CN110398588A - 一种成骨检测试剂盒及促进骨修复的植入物 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种成骨检测试剂盒及促进骨修复的植入物。其中成骨环境检测试剂盒包含检测TGF‑β1浓度的试剂，当此试剂盒用于检测病人的血清，骨折、骨不连局部的TGF‑β1浓度时，其判断基准为：TGF‑β1的浓度为小于500pg/mL时，则判断此环境利于成骨；大于500pg/mL时，则判断此环境不利于成骨。本发明还提供一种促进骨修复的植入物，包含TGF‑β1抑制物(如SB431542)。

Description

一种成骨检测试剂盒及促进骨修复的植入物
技术领域
本发明涉及一种成骨检测试剂盒及促进骨修复的植入物，属于医疗器械领域。
背景技术
美国每年发生约1600万例骨折，占全部肌肉骨骼损伤的16％。临床上骨折的延迟愈合和骨不连是骨科临床的难题，导致严重的发病和额外的外科手术治疗，医疗费用增加以及患者功能缺陷。许多生长因子和炎性细胞因子影响骨修复的过程。肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导间充质干细胞(MSCs)凋亡，干扰素γ(IFN-γ)可增强这种效应。TNF-α和IFN-γ的减少显著改善骨修复。白细胞介素(IL)-12和IL-23通过上调IFN-γ和IL-17间接阻碍骨修复。IL-17通过激活核因子κB(NF-κB)信号传导和增强IFN-γ诱导的细胞凋亡来抑制MSCs成骨作用。相反，由于成骨细胞骨形成的减少，IL-17-/-小鼠的骨折修复受到抑制。因此，细胞因子的表达水平也决定了骨组织愈合的结果。除了这些细胞因子外，许多重要的调节因素也参与了这个过程。
转化生长因子-β1(TGF-β1)是骨基质中最丰富的细胞因子之一，在骨重建中起着关键作用。在正常生理条件下，在骨吸收过程中释放的基质TGF-β1将MSCs募集至骨吸收部位。随后，MSCs响应于局部信号进行成骨分化。然而迄今为止，TGF-β1在成骨分化中的作用尚未完全阐明，TGF-β1在基于BMMSCs的骨修复中的特定功能仍不清楚。我们的研究发现一个非常有价值的现象，骨不连病人局部及血清中TGF-β1高表达，TGF-β1高表达是影响成骨的重要因素。我们进行了相应的治疗策略探讨。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成骨检测试剂盒及促进骨修复的植入物，以解决骨科临床中的骨折延迟愈合和骨不连的难题。
本发明采用了如下技术方案：
一种成骨环境检测试剂盒，其特征在于，包含检测TGF-β1浓度的试剂，当此试剂盒用于人的成骨能力检测时，检测病人血清，骨折或骨不连局部的TGF-β1浓度时，其判断基准为：TGF-β1的浓度为小于500pg/mL时，则判断此环境利于成骨；大于500pg/mL时，则判断此环境不利于成骨。
当此试剂盒用于检测小鼠或者裸鼠的异位成骨位置的TGF-β1浓度时，其比较基准为浓度为小于200pg/mL时，则判断此环境利于成骨；大于500pg/mL时，则判断此环境不利于成骨
当此试剂盒用于检测细胞培养环境中的TGF-β1浓度时，其比较基准为10ng/mL，当检测到的TGF-β1的浓度小于10ng/mL时，则判断此环境利于成骨，当检测到的TGF-β1的浓度大于10ng/mL时，则判断此环境不利于成骨；
进一步，本发明的成骨环境检测试剂盒，还具有这样的特征：其中，成骨环境为人(哺乳动物)血清，骨折或骨不连局部。
本发明的一种促进骨修复的植入物，其特征在于，包括：TGF-β1抑制物(如SB431542)。
进一步，本发明的促进骨修复的植入物，还具有这样的特征：TGF-β1抑制物(如SB431542)与缓释凝胶混合。
进一步，本发明的促进骨修复的植入物，还具有这样的特征，还包括：生物材料，所述TGF-β1抑制物(如SB431542)附在所述生物材料上。
进一步，本发明的促进骨修复的植入物，还具有这样的特征，其中，其中，所述TGF-β1抑制物(如SB431542)、缓释凝胶与所述生物材料交织分布。
进一步，本发明的促进骨修复的植入物，还具有这样的特征，还包括：细胞，附着在所述生物材料上。
进一步，本发明的促进骨修复的植入物，还具有这样的特征：其中，其中，所述生物材料采用临床所用的所有的骨修复生物材料(如β-TCP)制成。
发明的有益效果
本发明的成骨环境检测试剂盒，通过对人(哺乳动物)血清，骨折、骨不连局部、细胞培养环境中存在的TGF-β1浓度的检测，并且针对不同的应用场景，提供了判断的标准。
促进骨修复的植入物与TGF-β1抑制物(如SB431542)混合，促进成骨的效率，减少成骨不佳的情况。
附图说明
图1是将β-TCP和BMMSCs混合并皮下植入C57BL/6小鼠或裸鼠中的实验结果；
图2是BMMSC植入物中TGF-β1的浓度；
图3是种植体中免疫染色TGF-β1的结果；
图4是使用ELISA检测骨不连样本和正常样本中的TGF-β1表达；
图5是骨髓中TGF-β1水平与外周血中TGF-β1水平；
图6是不同剂量的TGF-β1对BMMSC增殖的影响；
图7是茜素红(alizarinred)染色的实验结果；
图8是茜素红(alizarinred)染色的结果的柱图；
图9是低浓度的TGF-β1对ALP和Osterix的影响；
图10是组织学分析的结果；
图11是颅骨缺损并加入TGF-β1后的microCT结果图；
图12是颅骨缺损并加入TGF-β1后的成骨面积；
图13是TGF-β1对ALP和OCN的表达水平的影响；
图14是TGF-β1对破骨细胞分化标志物组织蛋白酶K和抗酒石酸酸性磷酸酶的表达水平的影响；
图15是SB431542处理对局部TGF-β1水平的影响；
图16是SB431542处理对smad2/3的影响；
图17是SB431542处理后H&E染色的结果；
图18是SB431542在颅骨缺损模型中的修复作用；
图19是SB431542在颅骨缺损模型中的成骨面积；
图20是使用SB431542后的骨量和骨密度；
图21是颅骨骨骼切片的H&E染色结果。
具体实施方式
以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。
一、材料与方法
1，动物：
雄性C57BL/6J背景的小鼠和裸鼠。
2，细胞：
小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)
MC3T3-E1 subclone 14(ATCC CRL-2594)
4，材料：
β磷酸三钙陶瓷颗粒(β-tricalcium phosphate(β-TCP)ceramic particles)HyStem-HP Hydrogel(ESI BIO stem cell solutions,Alameda,CA,USA)
5，实验试剂：
TGF-β1细胞因子(Peprotech,Rocky Hill,New Jersey,USA)
TGF-β1抑制剂SB431542(Selleck Chemicals,Houston,TX,USA)
ProcartaPlexTM Multiplex Luminex Immunoassays(eBioscience,San Diego,CA,USA)
胎牛血清(FBS；Hyclone,Logan,UT,USA)
抗生素：盘尼西林和链霉素(all from Hyclone)
PrestoBlue细胞活性检测试剂(Life technologies,Gaithersburg,MD,USA)
地塞米松(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)
β磷酸甘油(Sigma-Aldrich)
抗坏血酸(Sigma-Aldrich)
Bmp2细胞因子(Peprotech)
氢氧化钠(Sinopharm Chemical Reagent Co.,Shanghai,China)
TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)
RevertAid反转录酶(EP0442；Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)
SYBR Premix Ex TaqTM(Takara,Dalian,China)
醋酸纤维素膜(Millipore,Darmstadt,Germany)
化学发光显影液(Millipore,Darmstadt,Germany)
pcDNA3.1(+)载体(Thermo Fisher Scientific)
Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)
EZChIP试剂盒(Millipore,Darmstadt,Germany)
pGL3载体(Promega,Madison,WI,USA)
QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis点突变试剂盒(AgilentTechnologies,CA,USA)
Luciferase荧光检测试剂盒(Promega)
嘌呤霉素(Sigma-Aldrich)
TGF-β1ELISA检测试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA).
6，实验仪器：
37℃二氧化碳培养箱(Thermo Fisher,USA)
细胞超净工作台(Thermo Fisher,USA)
pH计(METTLERTOLEDO 320,Switzerland)
电动吸引器(YB.DX.23D,上海)
电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏,中国)
恒温水浴锅(上海博讯医疗设备,中国)
细胞计数仪(Invitrogen,USA)
正置荧光显微镜(Zeiss,Germany)
台式水平离心机(Eppendorf5810R,Germany)
电子分析天平(METTLER TOLEDOAB204-E,Switzerland)
纯水器(Millipore,USA)
细胞冻存盒(Nalgene,USA)
-80℃超低温冰箱(Thermo Fisher,USA)
PCR仪(Bio-Rad，USA)
液氮罐(BCBS CRYOSYSTEMS,USA)
ViiA7实时荧光定量PCR仪(AppliedBiosystems,USA)
组织匀浆仪(PRO,USA)
PCR仪(Bio-Rad，USA)
天能全自动化学发光工作站(Tanon，上海)
台式水平离心机(Eppendorf5810R，Germany)
micro-CT检测仪(SCANCOμCT 100，Switzerland)
microarray检测系统(Aligent,USA)
7.后续实施方式中所涉及的实验方法：
7.1获取BMMSCs的方法
取8周大小的雄性C57BL/6小鼠用断颈法处死，放入75％酒精中浸泡消毒10分钟。在超净台中将小鼠后肢股骨及胫骨取下，剥离肌肉和软组织放入PBS中待用。用手术剪去除股骨和胫骨骨骺端，1ml注射器吸取培养基将骨髓从骨髓腔中冲出，反复几次直至冲洗干净。用注射器将细胞吹散至单细胞悬液，过70μm滤网去除结缔组织及未分散均匀的细胞团。将细胞悬液转移至50ml离心管中，300g离心10分钟，弃上清，加入红细胞裂解液处理细胞1分钟，加PBS终止反应，300g离心10分钟。弃上清，加入10ml DMEM完全培养基(含10％FBS，1％双抗)，吹打混匀，种到10cm培养皿中。在37℃、5％CO2培养箱中培养3天后换液除去未贴壁的细胞，以后每3天换液一次。当细胞生长达90％汇合时，去除培养基后用PBS清洗一次，再用0.25％Trypsin-EDTA消1分钟，用完全培养基终止反应。将细胞吹下，1000g离心5分钟收取细胞，按1:2的比例传代，成为第一代细胞(P1)。传至P4代后，大部分细胞冻存，留少量细胞进行实验。
细胞冻存：用PBS清洗细胞，加入胰酶消化细胞1分钟，离心后用冻存液重悬细胞，调整细胞浓度为2×106/ml，加入冻存管中。将冻存管放入冻存盒中，-80℃冰箱过夜后转移至液氮罐中保存。
7.2植入物细胞因子检测
异位成骨植入体在不同时间点取出并检测。用200μL细胞裂解液磨碎，离心12,000g 10分钟.随后收集上清存放在-80℃。植入体中的不同细胞因子检测用ProcartaPlexTMMultiplex Luminex Immunoassays。植入体和血清中的TGF-β1浓度检测用ELISA试剂盒。
7.3成骨分化实验
成骨诱导液配方：10％胎牛血清(FBS),100U/mL盘尼西林(penicillin),100μg/mL链霉素(streptomycin),100nM地塞米松(dexamethasone),50μM抗坏血酸(ascorbicacid),10mMβ磷酸甘油(β-glycerophosphate)配置在DMEM中。BMMSCs和MC3T3-E1细胞在成骨诱导液中培养，加入不同浓度的TGF-β1和Bmp2刺激，每3天换液一次。用茜素红染料染色，并用0.1N氢氧化钠溶解钙沉淀后定量分析。
7.4 microCT
颅骨样本(每组5只)用4％多聚甲醛固定。用Scanco Medical CT-40仪器进行micro CT扫描分析。
7.5免疫组织化学
植入物和颅骨用4％多聚甲醛固定24小时，用12.5％EDTA脱钙液进行脱钙。随后，包埋切片进行H&E染色。免疫组织化学染色根据说明书进行，抗体用TGF-β1,Bmp2,p-smad2,and p-smad3，Tmeff1 and OCN。
7.6免疫荧光染色
细胞用4％多聚甲醛固定15分钟。用0.1％Triton X-100通透15分钟，用5％羊血清封闭1小时，随后加入一抗：anti-Smad3(1:100),anti-Tmeff1(1:100),and anti-Bmp2(1:200)4℃过夜。二抗(1:500)室温孵育1小时。DAPI染核(1:10,000)。
7.7双荧光报告检测实验
将Bmp2基因转录起始位点上游2,000bp到下游500bp总共2500bp作为Bmp2的启动子序列，构建在pGL3载体上。启动子序列的PCR引物：正向5′-CCGGGTACCAAGTCTCTGTATTTGTTTC-3′，反向5′-TTTAAGCTTAACCGGGTGACCTCGC-3′。用QuikChange Lightning Site-DirectedMutagenesis Kit定点突变smad3结合位点碱基。BMMSCs在成骨诱导液中培养48小时后，共转染pGL3载体和luciferase报告载体。随后用50ng/mL TGF-β1刺激并继续成骨诱导，24小时后用Luciferase检测试剂盒检测其荧光活性。
<实施例一>TGF-β1对骨修复的剂量效应
将β-TCP和BMMSCs混合并皮下植入C57BL/6小鼠或裸鼠中。实验结果显示：如图1所示，在裸鼠中形成新骨，但在C57BL/6小鼠中未形成新骨。然后评估C57BL/6小鼠中TGF-β1的浓度。如图2所示，BMMSC植入后7-21天，BMMSC植入物中TGF-β1的浓度在C57BL/6小鼠中显著升高，但在裸鼠中不显著，见图2。
在种植体中免疫染色TGF-β1以进一步证实C57BL/6小鼠中高TGF-β1的表达，结果如图3所示。C57BL/6小鼠的植入物中TGF-β1表达水平高，导致体内新骨形成失败。此外，在六种正常骨折样本和六种骨不连样本的ELISA中，TGF-β1表达在骨不连样本中特异性高表达，但在正常对照样本中低表达，见图4。骨髓中TGF-β1水平与外周血中TGF-β1水平之间存在正相关关系，如图5所示。总之，TGF-β1水平可以作为骨修复的指标，而外周血TGF-β1水平可用于预测骨修复的结果。
TGF-β1对体外MSCs成骨的双重作用
如图6所示，不同剂量的TGF-β1可有效促进BMMSC增殖。然而，用不同剂量的TGF-β1(1-50ng/mL)进行的体外治疗显示出对BMMSC成骨的逆转作用。如图7、图8和图9所示，低浓度的TGF-β1(1ng/mL)促进BMMSCs的成骨分化，并上调碱性磷酸酶(ALP)和Osterix表达。如图7和图8所示，茜素红(alizarin red)染色显示高TGF-β1浓度：10-50ng/mL的处理以剂量依赖性方式显著抑制骨生成。在高TGF-β1浓度下，特别是在50ng/mL时，分化标志物的表达水平也降低。总之，TGF-β1在BMMSC分化中起双重作用。适量的TGF-β1促进BMMSCs的成骨分化和矿化。相反，过量的TGF-β1在体外抑制BMMSCs的成骨。
过量的TGF-β1会削弱体内的骨修复
如上文所描述，高TGF-β1浓度显著抑制体外BMMSC分化。为了证实过量的TGF-β1同样会导致体内骨修复失败，使用水凝胶HyStem-HP在裸鼠的植入物周围释放TGF-β1并检测异位骨的形成。
为了阐明TGF-β1在体内骨形成中的作用，使用250μL含有100ng，500ng，1μg或2μgTGFβ的HyStem-HP水凝胶(ESI BIO干细胞溶液，Alameda，CA，USA)-β1(Peprotech，RockyHill，New Jersey，USA)缓慢释放TGF-β1。水凝胶覆盖在小鼠植入物的表面上。植入后8周收获植入物。
进一步，为了确定TGF-β1抑制剂对体内骨形成的作用，将8周龄C57BL/6小鼠以2μg每周两次腹膜内注射TGF-β1抑制剂SB431542(Selleck Chemicals，Houston，TX，USA)每只小鼠一次或车辆对照8周。
如图10所示，组织学分析显示低TGF-β1剂量组：100和500ng组，促进骨形成，而高TGF-β1剂量组：1和2μg组，损害骨修复。免疫组织化学分析证实，在具有合适的TGF-β1的植入物中检测到骨钙素(OCN)阳性细胞水平的增加。然而，如图11所示，过多的TGF-β1显著降低了植入物中OCN的表达。因此，过量的局部TGF-β1可能会损害BMMSC介导的体内骨修复，降低TGF-β1水平可以有效增强骨修复。
为进一步证实TGF-β1对体内骨愈合的双重作用，在裸鼠中产生直径1.0mm的颅骨骨缺损并添加不同剂量的TGF-β1(100ng和2μg)。如图11和图12所示，与上述结果一致，低剂量TGF-β1加速了颅骨骨缺损的愈合，而高剂量TGF-β1阻止新骨形成。为了进一步阐明TGF-β1在体内调节骨愈合的分子机制，检测了颅骨中的骨形成和再吸收能力。如图13所示，低剂量TGF-β1通过上调ALP和OCN的表达水平促进成骨和骨修复。相反，如图14所示，破骨细胞分化标志物组织蛋白酶K和抗酒石酸酸性磷酸酶的表达水平被抑制，表明破骨细胞生成能力降低。高剂量TGF-β1抑制骨生成，但对破骨细胞生成没有影响，导致骨愈合延迟。因此，不同浓度的TGF-β1对体内骨修复具有相反的作用。高TGF-β1浓度损害BMMSC介导的骨修复。
抑制TGF-β1显著增强体内的骨形成
以上的实验结果表明，过量的TGF-β1在体外和体内都会损害骨愈合，而将TGF-β1降低至低水平则促进骨修复。特异性敲低BMMSCs中的smad3以减少TGF-β1信号传导，并在体内植入与β-TCP混合的BMMSCs用于异位骨形成。敲低smad3并不会增加骨量。敲除samd3在第14天减弱BMMSCs的增殖并减少钙沉积。然而，在第21天没有观察到矿化差异。这些结果表明smad3敲低降低了骨形成的速率。TGF-β1在细胞增殖，分化和自我更新中起关键作用。击倒smad3会破坏BMMSCs的特性。因此，smad3不能作为治疗TGF-β1诱导的骨愈合抑制的治疗靶点。SB431542是TGF-β1信号传导的特异性抑制剂。使用SB431542降低TGF-β1对BMMSCs的作用，但不改变BMMSCs的性质，这相当于降低局部微环境中活性TGF-β1的浓度。为此，C57BL/6小鼠通过腹膜内注射2μg/小鼠载体或SB431542每周两次，持续8周。如图15和图16所示，SB431542处理不影响局部TGF-β1水平，但显著抑制smad2/3活化。如图17的H&E染色所示，组织学分析显示SB431542处理组的骨形成增加。
检测TGF-β1活性的抑制是否对亚临界尺寸颅骨缺损的修复产生相同的影响。在野生型小鼠中制造1.0mm的颅骨骨缺损。如图18和图19所示，观察到在SB431542处理组中新形成的骨的体积增加。此外，如图20所示，骨量和骨密度(BMD)显著高于媒介物组。如图21所示，颅骨骨骼切片的H&E染色也证明SB431542处理后缺陷间隙缩短且Bmp2表达升高。过度TGF-β1的抑制可有效促进骨修复。
<实施例二>
本实施方式提供一种成骨环境检测试剂盒，其特征在于，包含检测TGF-β1浓度的试剂，当此试剂盒用于人的成骨能力检测时，检测病人血清，骨折或骨不连局部的TGF-β1浓度时，其判断基准为：TGF-β1的浓度为小于500pg/mL时，则判断此环境利于成骨；大于500pg/mL时，则判断此环境不利于成骨。
当此试剂盒用于检测小鼠或者裸鼠的异位成骨位置的TGF-β1浓度时，其比较基准为浓度为小于200pg/mL时，则判断此环境利于成骨；大于500pg/mL时，则判断此环境不利于成骨。
当此试剂盒用于检测细胞培养环境中的TGF-β1浓度时，当检测到的TGF-β1的浓度小于10ng/mL时，则判断此环境利于成骨，当检测到的TGF-β1的浓度大于10ng/mL时，则判断此环境不利于成骨。
因此可以用于通过采集病人血清或手术时损伤局部组织、体液，评估病人成骨能力，提高骨愈合的疗效。
<实施例三>
本实施方式中提供一种促进骨修复的植入物，包括：TGF-β1抑制物(如SB431542)，TGF-β1抑制物(如SB431542)与缓释凝胶混合，本文中称为混合物一。缓释凝胶可调节释放TGF-β1抑制物(如SB431542)的速度。
在其它的实施方式中，可以在上述混合物一中加入生物材料，此时可以将混合物一附着在生物材料上。以形成细胞附着和分化的支撑。
在较佳的实施方式中，亦可以采用3D打印技术或者其它的成型技术，将混合物一与生物材料形成类似海绵样孔隙的交织分布，以增加支架中TGF-β1抑制物(如：SB431542)分布的均匀度。细胞支架可以采用临床所用的所有的骨修复材料(如β-TCP)制成。
在另一个较佳的实施方式中，亦可以将自体的细胞提取出来，附着在细胞支架上。从而节省自体细胞迁移到支架并增殖的时间，提高骨修复的效率。
在一个更佳的实施方式中，将上述的几种支架类型中的混合物一释放TGF-β1抑制物(如：SB431542)的速度设置为使得其周围预定空间内的细胞内TGF-β1同样受到抑制的浓度。预定空间最主要是指被缓释凝胶所包裹的支架的内部空间，还可以包括凝胶所接触的外部空间的预定距离内的空间，例如从凝胶与外部的接触面处向外放射状的距离为3cm内的范围。此实验的成骨效果与实施例一中相应的实验结果一致。
在另一个替代实施方案中，可以不采用TGF-β1抑制物(如：SB431542)，而直接采用TGF-β1与缓释凝胶进行混合，本文中称为混合物二。
例如TGF-β1采用250μL的HyStem-HP Hydrogel(ESI BIO stem cell solutions,Alameda,CA,USA)含有100ng TGF-β1形成的混合物对TGF-β1进行缓释。此时释放出的TGF-β1的浓度处于促进成骨分化的浓度。
上述促进骨修复的植入物，均能够达到促进成骨的效率，减少成骨不佳的技术效果。

Claims (8)

1.一种成骨检测试剂盒，其特征在于，包含检测TGF-β1浓度的试剂，当此试剂盒用于检测病人的血清，骨折、骨不连局部的TGF-β1浓度时，其判断基准为：TGF-β1的浓度为小于500pg/mL时，则判断此环境利于成骨；大于500pg/mL时，则判断此环境不利于成骨。
当此试剂盒用于检测小鼠或者裸鼠的异位成骨位置的TGF-β1浓度时，其比较基准为浓度为小于200pg/mL时，则判断此环境利于成骨；大于500pg/mL时，则判断此环境不利于成骨。
当此试剂盒用于检测细胞培养环境中的TGF-β1浓度时，其比较基准为10ng/mL，当检测到的TGF-β1的浓度小于10ng/mL时，则判断此环境利于成骨，当检测到的TGF-β1的浓度大于10ng/mL时，则判断此环境不利于成骨。
2.如权利要求1所述的成骨环境检测试剂盒，其特征在于：
其中，所述成骨环境为人(哺乳动物)血清，骨折或骨不连局部。
3.一种促进骨修复的植入物，其特征在于，包括TGF-β1抑制物(如SB431542)。
4.如权利要求3所述的促进骨修复的植入物，其特征在于：TGF-β1抑制物(如SB431542)与缓释凝胶混合。
5.如权利要求3所述的促进骨修复的植入物，其特征在于，包括：生物材料，所述TGF-β1抑制物(如SB431542)附在所述生物材料上。
6.如权利要求3所述的促进骨修复的植入物，其特征在于：
其中，所述TGF-β1抑制物(如SB431542)、缓释凝胶与所述生物材料交织分布。
7.如权利要求3所述的促进骨修复的植入物，其特征在于，包括：细胞，附着在所述生物材料上。
8.如权利要求7所述的促进骨修复的植入物，其特征在于：
其中，所述生物材料采用临床所用的所有的骨修复生物材料(如β-TCP)制成。
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