CN109847098A - 一种用于修复骨缺损的复合生物支架材料 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于修复骨缺损的复合生物支架材料，属于骨组织工程技术领域。本发明通过将重组TG2腺病毒转染到具有多向分化能力的EMSCs中，在体外评估了TG2‑EMSCs对纤维蛋白支架成骨的影响，并将含TG2‑EMSCs的生物活性支架植入颅骨缺损的SD大鼠中，检测其修复骨缺损的能力。结果表明，用含TG2‑EMSCs的纤维蛋白支架移植治疗颅骨缺损，受损区域在两周内显示55％的愈合，而含天然EMSCs的纤维蛋白支架在相同时间点显示17％的愈合。且这种生物支架生物相容性高、稳定、成本低且操作简便。因此，含TG2‑EMSCs的纤维蛋白支架对于修复骨缺损具有重要的临床应用价值。

Description

一种用于修复骨缺损的复合生物支架材料

技术领域

本发明涉及一种用于修复骨缺损的复合生物支架材料，属于骨组织工程技术领域。

背景技术

整形外科中大骨缺损的修复是整形外科医生常面临的重大问题。骨缺损的常见原因包括急性骨损伤、良性肿瘤、恶性肿瘤、骨感染和骨不连。骨缺损的常用治疗方法是自体骨移植，即在患者机体上采集新鲜骨组织进行自体移植。然而，这种治疗通常需要两次手术，这不仅增加了感染的可能性，而且还可能导致骨畸形、疼痛甚至功能性问题。自体骨移植的缺点使其不能成为最佳的骨缺损修复方法。目前，使用有效的基因工程和组织工程技术联合自体干细胞移植是一种新兴的骨损伤治疗方法。

成骨细胞负责产生骨基质并促进类骨质矿化，在骨修复和重建过程中发挥重要作用。鉴于成骨细胞在骨修复中的关键作用，植入可直接分化为成骨细胞的干细胞将是一种有临床应用前景的骨缺损治疗方法。已有报道显示骨髓含有具有成骨潜能的间充质干细胞(BMSC)，然而，骨髓中能获取的BMSCs不足以修复骨缺损。此外，BMSCs采集过程对供体来说是痛苦的且易导致骨髓感染。因此，骨科研究人员仍在努力寻找理想的自体干细胞来修复骨缺损。

已有研究报道，下鼻甲的呼吸道粘膜含有神经嵴迁移分化的鼻粘膜骨髓间充质干细胞(EMSCs)，该细胞具有多向分化潜能，可以分化为外胚层和中胚层谱系细胞(TG2基因修饰的鼻粘膜间充质干细胞向神经样细胞分化的研究[J].神经解剖学杂志,2018(3))。而且，鼻粘膜EMSCs可以从成人下鼻甲的呼吸道粘膜中轻易收获，损伤很小，对嗅觉无损伤。研究表明，当EMSCs接种在纤维蛋白凝胶上时，可以诱导EMSCs在更大程度上分化成成骨细胞。因此，EMSCs可以用作新型种子细胞，纤维蛋白凝胶可以作为其生长和分化的支架(张雪松,李正南,荆丹峰,et al.外胚层间充质源神经干细胞-纤维蛋白支架复合体移植修复大鼠脊髓损伤[J].解剖学杂志,2016,39(2):207-210)。装载EMSCs的支架可以移植修复骨损伤。然而，体内天然纤维蛋白凝胶的快速降解对于使用纤维蛋白凝胶作为修复大骨缺损的支架是不利的。因此，构建具有长期稳定性和生物活性的并可装载细胞的纤维蛋白支架，对于干细胞/组织工程支架移植修复严重骨缺损具有重要的应用价值。

转谷氨酰胺酶2(TG2)是转谷氨酰胺酶家族的成员，其发挥蛋白质之间的转酰胺和交联功能。大多数细胞的TG2存在于细胞质中，一些也存在于线粒体和细胞核中，而一些TG2(1-20％)位于细胞外，包括质膜和细胞外基质(ECM)。TG2还具有重要的酶和非酶功能。TG2可以交联各种细胞外基质蛋白，例如纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白和骨桥蛋白以及一些可溶性生长因子，例如BMP-2和PDGF。此外，TG2通过与整联蛋白和生长因子受体的非共价相互作用来调节ECM和可溶性生长因子之间的相互作用。已有研究表明TG2表达与软骨细胞分化也有关，并且TG2敲除小鼠的软骨细胞培养物形成低水平的基质钙化。相反，随着外源性TG2的加入，软骨细胞肥大和矿化增加。Kaartinen等人在体外鉴定了膜内骨和成骨细胞样骨细胞中高活性的TG2酶。此外，许多报道已经证明TG2参与骨细胞粘附和ECM钙化。Johnson等人报道TG2在TG2基因修饰的软骨细胞和半月板细胞培养物中促进了体外矿化。然而，没有研究报道过TG2在EMSCs分化为成骨细胞和TG2基因修饰的EMSCs移植修复骨损伤中的作用。

目前，骨组织工程支架材料包括有机聚合物材料、陶瓷材料、金属材料等。有机聚合物骨组织支架材料中，用左旋聚乳酸、聚羟基乙酸等可降解吸收性高分子材料加工而成的纤维状支架材料和海绵状支架材料在软骨组织工程中已获得广泛应用。但这类支架材料弹性模量低、成本高、受力时易变形、容易导致种子细胞损伤且降解吸收时间过长。由于这些支架材料表面不含有细胞黏附分子的识别分子，如RGD序列，所以与细胞的生物相容性比较差。例如，聚乳酸作为骨组织工程支架材料，具有降解速率过快、亲水性差、降解产物呈酸性、缓慢降解后易出现并发症等缺点。生物陶瓷材料虽然有生物可降解性、可促进干细胞向成骨细胞分化，但种子细胞在支架内难以迁移和增殖，此外，陶瓷本身的脆性亦限制了其在临床中的应用。其他骨组织工程支架材料或多或少都存在着细胞相容性差、诱导成骨细胞分化的能力差、体内降解不可控、降解产物有副作用以及制作成本高等缺点。

因此，提供一种生物相容性高、体内降解时间适合、诱导成骨细胞分化能力强，促进骨组织再生的效果肯定、制作成本低且操作简便的装载干细胞的骨组织工程复合支架，对于临床上严重骨缺损的治疗具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于修复骨缺损的复合生物支架，以表达谷氨酰胺转氨酶2(TG2)的EMSCs(鼻粘膜骨髓间充质干细胞)为种子细胞，以纤维蛋白凝胶为支架载体。

在本发明的一种实施方式中，所述骨缺损包括颅骨缺损、躯干骨缺损或四肢骨缺损。

在本发明的一种实施方式中，种子细胞初始密度为10^5-10⁸个/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述EMSCs是以pShuttle-IRES-hrGFP2为载体，表达TG2。

在本发明的一种实施方式中，所述TG2的氨基酸序列如NCBI：NP_803473.1所示。

在本发明的一种实施方式中，纤维蛋白凝胶由溶液A和溶液B混合后凝固制成，溶液A为溶解在PBS中50-100mg/mL大鼠纤维蛋白原溶液，溶液B中每毫升PBS含有10-20U大鼠凝血酶。

在本发明的一种实施方式中，溶液A和溶液B的体积比为(1:2)-(2:1)。

进一步地，溶液A和溶液B的体积比为1:1。

本发明的第二个目的是提供一种上述的复合生物支架的制备方法，其特征在于，将权利要求4中所述的溶液A和溶液B按(1:2)-(2:1)的体积比混合，得到的纤维蛋白原-凝血酶混合物加到高通量细胞培养板上，孵育表达TG2的EMSCs细胞；用胰蛋白酶消化上述孵育后的细胞，离心沉淀，收集细胞作为种子细胞；将种子细胞接种到上述培养板内的纤维蛋白支架上

在本发明的一种实施方式中，孵育细胞的条件为：35-38℃，30-40min。

本发明的第三个目的是提供上述的复合生物支架在制备医疗器械领域内的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过将谷氨酰胺转氨酶2(TG2)基因重组的腺病毒转染到具有多向分化能力的EMSCs(鼻粘膜骨髓间充质干细胞)中，得到TG2-EMSCs细胞，该细胞可以分泌高水平的TG2。将TG2-EMSCs种植于纤维蛋白支架，支架内细胞分泌的TG2使细胞产生的生长因子与ECM蛋白分子(骨基质)以及支架材料纤维蛋白分子交联，使该复合支架具备生物学活性和三维结构的稳定性。

本发明制作了一种TG2-EMSCs/纤维蛋白组织工程支架，并在体外观察了TG2-EMSCs在纤维蛋白支架上的成骨作用。在此基础上，将TG2-EMSCs/纤维蛋白组织工程支架植入颅骨缺损的SD大鼠中，评估其修复骨缺损的能力。结果表明，TG2-EMSCs可以过表达TG2，并可在纤维蛋白支架上向成骨细胞分化；TG2还可以促进骨基质沉积到支架中；用含TG2-EMSCs的纤维蛋白支架移植治疗颅骨缺损，在两周内可使骨缺损愈合55％，而用含未转基因的EMSCs/纤维蛋白支架移植治疗的颅骨缺损在相同时间点显示为骨缺损愈合17％。相反，用没有细胞的纤维蛋白支架处理的大多数颅骨缺损显示骨缺损无明显愈合(小于10％)。由于这种组织工程支架的生物相容性高、三维结构稳定、制作成本低，修复骨缺损的治疗效果明显，且操作过程简便易行。因此，本发明的TG2-EMSCs/纤维蛋白组织工程支架对于临床上修复骨缺损具有重要的应用价值。

附图说明

图1：第0、3和5代的EMSCs形态以及干细胞标记物(波形蛋白、s100和巢蛋白)在EMSCs中的表达情况，标尺为50μm。

图2：干细胞标记物(波形蛋白、s100和巢蛋白)在TG2-EMSCs中的表达情况，标尺为25μm。

图3：BMP-2和细胞外基质标记物(包括LN，FN和COL I)在EMSCs中的表达情况，COLI＝胶原蛋白I；LN＝层粘连蛋白；FN＝纤连蛋白；BMP-2＝骨形态发生蛋白-2，标尺为50μm。

图4：BMP-2和细胞外基质标记物(包括LN，FN和COL I)在TG2-EMSCs中的表达情况，COL I＝胶原蛋白I；LN＝层粘连蛋白；FN＝纤连蛋白；BMP-2＝骨形态发生蛋白-2，标尺为25μm。

图5：Western-blot分析纤维蛋白支架上的TG2-EMSCs中的COL I，LN，FN，BMP-2和TG2的表达水平。

图6：定量分析分析纤维蛋白支架上的TG2-EMSCs中的COL I，LN，FN，BMP-2和TG2的表达水平，*P<0.05；**P<0.01。

图7：TG2-EMSCs/纤维蛋白支架上的表面结构的扫描电镜图像及TG2-EMSCs在支架上表达TG2蛋白的免疫荧光染色结果，标尺为25μm。

图8：TG2-EMSCs、GFP-EMSCs和EMSCs在纤维蛋白支架表面上生长的增殖情况，A：柱状图；B：折线图，*P<0.05；**P<0.01。

图9：Western-blot和定量分析纤维蛋白支架上的TG2-EMSCs中的OPN，OCN，COL和BMP-2和TG2的表达水平，A：Western-blot的目的蛋白条带；B：定量分析，*P<0.05；**P<0.01。

图10：含TG2-EMSCs的纤维蛋白支架的成骨能力分析，A：TG2-EMSCs、GFP-EMSCs和EMSCs在上纤维蛋白支架形成的矿化结节染色；B：碱性磷酸酶活性的NBT染色结果；C：NBT染色区域的百分比；D：矿化结节被染色区域的百分比，标尺为25μm，**P<0.01。

图11：半胱氨酸蛋白酶抑制剂对TG2活性的抑制作用，A：Western-blot的目的蛋白条带；B：定量分析，*P<0.05；**P<0.01。

图12：半胱氨酸蛋白酶抑制剂对TG2活性的抑制作用，A：TG2-EMSCs、GFP-EMSCs和EMSCs在上纤维蛋白支架形成的矿化结节染色；B：碱性磷酸酶活性的NBT染色结果；C：NBT染色区域的百分比；D：矿化结节被染色区域的百分比，标尺为25μm，**P<0.01。

图13：支架植入两周后，大鼠颅顶的俯视图，显示缺损的愈合情况(组1＝A，组2＝B，和组3＝C)。

图14：第1、2和3组颅骨缺损区域的矢状面切片的H-E染色，标尺为200μm(组1＝A，组2＝B，组3＝C)。

图15：骨形成区域内的TG2和OCN表达的连续冠状面免疫定位(组1＝A，组2＝B，和组3＝C)，标尺为200μm。

图16：通过COL I的免疫组织化学染色情况评估颅盖骨缺损修复情况(组1＝A，组2＝B，组3＝C)，标尺为200μm。

图17：通过OCN的免疫组织化学染色情况评估颅盖骨缺损修复情况(组1＝A，组2＝B，和组3＝C)，标尺为200μm。

具体实施方式

(一)材料

波形蛋白、s100和巢蛋白一抗购于Santa Cruz(California，USA)。

胶原蛋白-I(COL I)、骨钙蛋白、骨桥蛋白、层粘连蛋白(CN)、BMP-2和纤连蛋白(FN)抗体购自Abcam(Cambridge，UK)。

β-微管蛋白抗体、ECL试剂盒和Western-blot相关的第二抗体购于Boster(湖北武汉)。

地塞米松、胱胺、L-抗坏血酸2-磷酸、β-甘油磷酸、1,25-二羟基维生素D3、抗坏血酸、茜素红S、大鼠纤维蛋白原、凝血酶和免疫荧光相关的第二抗体购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。

DAPI、MTT购于Solarbio(北京)。

脂质体2000购于Invitrogen(CA，USA)。

293A细胞购于ATCC(CA，USA)。

PVDF膜购于Millipore(Temecula，CA，USA)。

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(体重：200g)从江苏省实验动物中心获得。雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠(体重：120g)由江苏大学动物中心提供，动物实验方案经江苏大学批准(方案号2016-08-07)。

(二)培养基

FBS培养基(普通完全培养基)：DMEM/F12培养基加10％胎牛血清。

成骨培养基：15％FBS，0.1nM地塞米松，10mMβ-甘油磷酸盐，0.01μM 1,25-二羟基维生素D3和α-MEM中的50μM抗坏血酸

(三)溶解纤维蛋白支架的方法

将50FU/mL纳豆激酶(Wake Pure Chemical industries，Ltd.Wako，Japan)溶解在含有1mM EDTA的PBS中来制备纤维蛋白溶解溶液。首先，用PBS洗涤含有细胞的纤维蛋白支架，然后，通过加入250μL纳豆激酶溶液并在37℃温育，溶解这些纤维蛋白支架。溶解后，收集每个孔里的样品并离心。然后，向样品中加入含有苯甲基磺酰氟，磷酸酶抑制剂混合物和EDTA的等体积RIPA缓冲液。利用western-blot分析纤维蛋白支架中提取的蛋白质的表达情况。

实施例1 EMSCs的培养和鉴定

用10％水合氯醛深度麻醉SD大鼠(50-100g，雌雄不限)，无菌条件下沿鼻腔向上至内眦部剪开皮肤，暴露鼻中隔下份和下鼻甲黏膜，取出鼻中隔置于PBS缓冲液中，剥离全层鼻黏膜。鼻黏膜取出后在4℃下用FBS培养基漂洗三次后充分剪碎，置于37℃培养箱中用胰酶消化15min，1000r/min离心弃上清后将碎组织块接种于含有充足10％FBS DMEM/F12的密闭培养瓶，置于细胞培养箱中培养。待大部分组织块贴壁后，吸出培养基并补充新的培养基。每3d换液一次，当细胞铺满瓶底80％时进行传代。将第三代细胞接种于1块48孔培养板。分别用干细胞标志波形蛋白、巢蛋白和S100抗体进行免疫荧光染色，鉴定细胞的干细胞特性。具体操作如下:细胞经含4％多聚甲醛的磷酸缓冲液固定后，分别于0.1％Triton X-100和3％牛血清白蛋白(BSA)液中封闭30min，以兔抗波形蛋白、巢蛋白和S100抗体(均为1∶300)于4℃孵育过夜，PBS漂洗三遍后用羊抗兔IgG-Cy3(1：200)37℃孵育1h，PBS漂洗3遍，Hochest/33342复染细胞核，PBS漂洗三遍，甘油封片，于Leica荧光显微镜下观察并摄片。

如图1所示，贴壁EMSCs从鼻粘膜迁移并在体外容易扩增，并且第3代细胞逐渐表现出成纤维细胞样形态。

实施例2 TG2基因重组腺病毒转染EMSCs及其TG2表达水平的测定

设计以下引物以合成TG2(NCBI:NP_803473.1)基因：TG2-f，CTAGCTAGCGCCACCATGGCCGAGGAGCTGAACCT和TG2-r，GGAATTCTTAGGCCGGGCCGATGATGA。重组大鼠TG2(rTG2)腺病毒穿梭质粒由南京Genscript生物工程技术服务有限公司(中国南京)构建，并通过测序确认。

将TG2基因插入pShuttle-IRES-hrGFP2载体以制备穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP2-TG2，并将pShuttle-IRES-hrGFP2载体设置为对照组。将293A细胞(2×10⁶个细胞/孔)接种在添加了10％FBS的DMEM培养基中的6cm²培养皿中，并在37℃，5％CO₂下孵育过夜。在转染前更换培养基。使用脂质体2000将pacAd5-9.2-100和pShuttle-IRES-hrGFP2-TG2穿梭质粒以80-90％融合转染细胞。转染12天后，得到含有TG2(Ad-TG2-GFP)基因的重组腺病毒。所有重组腺病毒在293A细胞中扩增，并使用双氯化铯密度梯度超速离心进行纯化。用噬菌斑测定法测定293A细胞上腺病毒原液的滴度。分别用Ad-TG2-GFP和Ad-GFP腺病毒转染第3代的EMSCs(2×10⁵)，得到TG2-GFP-EMSCs(TG2-EMSCs)和GFP-EMSCs(GFP-EMSCs)，并在荧光显微镜下检测TG2-GFP和GFP的表达情况。

如图2所示，大多数EMSCs和TG2-EMSCs表达神经嵴细胞和间充质细胞标记物，包括巢蛋白、s100和波形蛋白。如图3和图4所示，在EMSCs和TG2-EMSCs中均检测到BMP-2，COL I，LN和FN的表达。

通过Western-blot检测TG2蛋白，用含有苯甲基磺酰氟，磷酸酶抑制剂混合物和乙二胺四乙酸(EDTA)的RIPA缓冲液裂解细胞。将等量的每种蛋白质样品进行SDS-PAGE，然后转移至PVDF膜。用3％脱脂奶粉封闭后，将膜与一抗在4℃温育12小时。然后，用TBST洗涤膜，将膜与HPR偶联的二抗在37℃下温育1小时。用TBST洗涤后，使用ECL试剂盒进行免疫印迹分析。每个实验重复至少三次以进行统计分析。

如图5所示，TG2-EMSCs过表达TG2。如图6所示，TG2-EMSCs中BMP-2，COL I，LN和FN的表达水平显著高于EMSCs中的，TG2-EMSCs中TG2的表达量比GFP-EMSCs和EMSCs高9倍左右。

实施例3纤维蛋白支架的制备和细胞接种

纤维蛋白支架由溶液A和溶液B混合后凝固制成。溶液A为溶解在PBS中的100mg/mL大鼠纤维蛋白原溶液，溶液B含有溶于5mL PBS中的100U大鼠凝血酶。以1：1体积比混合溶液A和溶液B来制备纤维蛋白支架，使纤维蛋白原终浓度为50mg/mL。将混合得到的纤维蛋白原-凝血酶混合物立即均匀地滴加到96孔、48孔或6孔细胞培养板上，然后将细胞培养板在37℃下孵育30分钟。用胰蛋白酶消化上述培养好的TG2-EMSCs和EMSCs，离心沉淀，收集细胞作为种子细胞。然后将种子细胞接种到上述培养板内的纤维蛋白支架上，并加入适当普通完全培养基培养。细胞-支架经4％多聚甲醛的磷酸缓冲液(PB)固定后用于免疫荧光染色。用2％戊二醛磷酸盐缓冲液的固定后，用于扫描电子显微镜(SEM)观察在TG2-EMSCs/纤维蛋白支架的立体结构。结果表明TG2-EMSCs在纤维蛋白支架上生长良好，支架形成网状结构，支架上细胞表达TG2蛋白(如图7所示)。

实施例4 MTT法分析TG2-EMSCs在成骨培养基和正常培养基的增殖情况

先将TG2-EMSCs接种在铺有纤维蛋白支架的96培养板的微孔中，密度为1×10⁴个细胞/孔，分别用普通完全培养基和成骨诱导培养基培养8小时。EMSCs和GFP-EMSCs用作对照。然后，向每个孔中加入3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物，即MTT(20μL5mg/mL)，并将微孔板在37℃下进一步温育。孵育4小时后，向每个孔中加入200μL DMSO。用酶标仪在490nm的波长下读取吸光度。TG2-EMSCs在正常培养基中的增殖率显著高于GFP-EMSCs和EMSCs(P<0.05)(如图8所示)。然而，在成骨诱导培养基中，TG2-EMSCs和GFP-EMSCs之间的增殖速率没有显著差异。

实施例5接种于纤维蛋白支架上的TG2-EMSCs的成骨分化测定

分别将TG2-EMSCs和EMSCs接种在涂有纤维蛋白支架的48孔或6孔板上。通过在成骨诱导培养基(15％FBS，0.1nM地塞米松，10mMβ-甘油磷酸盐，0.01μM 1,25-二羟基维生素D3和α-MEM中的50μM抗坏血酸)中培养细胞14天来诱导成骨分化。Western-blot分析结果显示，与对照相比，成骨调节蛋白OCN，OPN，BMP-2和COL I在TG2-EMSCs中表达量更高(如图9A和9B)。这表明TG2-EMSCs比EMSCs具有更强的成骨分化能力。

用茜素红S对细胞/支架进行染色以观察支架上的矿化结节。结果表明，TG2-EMSCs/支架中的钙沉积在相同阶段明显多于EMSCs支架中(图10A)。与此同时，用NBT染色法检测/支架上细胞内的碱性磷酸酶(ALP)的活性。结果显示当在成骨诱导培养基中培养时，TG2-EMSC显示出比GFP-EMSC和EMSC更强的碱性磷酸酶活性(图10B)。经过统计分析，证明TG2-EMSCs中的矿化结节较大，这与ALP测定结果一致(图10C和10D)。这些结果表明TG2-EMSCs细胞有明显的向成骨细胞分化的趋势，即TG2-EMSCs表现出更强的成骨分化能力。

为了明确TG2在EMSCs成骨分化中的作用，进行了TG2活性抑制实验：用半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CYS)抑制细胞分化过程中的TG2活性。抑制剂处理后，OCN，COL I，OPN和BMP-2的表达量明显降低，OCN降低了80％，COL I降低了67％，OPN降低了18％、BMP-2降低了77％，如图11A和11B所示。此外，与TG2-EMSCs中相比，抑制剂处理后形成的矿化结节(图12A)和ALP活性(图12B)的显著降低。结果表明，抑制剂处理后，ALP染色区域占比从77％下降到了17％，矿化结节染色区域占比从15％下降到了6％(图12C和12D)。

实施例6移植TG2-EMSCs负载的纤维蛋白支架用于修复颅骨损伤

预先构建装载TG2-EMSCs的纤维蛋白支架。将细胞接种在涂有纤维蛋白凝胶的6孔板上。细胞接种后两天，翻转整个膜状纤维蛋白凝胶，并将细胞重新接种在纤维蛋白膜的另一个表面上用普通完全培养基培养两天后备用。用腹腔内注射苯巴比妥钠麻醉SD大鼠(200g)，并使用牙科钻头在颅骨上产生直径为4mm的圆形颅骨缺损。将载有细胞的纤维蛋白支架移植到颅骨缺损区域并完全填补缺损。在支架与颅骨的交界处滴加适量的支架材料的A液和B液，使支架与创面形成无缝连接。

将大鼠分成以下三组，每组10只动物：第1组，仅移植不含细胞的纤维蛋白支架；第2组，移植未转基因EMSCs装载的纤维蛋白支架；第3组，移植TG2-EMSCs装载的纤维蛋白支架。两周后，通过深度麻醉处死大鼠，取出颅骨标本用4％多聚甲醛4℃固定过夜。测量颅骨缺损区域的直径，计算缺损愈合百分比(新骨填充的缺陷面积除以原始缺损面积)。然后，将样品浸置在10％乙二胺四乙酸二钠(EDTA)磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中脱钙7天。经过梯度乙醇溶液脱水、二甲苯透明后，将组织包埋在石蜡中。用组织切片机进行连续切片(片厚5μm，包含缺损)。对组织切片进行苏木精和伊红(H&E)染色。同时用针对OCN、COL I和TG2的抗体对切片进行免疫组织化学染色。

免疫组织化学染色结果显示，TG2-EMSCs/纤维蛋白支架移植治疗组，在原缺损的修复部位有大量的新骨形成，新骨组织内有OCN和COL I免疫组织化学染色阳性产物。观察结果表明，用装载TG2-EMSCs的纤维蛋白支架移植治疗颅骨缺损，在两周内可使骨缺损愈合55％，而用装载未转基因的EMSCs/纤维蛋白支架移植治疗的颅骨缺损在相同时间点显示为骨缺损愈合17％。相反，第1组中的大多数颅骨缺损(用没有细胞的纤维蛋白支架处理)显示骨缺损无明显愈合(小于10％)，缺损区仅见少量薄层软组织(图13)。通过损伤区直径的组织切片的H&E)染色结果与大体标本观测测量的结果相一致(图14)。TG2和OCN免疫组织化学染色(连续冠状面相邻切片)结果显示，骨形成区域内的TG2和OCN共定位于缺损修复区内的细胞(图15)，提示移植纤维蛋白支内TG2-EMSCs可分化为成骨细胞。COL I(图16)和OCN(图17)的免疫组织化学染色结果亦显示TG2-EMSCs/纤维蛋白支架移植组的COL I和OCN的免疫组织化学染色强度高与其他两组。由此提示植纤维蛋白支内TG2-EMSCs可产生骨基质蛋白COL I和OCN，促进骨再生。

对比例

以聚乳酸为种子细胞生长的支架，构建TG2-EMSCs/聚乳酸复合支架材料，其余条件同实施例1-6，结果表明，用装载TG2-EMSCs的聚乳酸支架移植治疗颅骨缺损，在两周内仅可使骨缺损愈合19％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种用于修复骨缺损的复合生物支架，其特征在于，以表达TG2的EMSCs为种子细胞，以纤维蛋白凝胶为支架载体。

2.如权利要求1所述的复合生物支架，其特征在于，所述骨缺损包括颅骨缺损、躯干骨缺损或四肢骨缺损。

3.如权利要求1所述的复合生物支架，其特征在于，种子细胞初始密度为10^5-10⁸个/mL。

4.如权利要求1所述的复合生物支架，其特征在于，所述EMSCs是以pShuttle-IRES-hrGFP2为载体，表达TG2。

5.如权利要求1或4所述的复合生物支架，其特征在于，所述TG2的氨基酸序列如NCBI：NP_803473.1所示。

6.如权利要求1所述的复合生物支架，其特征在于，纤维蛋白凝胶由溶液A和溶液B混合后凝固制成，溶液A为溶解在PBS中50-100mg/mL大鼠纤维蛋白原溶液，溶液B中每毫升PBS含有10-20U大鼠凝血酶。

7.如权利要求6所述的复合生物支架，其特征在于，溶液A和溶液B的体积比为(1:2)-(2:1)。

8.权利要求1-7任一所述的复合生物支架的制备方法，其特征在于，将权利要求4中所述的溶液A和溶液B按(1:2)-(2:1)的体积比混合，得到的纤维蛋白原-凝血酶混合物加到高通量细胞培养板上，孵育表达TG2的EMSCs细胞；用胰蛋白酶消化上述孵育后的细胞，离心沉淀，收集细胞作为种子细胞；将种子细胞接种到上述培养板内的纤维蛋白支架上。

9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，孵育细胞的条件为：35-38℃，30-40min。

10.权利要求1所述的复合生物支架在制备医疗器械领域内的应用。