporte que proporcionan un grado de rigidez conveniente para la manipulación por operarios se podrían usar para soportar las construcciones y como un molde o forma para moldear la construcción hasta la conformación deseada, por ejemplo, materiales de refuerzo de plástico adecuados para aplicaciones de dispositivos médicos, gasa con vaselina/parafina u otros materiales de membrana. El soporte de moldeo se debe secar preferiblemente sobre la superficie sobre la que se aplicará la mezcla de fibrina. El orden de adición es: células + medio, fibrinógeno, trombina. Estos dos últimos se mantienen fríos sobre hielo o en un aparato de bloque de enfriamiento (2-10ºC) hasta la adición de las células. El número correcto de células para el tamaño de la construcción (véase la Tabla 2) se resuspende en medio DMEM-10 de un volumen apropiado. Después se añade el fibrinógeno a las células y se mezcla cuidadosamente. Se añade la trombina y toda la mezcla se toma en una pipeta de volumen adecuado y se moldea sobre el medio de soporte inmediatamente. Una vez que se ha añadido la trombina, la gelificación debe tener lugar muy rápidamente. Cuando se usa una plataforma de moldeo preformada (por ejemplo, cubreobjetos de vidrio), el moldeo debe tener lugar preferiblemente desde el centro de la plataforma y se debe permitir que la mezcla líquida llene la forma mediante tensión superficial. De otro modo, si se moldea a pulso, se moldea un esbozo de la conformación y el tamaño deseados sobre la superficie de la plataforma de moldeo y el resto se "introduce" añadiendo con pipeta en el centro del esbozo. Se dejan madurar las construcciones durante 1 hora a 37ºC antes de la adición de medio apropiado (DMEM-10 o Total) suficiente para cubrir toda la construcción. Una vez moldeadas, las construcciones se pueden cultivar en medio (como se describe más adelante) hasta 9 semanas en uno de los protocolos de suministro que se describen más adelante, para maximizar el depósito de colágeno, particularmente colágeno I, y otros componentes de ECM tales como elastina.
Componentes de medio
El proceso por el que se influye en las construcciones para depositar colágeno y otra ECM se denomina "maduración" y tiene lugar generalmente a lo largo de 3-9 semanas después del moldeo. Muchos factores influyen en el depósito de colágeno en equivalentes de piel creados por ingeniería genética de tejidos. Entre los mismos están factores de crecimiento solubles y agentes químicos que se pueden añadir al medio de cultivo tisular en el que se cultivan los equivalentes de piel. La fibrina induce la expresión de colágeno preparando de este modo una base ideal para construir equivalentes de piel. Además, la fibrina captura otros factores solubles que pueden inducir el depósito de colágeno en el medio mejorando y aumentando de este modo la concentración local de los mismos dentro de la propia construcción.
Un medio inductor de colágeno para las construcciones incluye los siguientes ingredientes y se denominó Medio Total (TM; proveedor indicado entre paréntesis):
3 partes de medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM): 1 parte de medio Hams F-12 (BioWhittaker o Cambrex))
NBCS o FCS al 2-10% (InVitrogen)
GlutaMAX 4 mM L-glutamina 2 mM (InVitrogen)
5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (Sigma Corp.)
0,4 \mug/ml de hidrocortisona (Sigma)
etanolamina 1x10^{-4} M (Fluka, Nº 02400 calidad ACS o Sigma) + o-fosforil-etanolamina 1x10^{-4} M (Sigma)
5 \mug/ml de transferrina + triiodotironina 20 pM (Sigma)
6,78 ng/ml de selenio (Sigma Aldrich Fine Chemicals)
0,2 \mug/ml de L-prolina (Sigma)
0,1 \mug/ml de glicina (Sigma).
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Se conoce que los siguientes ingredientes adicionales inducen síntesis de colágeno adicional y se han incluido en algunos experimentos:
5 \mug/ml de insulina (Sigma); y/o
50 ng/ml de ácido L-ascórbico (Sigma); y/o
5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (Sigma); y/o
5 \mug/ml de TGF-\beta (Sigma); y/o
PEG al 0,05% (Sigma); y/o
0,01 U/ml de plasmina (Calbiochem).
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Y, adicionalmente o alternativamente, en algunos experimentos el medio inductor de colágeno comprendía:
10 \mug/ml de fenitoína (Sigma); y/o
25 \mug/ml de PDFG (Upstate Biotechnology).
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La fenitoína es un agente que se conoce a partir de otros estudios que induce el depósito de colágeno, inhibe la contracción de fibroblastos e influye positivamente en la vascularización. Sin embargo, la fenitoína no se ha ensayado en la producción de una construcción de tejido conectivo y sus posibles efectos en la misma, particularmente en combinación con otros factores, se desconocía.
El PDGF es un mitógeno de fibroblastos e induce expresión de colágeno.
En algunos experimentos se usó una composición de medio mucho más simple (medio DMEM), también conocido como medio de proliferación, por los motivos indicados más adelante:
Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (Cambrex o BioWhittaker)
NBCS o FCS al 2-10%
GlutaMAX 4 mM L-glutamina 2 mM.
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Durante la fabricación se pueden requerir materiales sin procesar para conformar hasta un patrón superior del que se requiere generalmente durante las fases de investigación y desarrollo de la invención. La Tabla 3 enumera los proveedores de materiales sin procesar de calidad clínica o de farmacopea usando en la fabricación de la invención. Para algunos materiales no existen materiales sin procesar de calidad clínica o de farmacopea pero los fabricantes pueden proporcionar un certificado de análisis (incluyendo la fecha de caducidad) para el material haciendo que sea más adecuado para el uso en la fabricación de prototipos clínicos que materiales usados en fases de investigación y desarrollo.
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TABLA 3 Proveedor de calidad de fabricación y calidad de sustancia
100
Protocolos de suministro, confluencia de células, número de pases, tipo de células
Neidert et al. (2002) observaron un aumento del contenido de colágeno, resistencia elástica y a la tracción final de sus construcciones basadas en fibrina cuando su medio de crecimiento se reemplazó tres veces por semana con respecto a cuando se reemplazó una vez por semana. Sin embargo, además de reemplazar ingredientes agotados y eliminar metabolitos y catabolitos potencialmente dañinos, se consideró que los cambios de medio también podrían eliminar los "bloques de construcción" para moléculas complejas tales como las observadas en la ECM. Además, se consideró que cualquier actividad que perturba el "equilibrio" en condiciones de medio es un estresante potencial de células y esto puede tener influencia positiva y/o negativa sobre el comportamiento celular. Los cambios de la frecuencia y los componentes usados en cada reemplazo de medio, por tanto, pueden tener un efecto sobre el depósito de colágeno y otra ECM.
Las construcciones se cultivaron durante 3-9 semanas en diversas condiciones de cultivo incluyendo:
(1)
Ciclos repetidos de agotamiento de suero (medio DMEM + NBCS o FBS al 0,1%) 3 días, TM 3 días;
(2)
Medio DMEM (0-4 semanas) seguido de TM durante (5-9 semanas);
(3)
Medio DMEM (0-4 semanas) seguido de TM \pm fenitoína, \pm PDGF durante (5-9 semanas).
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Además, usando estas diversas composiciones de medio, las construcciones se alimentaron una vez, dos veces o tres veces por semana. Además, no se incluyeron todos los ingredientes en todos los cambios de medio. Por ejemplo, ingredientes inestables tales como PDGF, TGF-\beta y EGF se pueden añadir en cada cambio de medio, una vez por semana, una vez cada tres semanas, una vez a las tres semanas y de nuevo a las siete semanas. Alternativamente, en vez de eliminar todo el medio agotado en cada cambio de medio, el medio agotado se puede suplementar con medio nuevo o factores nuevos, para que los factores beneficiosos que se están acumulando puedan permanecer en el medio. Alternativamente, el medio agotado se podría eliminar y rellenar por un sistema de flujo continuo que funcione sobre las construcciones de tal forma que el medio se reemplace diariamente, cada medio día o cada hora o como se demande por un sistema de biorretroalimentación que controla los componentes del medio.
Además de los componentes del medio, el número de las células se vio influido por el protocolo de suministro adoptado en estos experimentos. Por ejemplo, las células sometidas a TM sintetizarían y depositarían colágeno más probablemente mientras que células sometidas a medio DMEM sintetizarían menos probablemente colágeno pero proliferarían más probablemente en las construcciones. Por tanto, cuanto más tiempo se mantuvieran las células en medio DMEM antes de cambiar a TM, más células se acumularían en la construcción. Además, en determinadas geometrías de construcción se minimizó la contracción por incubación inicial en DMEM antes de cambiar a TM.
Finalmente, la edad (o número de pases) de células puede influir en su capacidad para proliferar, expresar y depositar colágeno y otra ECM y para contraer el equivalente de piel, por lo tanto, el número de pases ("p") (p6-p15) fue otro parámetro ensayado en estas construcciones. De forma similar, aunque las construcciones estaban compuestas habitualmente por HDF y condiciones de cultivo usadas en los experimentos que favorecían el cultivo y la supervivencia de estas células, es posible que un componente de otros tipos de células pudiera influir en la capacidad de HDF para preparar y depositar colágeno y otra ECM. Normalmente, los HDF usados en las construcciones se obtienen de prepucio neonatal humano. Una mezcla de células existe en el tejido intacto y para aislar los HDF de los demás tipos celulares se usa una combinación de digestión enzimática y medio de cultivo para favorecer la extensión de HDF. Después de seis pases, la mayoría de las células (>90%) tratadas de este modo son HDF. Para incluir otros tipos celulares potencialmente beneficiosos en las construcciones, los prepucios neonatales humanos se digirieron enzimáticamente para proporcionar una suspensión de células y, en vez de poner las mismas en cultivo tisular, se moldearon inmediatamente en construcciones basadas en fibrina.
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Productos finales
Una vez que las construcciones de la invención se han madurado hasta el máximo se retiran del cultivo tisular y se pueden tratar en uno o más de varios modos:
(1)
Envasar para envío en medio de transporte de producto;
(2)
Queratinocitos añadidos a la superficie y maduración adicional antes del envasado en medio de transporte de producto para envío;
(3)
Secar por congelación y envasar en seco para envío;
(4)
Secar por congelación y envasar para almacenamiento hasta 18 meses;
(5)
Secar por congelación y repoblar con células (fibroblastos y/o queratinocitos) y fibrina, envasar para envío en medio de transporte de producto; y/o
(6)
Secar por congelación y repoblar con células (fibroblastos y/o queratinocitos) y fibrina, madurar adicionalmente, después envasar para envío en medio de transporte de producto.
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Cualquiera de estos productos se puede cortar hasta una conformación y tamaño deseados.
Cualquiera de estos criterios de valoración puede tener una aplicación o aplicaciones clínicas particulares. Además, se pueden añadir diversos factores de crecimiento (por ejemplo, VEGF) o sustancias químicas al producto final (enviado) de tal forma que cuando se coloca in situ se induce la vascularización.
Al final del periodo de maduración, las construcciones se pueden hacer más robustas y resistentes a degradación en la herida reticulando usando medios químicos o mediante exposición a luz ultravioleta.
Además, una muestra de los productos finales (después de la maduración) se evalúa para características físicas y bioquímicas tales como contenido o presencia de colágeno I, colágeno III y elastina y para resistencia a la tracción y elástica, perfil de expresión de genes (especialmente genes que generalmente se piensa que están implicados en cicatrización). Además, se pueden ensayar parámetros tales como el potencial de la construcción de inducir vascularización o para persistir en el entorno de la herida usando sistemas sustitutos de modelado.
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Método para medir contenido de colágeno de construcciones Ensayo Sircol
Se deben preparar patrones apropiados (0-500 \mug/ml de colágeno). Las muestras tienen que estar en medio que contenga menos del 5% de suero. Esto es particularmente importante si se ensayan medios, ya que se producirá colágeno soluble en los mismos. Para solubilizar colágeno, las muestras se deben digerir en 1 ml de 5 mg/ml de pepsina (en ácido acético 0,5 M) durante una noche a temperatura ambiente. Si las soluciones están claras sin material particulado visible, se debe proceder con el ensayo Sircol. Si están turbias o contienen material particulado, hay que proceder del siguiente modo:
Las muestras se deben pasar a través de una jeringa de 1 ml y una serie de agujas, de aproximadamente calibre 19 hasta finalmente un calibre 26. Si se muestrean cultivos en monocapa, este procedimiento se debe realizar en la solución de pepsina, pero antes de la digestión durante una noche.
Después, las muestras se deben incubar durante > 1 hora a 37ºC.
Centrifugar brevemente muestras en una microcentrífuga a 14.000 g para sedimentar restos celulares.
Después se pueden tomar muestras de sobrenadante para el ensayo.
El colágeno insoluble remanente requiere desnaturalización por calor para proporcionar gelatina, en cuyo caso, las muestras se deben poner a 80ºC sobre un bloque de calor durante aproximadamente 20 min.
Las muestras se deben ensayar inmediatamente usando el Ensayo de Colágeno Soluble Sircol (Biocolor UK). De otro modo, las muestras se pueden congelar instantáneamente en nitrógeno líquido para análisis posterior de contenido de colágeno.
Método para medir resistencia a la tracción y resistencia elástica finales
Se pueden examinar construcciones de tejido conectivo tales como equivalentes de piel para evaluar su idoneidad para actuar en el área diana, por ejemplo, como un reemplazo de piel. Las construcciones de equivalente de piel deben poseer características y dinámicas apropiadas para el papel de reemplazo de piel en resistencia, elasticidad y durabilidad.
Se usa estiramiento y ciclos de estiramiento de construcciones para determinar el módulo de elasticidad, límite de fluencia, límite elástico, límite proporcional y punto de ruptura. Estos se calcularían usando instrumentación apropiada y software informático (Mecmesin). Se puede usar análisis de "perforación" o "inflado" (Stable Microsystems Ltd.) para determinar la extensión lateral y los valores de deformación lateral de las construcciones. Esto se realiza insertando una sonda lateralmente a través de las construcciones (perforación) o sujetando hacia abajo los bordes y aplicando presión con aire por el centro de la construcción (inflado). También se puede evaluar la permeabilidad en un ensayo similar al ensayo de inflado. Se pueden evaluar la compresión y la dureza usando técnicas con sondas.
Las construcciones se ponen sobre un dispositivo de ensayo de resistencia, solas o sobre un material de refuerzo de soporte, tal como portaobjetos de vidrio. Alternativamente, las construcciones también se pueden suturar en las esquinas de tal forma que se pueden colocar entre abrazaderas colocadas en los puntos de estiramiento. Las construcciones se agarran entre las dos abrazaderas, orientadas horizontalmente o verticalmente, sobre la máquina. El software suministrado con la máquina permite ensayar una diversidad de variables, tales como velocidad de movimiento (2-10 mm/minuto), fuerza aplicada (5x10^{5} - 5x10^{7} dina/cm^{2} por área de sección transversal), módulo de Young.
Método para evaluar expresión génica Aislamiento de ARN Total
Lavar construcciones en 10 ml de PBS frío y transferir a un tubo de centrífuga. Retirar PBS y 1-2 ml de Tri-reagent (Sigma T-9424). Agitar vorticialmente de forma breve y dejar a temperatura ambiente (o 37ºC) durante 5-15 min. Transferir el líquido a un tubo Eppendorf de 1,8 ml. Añadir 200 \mul de cloroformo por cada mililitro de Tri-reagent.
Agitar bien (no agitar vorticialmente) y dejar a temperatura ambiente durante 15 min. Centrifugar a 13.000 rpm (centrífuga Beckman Allegra 21R) a 4ºC durante 15 min. Transferir fase superior a un tubo nuevo. Evitar tomar nada de la capa inferior blanca. Añadir 500 \mul de isopropanol por cada 1 ml de Tri-reagent. Mezclar por inversión y dejar reposar durante 10 min a temperatura ambiente. Centrifugar a 13.000 rpm a 4ºC durante 15 min. Eliminar por vertido el sobrenadante y resuspender el sedimento en etanol al 75%. Centrifugar a 13.000 rpm a 4ºC durante 15 min. Repetir la etapa de lavado. Eliminar etanol al 75% y dejar secar al aire durante 10 min (no secar en exceso). Disolver sedimento en 50 \mul de agua sin RNasa (tratada con DEPC o Sigma W-4502). Determinar el rendimiento y la concentración de ARN.
Conversión de ARN a ADNc
En un tubo Eppendorf de 1,8 ml mezclar 1 \mug de ARN, 1 \mul de Oligo dT (20 pmol/ml; Roche), agua tratada con RNasa (tratada con DEPC o Sigma W-4502) para dar un volumen final de 29 \mul. Incubar a 70ºC durante 8 min. Centrifugar brevemente y poner sobre hielo durante 10 min. A cada tubo añadir:
8 \mul de tampón MMLV-RT (Promega 5x)
\mul MMLV-RT H (200 U/\mul, Promega M3681)
2 \mul de dNTP (solución madre 25 mM preparada de conjunto de dNTP 40 \mumol de Promega U1240).
\global\parskip0.900000\baselineskip
La reacción avanza durante 2-3 horas a 37ºC seguido de 2 min a 95ºC. Los productos se pueden almacenar a -20ºC.
Alternativamente, si se espera que el número de células o ARN recuperado sea bajo, el ARN se puede someter a una reacción de PCR de poliA para amplificar globalmente todo el ARNm poliadenilado en la muestra (Brady & Iscove, 1993, Methods Enzymol. 225: 611-623). Se lisan células (hasta 10^{5} células) o se resuspende ARN (0,1-100 ng) en 10 \mul de tampón DL [1 ml de tampón RT 5x (InVitrogen), 10 \mul de 20 mg/ml de BSA (Roche, calidad de biología molecular), 250 \mul de nonidet P-40 (10%, NP-40, Roche), 3,55 ml de agua sin RNasa (Sigma)], 4 \mul de inhibidor de RNasa (Ambion), 4 \mul de mezcla Prim [5 \mul de PM (800 \mul dNTP 2,5 mM (Roche), 24 \mul de dT24 (200 \muM o 40 unidades de DO/ml), 20 \mul de agua con NotI-OligodT]. Después, las muestras se desnaturalizan a 65ºC durante 1 minuto, se dejan enfriar durante 3 minutos a temperatura ambiente, después se ponen sobre hielo. Añadir 0,5 \mul de Transcriptasa Inversa M-MLV (RNasa H^{-}) a cada muestra e incubar del siguiente modo: 15 min a 37ºC, 10 min a 65ºC, después poner sobre hielo. Después, la primera cadena de ADNc se trata con Desoxinucleotidil Transferasa Terminal para poliadenilar el extremo 3' del producto de primera cadena añadiendo un volumen igual de Tampón de Prolongación 2x [1 ml de tampón de Prolongación 5x (InVitrogen), 25 \mul de dATP (100 mM; Promega), 1,475 ml de agua (Sigma)] y 0,5 \mul de TdT (InVitrogen). La reacción de prolongación tiene lugar por incubación durante 15 min a 37ºC seguido de 10 min a 65ºC y después se pone sobre hielo. Finalmente, el producto de primera cadena de ADNc prolongada (5 \mul) se amplifica por adición de 10 \mul de mezcla de PCR que consiste en 100 \mul de tampón 3M [1 ml de Tampón Taq 10x (Roche), 375 \mul de dNTP (25 mM, Roche), 10 \mul de BSA (Roche, calidad de biología molecular), 100 \mul de Triton X-100 al 10% (Roche), 25 \mul de MgCl_{2} (1 M), 2,35 ml de agua de calidad de biología molecular], 5 \mul de cebador NotI-Oligo dT (200 \muM) y 3,75 \mul de Polimerasa de Taq (Roche o Promega). La reacción avanza por ciclos (25) de incubación 1 min a 94ºC, 2 min
a 42ºC, 6 min a 72ºC, seguido de ciclos adicionales (25) de incubación 1 min a 94ºC, 1 min a 42ºC, 2 min a 72ºC.
PCR específica de genes
Para evaluar la expresión de genes específicos, se realiza PCR usando cebadores específicos diseñados para amplificar el gen de interés. Los genes de interés incluyen humanos, por ejemplo, inhibidor I de activador de plasminógeno, factor de crecimiento derivado de plaquetas, colágeno IA1, colágeno 3A, colágeno 4A2, colágeno 6A1, elastina, Ki67 y CDC6 y comprenden genes cuya expresión está implicada o influye en la cicatrización, expresión génica, proliferación, expresión, metabolismo y bioquímica de colágeno o es indicativa de estos procesos.
Usando cebadores apropiados (MWG), se realiza la amplificación por PCR convencional (no cuantitativa) en las siguientes condiciones de reacción para cada muestra de 2 \mul de ADNc:
Tampón de PCR 10x con MgCl_{2} (Roche)
2 \mul
dNTP 2 mM (Promega)
2 \mul
Cebador directo (\muM)
0,4 \mul
Cebador inverso (100 \muM)
0,4 \mul
Polimerasa Taq
0,4 \mul
Agua (Sigma W-4502)
12,8 \mul
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla se calienta a 95ºC durante 5 minutos, después se somete a ciclos de incubación (20-35) de 50 segundos a 94ºC, 1 min a 60ºC, 2 min a 75ºC, seguido de incubación a 72ºC durante 10 minutos.
Alternativamente, cada muestra de ADNc (diluida 1:1000 en agua de calidad de biología molecular) se puede someter a amplificación por PCR a tiempo real semi-cuantitativa (ABI 7700 TaqMan) en un volumen de reacción total de 15 \mul que consiste en:
ADNc (diluido 1:1000)
10 \mul
H_{2}O
5,925 \mul
Tampón 10x (kit central de Oswel de qPCR, RT-QP73-05WR)
2,5 \mul
MgCl_{2} 25 mM
3,5 \mul
dNTP 2,5 mM
2,0 \mul
Cebador Directo 100 \muM
0,225 \mul
Cebador Inverso 100 \muM
0,225 \mul
Sonda 100 \muM
0,05 \mul
Polimerasa Taq
0,125 \mul
\global\parskip1.000000\baselineskip
Método de tinción inmunohistoquímica e histoquímica para colágeno y otros componentes de ECM
Las muestras para inmunohistoquímica se congelaron instantáneamente en un baño de isopentano sujeto sobre nitrógeno líquido, en compuesto OCT (R. A. Lamb) y se almacenaron a -80. Se cortaron secciones (8 \mum) y se secaron al aire sobre portaobjetos de vidrio. Las secciones se cubrieron con anticuerpo de control o de ensayo (por ejemplo, AbCam Laboratories; anticuerpo anti-colágeno I ab6308, anticuerpo anti-elastina ab9519, anticuerpo anti-colágeno III ab6310) diluido en PBS (que contiene BSA al 10%) a concentraciones predeterminadas y se incubaron durante 30 minutos a TA. Las secciones se lavaron antes de incubarse con Ig-FITC anti-ratón o Ig-FITC-estreptavidina anti-ratón (a dilución predeterminada en PBS que contiene BSA al 10%; Jackson Immunoresearch) durante 30 minutos a TA. Después de un lavado final, los portaobjetos se montaron en una solución montante acuosa sin UV.
Se prepararon muestras para histoquímica por inclusión en parafina siguiendo protocolos convencionales y se cortaron usando un microtomo (5 \mum). Eliminar cera de las secciones transfiriendo las secciones por cuatro cambios en xileno en campana de extracción (5 minutos en cada uno para tejido blando). Las secciones se rehidrataron en tres cambios de I.M.S al 100% y un cambio de I.M.S al 95%, seguido de enjuagado en agua corriente de grifo.
Para visualizar colágeno (azul) y fibrina (rosa) en las construcciones se usó tinción de Tricrómico de Masson. Las secciones se tiñeron en solución de azul celestina 5 minutos y se enjuagaron en agua destilada, después se tiñeron en una hematoxilina con alumbre (por ejemplo, Mayer o Cole) durante 5 minutos. Después, las muestras se lavaron en agua corriente de grifo hasta que estuvieran azules. Las secciones se diferenciaron por inmersión en ácido alcohol al 1% durante 4 segundos, después se devolvieron a agua corriente de grifo: las siguientes secciones se tiñeron en solución de fucsina ácida durante 5 minutos y se enjuagaron en agua destilada, después se trataron con solución de ácido fosfomolíbdico durante 5 minutos, se secaron y se tiñeron con solución de azul de metilo durante 2-5 minutos y se enjuagaron en agua destilada. Las secciones se trataron con ácido acético al 1% durante 2 minutos, se deshidrataron mediante un cambio de I.M.S al 95% y tres cambios de I.M.S al 100% durante aproximadamente 2 minutos en cada una. Finalmente, las muestras se aclararon en cuatro cambios de xileno durante 1-2 minutos cada uno y se montaron en DPX y cubreobjetos.
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Resultados
Los resultados se muestran en las Figuras adjuntas 1 a 9.
En la Figura 1, todas las construcciones ilustradas están restringidas en la dirección horizontal y tienen aproximadamente 1,5 mm de altura. Obsérvese que las construcciones ilustradas en las Figuras 1C y D son 42 y 50 días post-moldeo, respectivamente, y no se han contraído de forma apreciable.
Es evidente a partir de las ilustraciones en la Figura 2 que a lo largo del tiempo y en condiciones de medio que tienen por objeto reforzar colágeno, que las construcciones pierden translucidez y se convierten considerablemente en más opacas indicando que el colágeno se ha acumulado en las construcciones (compárense A, B, C). Además, la construcción a los 43 días post-moldeo (E) mantiene su conformación cuando se libera de su restricción (en este caso, el cubreobjetos de vidrio), mientras que una construcción similar (D) se contrae espectacularmente cuando se libera de la restricción el día 17 post-moldeo, ilustrando que el día 43, la construcción ha obtenido estructura interna y rigidez. Finalmente, la manipulación de las construcciones el día 0 (F) y día 43 (G) post-moldeo demuestra que la resistencia y elasticidad se han obtenido en las construcciones maduras.
Durante el proceso de maduración, el contenido de colágeno de las construcciones aumentó y esto es evidente en la Figura 3 (A), en la que se ha usado la tinción de Tricrómico para visualizar colágeno (azul) en las construcciones y la Figura 3 (D) en la que se puede observar una construcción madura que muestra birrefringencia, una propiedad de fibrillas de colágeno maduro. Aunque se puede proporcionar rigidez por soportes subyacentes tales como cubreobjetos, como en la Figura 3 (B), como se observa en la Figura 3 (C), las construcciones secadas por congelación en ausencia de soportes subyacentes también conservan cierta rigidez.
Se muestra una disminución de escala de las construcciones en la Figura 4. Una estrategia para preparar construcciones de mayor tamaño sería "coser" varias construcciones menores entre sí para preparar una lámina de construcciones que se parezca a una lámina de sellos de correos. Para fijar las construcciones entre sí, los puentes entre cada construcción se construyeron a partir de fibrina sin células, de tal forma que se induciría a los fibroblastos para migrar al puente y "coser" una construcción con sus vecinos inmediatos como se muestra en la Figura 4 (B). La flecha en la Figura 4 (B) indica que los fibroblastos han colonizado el puente de fibrina inter-construcción: las líneas a la derecha y la izquierda de la flecha son los bordes de los cubreobjetos de dos construcciones adyacentes.
Es importante para las construcciones que se restringan para que las células se alineen el colágeno cuando se acumula en las construcciones. Sin embargo, como se ilustra en la Figura 2 (D), si la restricción se liberó antes de que estuviera completamente maduro, la liberación de la tensión que restringe las construcciones provocó que los fibroblastos contrajeran irreversiblemente la construcción. Se ensayaron diversas formulaciones de medio y protocolos de suministro en las construcciones moldeadas sobre cubreobjetos de vidrio de 2 cm x 2 cm y se ilustra un resumen de estos experimentos en la Figura 5.
En la Figura 6 se muestra una estimación del contenido de colágeno en construcciones maduras. Las construcciones se moldearon directamente en transwell. Además, las construcciones basadas en fibrina se maduraron en medio que se suplementó con TGF-\beta1 y plasmina. Todos los demás componentes del medio y protocolos de suministro fueron idénticos.
La fenitoína es uno de muchos factores que afecta a la expresión o el depósito de colágeno. En algunos experimentos se incluyeron 10 mg/ml de fenitoína al medio ya que se demostró previamente (véase la Figura 7 (A)) que esto era la dosis óptima para aumentar el depósito de colágeno por las células. Un segundo efecto de fenitoína se ilustra en la Figura 7 (B), de hecho, que la fenitoína disminuye la contracción de construcciones liberadas de la restricción (en este ejemplo, un cubreobjetos de vidrio de 2 cm x 2 cm). La construcción a la izquierda se incubó en medio de cultivo sin fenitoína mientras que la construcción a la derecha recibió 10 \mug/ml de fenitoína en el medio de cultivo.
La serie de fotografías en la Figura 8 muestra una construcción sometida a ensayo mecánico para determinar su resistencia a la tracción final de una construcción moldeada sobre un portaobjetos de vidrio (5 cm x 2 cm). A) El portaobjetos de vidrio que soporta la construcción se rompe bajo tracción (flechas pequeñas), la construcción comienza a estirarse (flecha grande), B) la construcción continúa estirándose, C) la construcción pierde integridad estructural y finalmente se rompe.
La Figura 9 ilustra la construcción fijada y procesada como se ha descrito anteriormente para visualizar la presencia y arquitectura de colágeno I depositado por HDF en la construcción madura.
Estos datos confirman claramente que en las condiciones usadas en estos experimentos, los HDF depositan colágeno I en las construcciones y que esto proporciona estructura a las construcciones.
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Ejemplos experimentales
Complejidad estructural de construcciones de SKN aumenta con el tiempo y la maduración. Se moldearon construcciones incluyendo fibroblastos dérmicos humanos dentro de una matriz de fibrina e incubando en Medio Total hasta 49 días (como se ha descrito previamente). El medio se cambió cada 2-3 días y se analizaron las construcciones usando técnicas histológicas. Los resultados mostraron que tuvieron lugar cambios ultraestructurales durante este periodo de maduración de 49 días. Después de 11 días, la tinción histológica con la tinción combinada MSB demostró que la fibrina original se había sustituido en gran medida por colágeno. Sin embargo, en esta etapa temprana en el proceso de maduración, había poca evidencia de integridad estructural ya que no se observaron características ultraestructurales en el examen microscópico. 21 días post-moldeo, el examen histológico mostró que la estructura fibrilar de colágeno se estaba desarrollando en las construcciones. Sin embargo, algunas áreas permanecieron desprovistas de contenido fibrilar, indicando que las mismas todavía tenían que madurar completamente. La tinción histológica de secciones de construcciones después de 49 días de maduración mostró un contenido fibrilar significativo a lo largo de las construcciones. Cambios adicionales de medio más allá de 49 días no mejoraron de forma apreciable el contenido ultraestructural de las construcciones pero podrían servir en vez de esto para mantener la estructura que ya se había desarrollado.
Los tiempos de incubación/maduración preferidos, por lo tanto, son un mínimo de 21 días y un máximo de 63 días. Sería más preferible 21-49 días, 21-35 días, 21-29 días.
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Resistencia de construcciones a digestión en entorno de emulación de herida (evidencia de refuerzo de cicatrización por intención primaria)
El fluido encontrado en heridas agudas es esencialmente análogo a plasma o suero sanguíneo, la sustancia líquida de la sangre. Los componentes de fluidos de heridas dependen de la naturaleza de la herida. Sin embargo, en heridas agudas están presentes diversas metaloproteinasas de matriz (MMP) que pueden degradar componentes de matriz extracelular incluyendo colagenasas, gelatinasas y estromolisinas. Éstas se mantienen en equilibrio con diversos inhibidores de MMP (TIMP). Además, están presentes factores de crecimiento y otros factores que influyen en las células dentro de la herida tales como TNF-\alpha e IL-1. Estos factores pueden tener un efecto profundo sobre la persistencia de un producto de cicatrización puesto en el entorno de la herida. Muchos productos disponibles actualmente para aplicaciones de cicatrización curan por intención secundaria, es decir, mediante un medio indirecto. Estas aplicaciones, cuando se ponen en el entorno de la herida, se disuelven en gran medida liberando de este modo células y factores de crecimiento que participan en o que aceleran el proceso intrínseco de cicatrización. El objeto de la presente invención es curar por intención primaria, es decir, mediante medio directo de proporcionar cierre de herida. La incubación de objetos de ensayo en fluido de emulación de herida aguda proporciona un sustituto experimental para ilustrar esto.
ICX-SKN, el producto de esta invención (una construcción madurada en Medio Total durante 49 días con cambios de medio cada 2-3 días) e ICX-PRO (una composición de HDF incluidos en fibrina humana y madurados en medio de control durante un máximo de 24 horas es un producto diseñado para curar por intención secundaria estimulando la cicatrización (Ref: documento WO 2005/000523)) se pusieron ambos en suero humano (Sigma Corp.) hasta 72 días con cambios de suero cada 2-5 días.
Los resultados muestran que se observó que ICX-PRO, cuando se pone en el entorno de emulación de herida, se descompone, liberando las células y los factores que participan en la cicatrización en el intervalo de 8 días de incubación. Por el contrario, el producto de la presente invención puesto en el entorno de emulación de herida persistió más allá de 8 días y se mantuvo incluso después de 72 días. Es importante en la comparación por emulación de herida señalar que tanto ICX-PRO como el objeto de la presente invención se moldearon originalmente a partir de HDF incluidos en fibrina; el objeto de la invención se maduró en Medio Total durante hasta 49 días antes de la incubación en fluido de emulación de herida mientras que ICX-PRO no se maduró de forma extensa más allá de 24 horas en medio de control. Al contrario que el objeto de la invención, el contenido de colágeno de ICX-PRO está compuesto de forma poco importante prácticamente por completo por fibrina. Además, las células en ambos objetos eran idénticas en el momento del moldeo, sin embargo, en el caso de ICX-PRO, estas células y el fluido en el que se bañaron participaron en la descomposición de la matriz de fibrina mientras que no digirieron la matriz en el objeto de la invención.
Efectos de suministro sobre la maduración de las construcciones. Las construcciones de la presente invención compuestas por HDF moldeados originalmente en fibrina se suministraron en Medio Total con medio cambiado 1 vez por semana (un reemplazo de medio en 7 días), 2 veces por semana (medio reemplazado cada 4 \pm 1 días) o 3 veces por semana (medio reemplazado cada 2 \pm 1 días) a lo largo de hasta 49 días. En el examen general, las construcciones sometidas a cambios de medio relativamente más frecuentes obtuvieron más estructura observada como un "borde" de material más rígido alrededor de la circunferencia. La opacidad aumentada de estas construcciones con respecto a las construcciones alimentadas 1 ó 2 veces por semana, que permanecieron transparentes y similares a gel, también era indicativa de contenido aumentado de colágeno y estructura en construcciones alimentadas 3 veces por semana.
Actualmente, el protocolo de suministro es 3 veces por semana, aunque 7 cambios por semana (o un sistema de flujo continúo completamente cerrado) puede conducir a niveles altos mejorados de colágeno e integridad estructural.
Expresión génica en construcciones cambia con maduración. La expresión génica es indicativa de factores intrínsecos y extrínsecos que influyen en las células tales como condiciones de medio y estados de crecimiento y síntesis. La expresión de Colágeno IIIa1 y colágeno Ia1 se evaluó a partir de células obtenidas de construcciones moldeadas originalmente en fibrina como se ha descrito y mantenidas en Medio Total durante 7 días, 14 días o 49 días (los objetos de la invención), con cambios de medio cada 2-3 días, o de células obtenidas de ICX-PRO mantenidas en medio de almacenamiento. Aunque la expresión de colágeno Ia1 no se vio influida por el medio de suministro, la edad o la composición de matriz, la expresión de colágeno IIIa1 disminuyó en construcciones de la invención. Aunque la expresión de este gen se observó en momentos tempranos (7 y 14 días), en el último momento (49 días) no se detectó la expresión de este gen. Está bien establecido que el colágeno III se expresa tempranamente en la cicatrización cuando prevalece fibrina en el entorno de la herida y disminuye durante etapas posteriores de cicatrización. Estos datos apuntan a que las células presentes en el objeto de esta invención son diferentes de otras aplicaciones de cicatrización ya que están dentro de una matriz completamente madura, auto-sintetizada y, por tanto, carecen de los marcadores tempranos de cicatrización.
En experimentos relacionados similares, las construcciones se suministraron con Medio Total una vez, dos veces o tres veces por semana durante 49 días y las células de cada una de estas construcciones se analizaron para expresión de genes asociados a cicatrización, por ejemplo, colágeno IIIA1 y elastina. La expresión de colágeno IIIa1 y elastina difirió en construcciones cultivadas durante el mismo periodo de tiempo pero suministradas 3 veces, 2 veces o 1 vez por semana en Medio Total. Aunque todas las construcciones expresaron niveles idénticos de estos dos genes en momentos tempranos (por ejemplo, a los 7 días), la expresión de colágeno IIIA1 y elastina disminuyó en las construcciones suministradas más frecuentemente (3 veces por semana, los objetos de la invención) con respecto a las construcciones suministradas con menor frecuencia (1 ó 2 veces por semana). Estos datos refuerzan la conjetura de que las construcciones suministradas 3 veces por semana durante 49 días, los objetos de la invención, estaban más maduras y eran distintas de las construcciones suministradas menos frecuentemente (1 ó 2 veces por semana) no expresando genes asociados a cicatrización. La expresión del gen de control o de mantenimiento GAPDH que no está influido por condiciones de cultivo y que no está asociado a cicatrización era idéntica en todas las condiciones.
En experimentos adicionales, los HDF cultivados como monocapas o incluidos en fibrina y suministrados en Medio Total durante 21 días se recogieron y analizaron para expresión de varios genes. La expresión de genes asociados a cicatrización tales como elastina, colágeno IA1 y colágeno IIIA1 difirieron en HDF incubados en las mismas condiciones pero incluidos en fibrina o cultivados como monocapas. En este punto a medio camino en el proceso de maduración de las construcciones (los objetos de la invención), los HDF incluidos originalmente en fibrina continuaron sintetizando productos génicos asociados a cicatrización mientras que las mismas células cultivadas como una monocapa tenían estos genes regulados negativamente en gran alcance. Sin embargo, en comparación con construcciones completamente maduras de la invención (49 días, 3 cambios de medio por semana) que también tenían elastina y colágeno IIIA1 regulados negativamente, las células mantenidas en monocapa durante 21 días no tuvieron ninguna de las características estructurales de una construcción de la invención.
Colágeno en construcciones maduradas en Medio Total. Se moldearon HDF en fibrina y se mantuvieron durante 49 días en medio de control o Medio Total como se ha descrito. Las construcciones de ambos tipos se congelaron y fijaron, después se cortaron secciones y se trataron con anticuerpo de ratón dirigido contra colágeno humano de tipo I o, como un control, tratados de forma simulada. Un anticuerpo secundario conjugado con FITC dirigido contra inmunoglobulinas de ratón se aplicó después a todas las secciones. El examen de todas las secciones con microscopía de fluorescencia mostró que secciones que se tiñeron solamente con anticuerpo secundario y secciones tomadas de construcciones mantenidas en medio de control mostraron un nivel de fondo similar de tinción de fluorescencia. Sin embargo, la fluorescencia específica debido a reactividad del anticuerpo pertinente con colágeno I se acumuló hasta un alcance significativo solamente en construcciones mantenidas en Medio Total con respecto a construcciones mantenidas en medio de control.
Elastina en construcciones maduradas en Medio Total. Las construcciones se mantuvieron en Medio Total durante hasta 49 días cambiándose el medio cada 2-3 días. La expresión de elastina se analizó tanto en construcción madura como en medio recogido de la construcción madura. El método de transferencia de Western que usa anticuerpos de conejo anti-elastina humana (1:200) y anti-HRP de conejo (1:2000) se empleó para detectar la presencia de elastina. Se detectó elastina soluble de bajo peso molecular (tropoelastina aproximadamente 60-64 Kd) en las muestras de medio. Sin embargo, se detectó elastina insoluble de alto peso molecular solamente en muestras de construcciones suministradas con Medio Total con respecto a construcciones suministradas con medio de control. Estos datos sugieren que Medio Total influye en la incorporación de elastina en las construcciones en una forma insoluble de alto peso molecular como se observa en la dermis.
Figura 10. Birrefringencia de colágeno. El uso de luz polarizada en microscopía tiene aplicaciones de diagnóstico útiles debido a la capacidad de numerosas estructuras fibrosas y proteínas (así como otras moléculas y cristales) de mostrar birrefringencia. La birrefringencia, o refracción doble, es la descomposición de un rayo de luz en dos rayos (el rayo normal y el rayo extraordinario) cuando pasa a través de determinados tipos de material, dependiendo de la polarización de la luz. En microscopía, la imagen de una sustancia birrefringente rotada entre dos polarizadores cruzados aparece y desaparece con 45º de rotación. La birrefringencia es la división de luz polarizada cuando pasa a través de determinados materiales. La luz pasa a través de un polarizador seguido de la muestra de interés. Después pasa a través de un analizador puesto en ángulo recto con respecto al primero. Los rayos de luz resultantes están dentro del mismo plano pero a diferentes longitudes de onda, dando como resultado la presentación de una variedad de colores. Con la rotación de la muestra, los colores se intensifican o amortiguan hasta negro. Las áreas negras aparecen cuando los componentes de la muestra están perpendiculares con el polarizador o el analizador. Si se supone que el brillo/intensidad máxima es en 0º, en 90º se muestra una vuelta a este nivel. La oscuridad máxima (extinción) tiene lugar a 45º.
Los haces de fibras de colágenos son fuertemente birrefringentes. Las propiedades de birrefringencia para el análisis de colágeno permite la determinación del alineamiento de fibras así como una medición cualitativa de la proporción de fibras dentro de la muestra. Aunque muchos materiales biológicos son birrefringentes, cada uno se diferencia por el patrón de interferencia que produce.
La Figura ilustra (A) una construcción madurada hasta 49 días en Medio Total, que se reemplazo cada 2-3 días. Las fibras son claramente visibles por toda la rotación y a intensidad máxima, las fibras aparecen rojas, verdes y blancas. A partir de esto se concluye que no hay contenido significativo de fibrina pero un mayor contenido de colágeno. Cuando se compara con una construcción compuesta completamente por fibrina (B) en el mismo ángulo de luz polarizada a intensidad máxima no hay estructura fibrilar y la construcción es blanca solamente donde se puede detectar. Aunque la fibrina es birrefringente, lo es mucho menos que el colágeno. La construcción en (A) es fuertemente birrefringente demostrando el grado de maduración fibrilar del colágeno dentro de esta construcción y la relativa ausencia de fibrina.
Figura 11. El contenido de colágeno aumenta con el tiempo y las condiciones de maduración. Las construcciones se mantuvieron en medio de Control o en Medio Total hasta 49 días cambiándose el medio cada 2-3 días. El examen general de las construcciones los días 7, 35 ó 49 ilustra que la presencia de factores de crecimiento tales como TGF-\beta y EGF en Medio Total, que estaban ausentes en el medio de control, contribuyeron a cambios significativos en el aspecto de construcciones maduradas en este medio en comparación con el medio de control. Funcionalmente, las construcciones maduradas en Medio Total eran más robustas con mayor resistencia a la tracción después de la manipulación que construcciones maduradas en medio de control durante el mismo periodo de tiempo. Aunque las construcciones mantenidas en medio de control conservaron una construcción transparente similar a gelatina, las construcciones incubadas de principio a fin en Medio Total desarrollaron opacidad marcada con respecto a construcciones maduradas en medio de control y esto es un indicio del contenido de colágeno aumentado de estas construcciones.
Además, en experimentos preliminares, se ensayó la resistencia a la tracción final (o resistencia a la ruptura) de varios tipos de construcciones. Las construcciones se mantuvieron en medio de Control o en Medio Total hasta 49 días cambiándose el medio cada 2-3 días. Además se prepararon geles de ensayo artificiales de control formados sin células puramente a partir de colágeno (1 mg/ml) o fibrina (5 mg/ml) en el laboratorio para comparación con construcciones mantenidas como se ha descrito. El gráfico ilustra la resistencia a la tracción relativa de cada una de estas construcciones. Es evidente que un gel de colágeno sintético (es decir, un gel sintetizado en laboratorio en vez de autosintetizado por células) no consiguió la resistencia a la tracción de una construcción en la que se autosintetizó colágeno por células dentro de la construcción. Así mismo, un gel compuesto puramente por fibrina no consiguió resistencia a la tracción robusta. Las dos construcciones maduras, una mantenida en medio de control y la otra en Medio Total, mostraron resistencia a la tracción aumentada con respecto a los geles de ensayo artificiales. De las dos construcciones completamente maduras es evidente que la construcción madurada en Medio Total consiguió una resistencia a la tracción mayor que la construcción madurada en Medio de Control (MPM).

Claims (22)

1. Un método in vitro para formar un equivalente de tejido conectivo, que comprende las etapas de:
(i)
incubar células productoras de colágeno en o sobre una matriz de soporte;
(ii)
inducir y/o mejorar la producción de colágeno por las células productoras de colágeno para formar una construcción de tipo colágeno y degradación y reemplazo de la matriz de soporte;
(iii)
secar por congelación la construcción; y
(iv)
re-poblar la construcción secada por congelación con células productoras de colágeno y/o células epiteliales y/o células endoteliales y/o células mesenquimales, formando de este modo un equivalente de tejido conectivo, en el que:
(a)
las células productoras de colágeno son del 90% al 100% fibroblastos; por ejemplo, fibroblastos dérmicos neonatales humanos;
(b)
la matriz de soporte es una matriz de soporte provisional en la que la matriz de soporte es una matriz de fibrina, por ejemplo, formada por polimerización mediada por trombina de fibrinógeno; y
(c)
como resultado de la producción de colágeno por las células productoras de colágeno, la matriz de soporte de fibrina provisional se digiere por las células y se sustituye gradualmente por colágeno, de tal forma que la matriz de fibrina provisional se sustituye finalmente por una matriz de colágeno sintetizada in situ por las células.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el tiempo total para las etapas (i) y (ii) es un mínimo de 21 días y un máximo de 63 días, por ejemplo, 21-49 días o 21-35 días o 21-29 días.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que la producción de colágeno se induce y/o mejora por medios químicos y/o medios mecánicos.
4. El método de la reivindicación 3, en el que el medio químico comprende un medio inductor de colágeno.
5. El método de la reivindicación 4, en el que el medio inductor de colágeno comprende uno o más del grupo que consiste en fenitoína, ácido ascórbico, ácido valproico, ciclosporina A, nifedipina, diltiazem, verapamilo HCl y amlodipina.
6. El método de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que el medio inductor de colágeno comprende además o alternativamente uno o más del grupo que consiste en medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), medio Hams F-12, suero de ternero recién nacido, suero fetal de ternero, L-glutamina, factor de crecimiento epidérmico, hidrocortisona, etanolamina, o-fosforil-etanolamina, transferrina, triiodotironina, selenio, L-prolina y glicina.
7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el medio inductor de colágeno comprende además uno o más del grupo que consiste en insulina, factor de crecimiento epidérmico (EGF), TGF-\beta, polietilenglicol (PEG), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y plasmina.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que el medio inductor de colágeno se cambia diariamente, hasta 5 veces por semana, por ejemplo, 3 veces por semana, semanalmente o quincenalmente, opcionalmente con diferente frecuencia de cambios durante la formación de la construcción de tipo colágeno.
9. El método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que las células productoras de colágeno se incuban en un medio de proliferación antes o durante la incubación en o sobre la matriz de soporte.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el medio de proliferación comprende uno o más del grupo que consiste en medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), suero de ternero recién nacido, suero fetal de ternero y L-glutamina.
11. El método de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que las células productoras de colágeno se incuban en el medio de proliferación durante un periodo de 0 a 21 días, preferiblemente hasta 7 ó 14 días.
12. El método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende una etapa adicional de cultivo de las células productoras de colágeno en un medio sin suero antes o durante la incubación en o sobre la matriz de soporte.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que las células productoras de colágeno se cultivan en el medio sin suero durante un periodo de 0 a 7 días, por ejemplo, hasta 2 ó 3 días.
14. El método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la matriz de soporte se moldea sobre una superficie de base.
15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la superficie de base es una construcción secada por congelación.
16. El método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el equivalente de tejido conectivo se forma usando dos o más construcciones secadas por congelación apiladas.
17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que al menos dos de las dos o más construcciones secadas por congelación están separadas por una sustancia intercalada.
18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la sustancia intercalada comprende fibrina.
19. El método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el equivalente de tejido conectivo es un equivalente de piel.
20. El método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el equivalente de tejido conectivo tiene al menos uno y preferiblemente cuatro bordes laterales lineales.
21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dos o más equivalentes de tejido conectivo se pueden conectar a lo largo de sus bordes laterales.
22. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 21, en el que el medio mecánico para inducir y/o mejorar la producción de colágeno comprende uno cualquiera o más del grupo que consiste en estimulación eléctrica, tensión, movimiento, ultrasonidos y luz infrarroja.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0820492D0 (en) * 2008-11-07 2008-12-17 Sportcell Cell compositions and uses thereof
US8772324B2 (en) * 2009-03-25 2014-07-08 Keshav Malshe Composition and methods for the treatment of wounds
US20130209427A1 (en) * 2010-06-18 2013-08-15 Rajesh Thangapazham Hair follicle neogenesis
EP2532736A1 (en) 2011-06-08 2012-12-12 National University of Ireland, Galway Engineered living tissue substitute
US20120323325A1 (en) * 2011-06-16 2012-12-20 Fulton Judith A Autologous in situ tissue engineering
CN102499998B (zh) * 2011-12-22 2013-12-11 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 真皮等同物的构建方法
WO2014179559A1 (en) 2013-05-03 2014-11-06 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Skin substitutes and methods for hair follicle neogenesis
EP3077956B1 (en) * 2013-12-03 2023-10-11 Children's National Medical Center Method and system for wound assessment and management
GB201504124D0 (en) 2015-03-11 2015-04-22 Proqr Therapeutics B V Oligonucleotides
KR101908030B1 (ko) 2016-06-17 2018-10-15 울산대학교 산학협력단 상처 또는 궤양치료를 위한 3차원 세포시트 및 이의 제조방법

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2597499A1 (fr) 1986-04-18 1987-10-23 Merieux Inst Procede de culture microbiologique sur supports de collagene, supports pour ce procede et produits obtenus
US4837379A (en) 1988-06-02 1989-06-06 Organogenesis Inc. Fibrin-collagen tissue equivalents and methods for preparation thereof
DE4127570A1 (de) 1991-08-21 1993-02-25 Battelle Institut E V Verfahren zur lokalen antibakteriellen therapie von wunden
RU2023424C1 (ru) 1993-01-13 1994-11-30 Научно-производственный центр трансплантации и культивирования тканей Способ лечения раны
US5591444A (en) 1995-07-28 1997-01-07 Isolagen Technologies, Inc. Use of autologous dermal fibroblasts for the repair of skin and soft tissue defects
WO1998036704A1 (en) 1997-02-20 1998-08-27 Keller Gregory S Augmentation and repair of dermal, subcutaneous, and vocal cord tissue defects
AU8224598A (en) 1997-06-26 1999-01-19 Smith & Nephew Plc Cell culture products
US6150505A (en) 1997-09-19 2000-11-21 Hadasit Medical Research Services & Development Ltd. Fibrin microbeads prepared from fibrinogen, thrombin and factor XIII
CA2319558A1 (en) 1998-02-27 1999-09-02 Bioelastics Research, Ltd. Injectable implants for tissue augmentation and restoration
WO1999051164A1 (en) 1998-04-03 1999-10-14 Reprogenesis, Inc. Soft tissue reconstructor and method of use
US6432710B1 (en) 1998-05-22 2002-08-13 Isolagen Technologies, Inc. Compositions for regenerating tissue that has deteriorated, and methods for using such compositions
FR2783429B1 (fr) * 1998-09-18 2002-04-12 Imedex Biomateriaux Materiau collagenique bicomposite,son procede d'obtention et ses applications therapeutiques
US6699287B2 (en) 1998-09-24 2004-03-02 Korea Atomic Energy Research Institute Dermal scaffold using alkaline pre-treated chitosan matrix or alkaline pre-treated chitosan and alkaline pre-treated collagen mixed matrix
US6124522A (en) 1998-11-24 2000-09-26 Schroeder; Mark R. Packaging for adhesive-sided articles to allow one-handed application
PL196803B1 (pl) 1998-11-25 2008-02-29 Coloplast As Produkt warstwowy w opakowaniu do bezdotykowego nakładania i sposób wytwarzania produktu warstwowego w opakowaniu do bezdotykowego nakładania
RU2195889C2 (ru) 1999-05-24 2003-01-10 Парамонов Борис Алексеевич Способ дермабразии
US6733530B1 (en) 1999-08-02 2004-05-11 Eric Sun-Yin Chan Material and method for engraftment of a composite biocompatible skin graft on the neodermis of artificial skin
US6699470B1 (en) 1999-10-12 2004-03-02 Massachusetts Institute Of Technology Mesh-gel constructs for cell delivery containing enzymes and/or enzyme inhibitors to control gel degradation
BR0015367A (pt) 1999-11-05 2002-07-23 Gerigene Medical Corp Aumento e reparo de defeitos nos tecidos moles relacionados com a idade
DE10041468C1 (de) 2000-08-23 2002-03-07 Surface Care Gmbh Hautmatrix zur Abdeckung und Regenerierung verletzter Hautpartien sowie Verfahren zu ihrer Herstellung
US7144729B2 (en) 2000-09-01 2006-12-05 Dfb Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for tissue regeneration
ES2173812B1 (es) 2001-03-01 2003-12-16 Ct Investig Energeticas Ciemat Dermis artificial y metodo de obtencion.
GB0105899D0 (en) 2001-03-09 2001-04-25 Intercytex Ltd Fibrosis reduction treatment
DE10116362A1 (de) 2001-04-02 2002-10-10 Biotissue Technologies Ag Zwei-Komponenten Zusammensetzungen zur in situ Herstellung v. Fibroblasten und Keratinozyten umfassenden Zelltransplantaten
US20030069639A1 (en) 2001-04-14 2003-04-10 Tom Sander Methods and compositions for repair or replacement of joints and soft tissues
US20030166274A1 (en) * 2001-11-15 2003-09-04 Hewitt Charles W. Three-dimensional matrix for producing living tissue equivalents
EP1490477A4 (en) 2002-04-02 2006-08-30 Univ Rice William M RETURN DIFFERENTIATED CELLS FOR THE REPAIR OF CARTILAGE DEFECTS
DE10217779A1 (de) 2002-04-18 2003-11-13 Co Don Ag Konservierte Gewebematrix eines Hohlorganes, insbesondere eines Blutgefäßes, Verfahren zur Herstellung und Verwendung dieser
US20040082063A1 (en) 2002-10-18 2004-04-29 Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. Tissue-like organization of cells and macroscopic tissue-like constructs, generated by macromass culture of cells, and the method of macromass culture
US8741352B2 (en) * 2003-08-25 2014-06-03 Cook Biotech Incorporated Graft materials containing ECM components, and methods for their manufacture
RU2273457C2 (ru) 2004-06-01 2006-04-10 Сергей Степанович Кузнецов Способ лечения грыж передней брюшной стенки

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