DE4127570A1

DE4127570A1 - Verfahren zur lokalen antibakteriellen therapie von wunden

Info

Publication number: DE4127570A1
Application number: DE4127570A
Authority: DE
Inventors: Katarina Dr Maier; Gudrun Ehrhardt; Juergen Dr Frevert
Original assignee: Battelle Institut eV
Current assignee: Battelle Institut eV
Priority date: 1991-08-21
Filing date: 1991-08-21
Publication date: 1993-02-25

Description

Die Erfindung betrifft die Anwendung autologer und allogener humaner Keratinozyten kulturen bei großflächigen sowohl oberflächlich zweitgradigen und tiefen drittgradigen Wunden (z. B. Verbrennungswunden) sowie chronischen Wunden zur Infektionsprophyla xe und Wundgrundkonditionierung in einer frühen Phase der Wundheilung.

Hintergrund

Diese Erfindung steht im Zusammenhang mit der Methode der Transplantation von mehrschichtigen autologen Keratinozytenkulturen zur permanenten Deckung unter schiedlich tiefer Verbrennungswunden, die seit mehreren Jahren mit Erfolg durchgeführt wird (1, 2, 3, 4, 5).

Bei dieser Anwendung und allen damit verbundenen Untersuchungen stand bisher immer der Ersatz des durch die Verletzung zerstörten Epithels im Vordergrund d. h. die Wiederherstellung der Integrität der Hautoberfläche (6, 7, 8, 9).

Dies erfordert bei Verletzungen, bei denen die Haut in ihrer gesamten Dicke (Epider mis und Dermis) zerstört ist, die Anwendung autologer Keratinozytenkulturen, die in einem mindestens 3 Wochen dauernden in vitro Kultivierungsprozeß aus einer Haut biopsie des verletzten Patienten bereitgestellt werden können. Dies geschieht im all gemeinen durch Kultivierung der Keratinozyten in Anwesenheit postmitotischer Fibro blasten (10, 11). Die konfluenten Kulturen werden dann als mehrschichtiger Zellverband unter Verwendung einer neutralen Protease von der Oberfläche der Gewebekulturschale abgelöst (12).

Während der Zeitspanne zwischen Nekrektomie und endgültiger Deckung müssen die Wunden mit temporären Wundabdeckungen versorgt und konditioniert werden, um ein möglichst optimales Transplantationsbett für die Keratinozytenkulturen zu schaffen.

Aber auch im Fall der autologen Spalthaut (Meshgraft)-Transplantation die heute noch in den meisten Kliniken die Methode der Wahl ist, müssen die großflächigen Wunden oft tage- bis wochenlang temporär versorgt werden, bevor ausreichende Mengen an Eigenhaut zur Transplantation zur Verfügung stehen.

In dieser Phase werden die offenen und auch die temporär gedeckten Wundflächen fast immer von verschiedenen apathogenen und pathogenen Bakterien besiedelt. Diese Kontaminationen sind zum einen eine schlechte Voraussetzung für die Entwicklung eines hochwertigen Granulationsgewebes und damit für eine erfolgreiche Transplanta tion, zum anderen führen sie im schlimmsten Fall zur Sepsis und zum Tod des Patien ten.

Komplikationen durch Infektionen treten allerdings nicht nur bei hochgradigen Ver brennungen auf. Auch bei anderen großflächigen und tiefen Verletzungen und auch bei chronischen Wunden beeinflussen bakterielle Infektionen den Heilungsverlauf negativ, so daß einer wirksamen lokalen antimikrobiellen Therapie ohne Nebenwirkungen große Bedeutung zukommt.

Zusammenfassung der Erfindung

Auch im Fall chronischer, nicht heilender Wunden (z. B. Ulcera crurum) sollen Keratino zytenkulturen als keimhemmende physiologische Wundverbände eingesetzt werden. Hierbei ist der Einsatz allogener und autologer Keratinozyten möglich.

Ein Einsatz der Keratinozytenkulturen für diesen Zweck wird gerechtfertigt durch unsere Entdeckung eines antimikrobiellen Faktors, der von in vitro kultivierten, huma nen Keratinozyten und Hautfibroblasten, nicht aber von anderen Säugetierzelltypen produziert und nach Transplantation in die Wunde abgegeben wird.

Die Substanz oder das Substanzgemisch, das gegenwärtig Gegenstand weiterer Charak terisierungs- und Isolierungsexperimente ist, ist unter anderem gegen folgende gram positiven und gram-negativen Keime inhibitorisch wirksam: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa und Bacillus subtilis. Diese Mikroorganismen werden von Keratinozyten in unterschiedlichem Maße gehemmt, wobei die Stärke der Hemmwir kung der Wirkung üblicher Antibiotica in therapeutischen Dosen (Penicillin, Streptomy cin, Tetracyclin, Gentamycin) ähnlich ist.

Bisher wurde in der Literatur lediglich der gegenteilige Effekt, nämlich die hemmende und zerstörende Wirkung von Bakterien bzw. Bakterienprodukten auf Keratinozyten beschrieben (13). Dieser Effekt spielt nach klinischen Erfahrungen vor allem bei sehr stark bakteriell kontaminiertem Wundbett eine Rolle (5), wie es vor allem bei chroni schem Granulationsgewebe und schlecht konditionierten Wunden vorliegt. Offensichtlich war bei diesem massiven Befall die antibakterielle Wirkung der vorher nicht getesteten Keratinozyten nicht ausreichend, um die Infektion einzudämmen. In diesen Fällen versucht man, durch topische Anwendung von antimikrobiellen Agentien, die jedoch alle mehr oder weniger zytotoxisch für Keratinozyten sind, die Infektionen zu eliminieren (14). Dabei besteht jedoch immer die Gefahr einer irreversiblen Schädigung der Kerati nozyten und generell ein negativer Einfluß auf die Wundheilung sowie die Ausbildung von Antibiotica-Resistenzen. Eine Ausnutzung des antimikrobiellen Effekts der Kerati nozyten selbst hingegen ermöglicht eine vollkommen physiologische Infektionsbekämp fung ohne negative Beeinflussung der Wundheilungsvorgänge, aber mit all den positiven Effekten der transplantierten Keratinozytenkultur wie Reepithelisierung, Wundgrund konditionierung und Schmerzstillung.

Daher ist ein Aspekt unserer Erfindung der gezielte frühzeitige Einsatz allogener Keratinozytenkulturen zur Infektionsprophylaxe bei großflächigen Verletzungen wie z. B. Verbrennungen. Allogene Kulturen, die routinemäßig auf Vorrat kultiviert werden können oder auch aus kryokonservierten Zellsuspensionen binnen einiger Tage her angezüchtet werden können, werden auf die chirurgisch präparierten Wunden aufgelegt. Bevorzugt sollen Keratinozytenkulturen angewandt werden, deren antimikrobielle Wirkung zuvor in vitro quantifiziert und für gut hemmend befunden wurde. Dazu wird folgendes Testsystem eingesetzt:

Die zu testenden Zellkulturen werden abtrypsiniert und abzentrifugiert. Das Zellpellet wird in 500 µl Saline (0,9% NaCl Lösung) resuspendiert und die Zellen durch Frieren und Tauen oder vergleichbare Methoden aufgeschlossen. Durch eine weitere Zen trifugation wird der Überstand, der die zytoplasmatische Fraktion der Zellen enthält, von der Membranfraktion getrennt. Der Überstand wird auf eine Proteinkonzentration von 4 mg/ml eingestellt. 100 µl dieser Lösung werden auf ein Zellulose-Testplättchen aufgetragen. Die Testbakterien werden über Nacht in flüssigem CaSo Agar bei 37°C angezüchtet und nach Zellzahlbestimmung mit einer Dichte von 1·10⁶ Keimen/Petri schale 10 cm plattiert. Darauf werden die Testplättchen aufgetragen.

Nach 18 h Bebrütung bei 37° kann die inhibitorische Wirkung am Durchmesser des Hemmhofs bestimmt werden. Da auch das Keimspektrum, gegen das die jeweiligen Keratinozyten aktiv sind, ausgetestet werden kann, können die Kulturen auch gezielt gegen bestimmte Keime eingesetzt werden. Die Transplantate können mehrere Tage auf der Wunde verbleiben. Dies erspart dem Patienten die täglichen schmerzhaften und von Blutverlust begleiteten Verbandswechsel, die bei herkömmlichen Verfahren erforderlich sind. Läßt die antimikrobielle Wirkung der Transplantate nach, können sie durch neue Keratinozytenkulturen ersetzt werden.

Ein weitere Aspekt dieser Erfindung ist die gezielte Anwendung allogener und autologer Keratinozytenkulturen zur Infektionsbekämpfung und Wundgrundkonditionierung bei chronischen nicht heilenden Wunden wie z. B. Ulcera crurum. Chronische Ulcera sind regelmäßig mit apathogenen und pathogenen Mikroorganismen wie z. B. S. aureus, P. aeruginosa, hämolysierenden Streptococcen (Gruppe A und B) etc. besiedelt. Die antibak terielle Wirkung der Keratinozyten kann hier gezielt zum Einsatz gebracht werden, wobei auch autologe Keratinozyten, die aus einer dem Spender zuvor entnommenen Biopsie kultiviert werden, Verwendung finden können. Da Ulcera oft über Jahre hinweg nicht heilen und gegenüber herkömmlichen Methoden therapieresistent sind, spielt hier der Zeitfaktor nicht die entscheidende Rolle wie bei Verbrennungspatienten, so daß hier die zeitliche Verzögerung von 3 Wochen (Zeitraum für die Kultivierung von autologen Keratinozyten) in Kauf genommen werden kann.

Ein weiterer positiver Effekt der Keratinozytentransplantate ist die schmerzstillende Wirkung, die sofort nach Auflegen der Transplantate einsetzt und im allgemeinen bis zu 8 Tagen anhält.

Dieser Effekt und auch die allgemeine positive Entwicklung des Wundgrunds sind vermutlich zurückzuführen auf die physiologische Zusammensetzung und auch auf die Transplantatform und Konsistenz, nämlich die eines mehrschichtigen elastischen zusam menhängenden Sheets, das als physiologische Wundabdeckung ein Wundmilieu schafft, das diese positive Entwicklung ermöglicht. Daher ist diese Form des Transplantats die bevorzugte Anwendungsform. Diese Transplantatform kann durch Anwendung verschie dener bekannter Kultivierungsmethoden erreicht werden (12, 15, 16, 17). Es können aber auch Techniken zum Einsatz kommen, die eine Suspension von Zellen generieren oder bei denen Zellen zu Extrakten verarbeitet werden. Die Zellsuspensionen oder Zellbestandteile können dann entweder direkt oder an geeignete Matrices gebunden, auf Wunden aufgebracht werden.

Anwendungsbeispiele

Bevorzugte Anwendungsbereiche:

Die Anwendung der hier beschriebenen Erfindung ist immer geeignet und sinnvoll bei der Behandlung leicht infizierter, infektionsgefährdeter oder schlecht heilender Wunden, sowie Wunden, die einer Konditonierung bedürfen, wie z. B. Ulcera oder Verbrennungs wunden. Da bei verschiedenen Indikationen, in Abhängigkeit von Art, Ausdehnung, bakterieller Besiedelung und Zustand der Wunde jedoch unterschiedliche Anwendungs möglichkeiten bevorzugt werden, sind im folgenden spezifische Anwendungsbeispiele dargestellt, die jedoch die mögliche Anwendungsbreite der Erfindung nicht limitieren sollen.

Beispiel 1

Bei einem 46-jährigen Patienten mit mehr als 70% meist drittgradigen Verbrennungen der Körperoberfläche wurden nach der Nekrektomie des gesamten linken Beines die Wunden eine Woche lang mit Epigard, einem synthetischen, temporären Hautersatz behandelt. Epigard wurde 1·pro Tag gewechselt, wodurch nach einer Woche ein sauberer, gut granulierter, nekrosefreier Wundgrund entstand. Die bakteriologische Analyse verschiedener Abstriche ergab eine gleichmäßige Besiedelung der Wunde mit Staphylococcus aureus und Enterobacter spec. Die Wunde wurde dann ohne weitere antiseptische Behandlung mit Keratinozytenkulturen transplantiert, mit sterilen, trocke nen Kompressen bedeckt und verbunden. Nach 7 Tagen wurde der Verband und die Cuticerin Gaze, an der die Keratinozyten befestigt waren, entfernt und direkt von der Wundoberfläche Abstriche entnommen. Der mikrobiologische Befund ergab eine deutliche Reduktion des S. aureus. Enterobacter spec. war nicht mehr nachweisbar. Eine zweite Transplantation mit neuen Keratinozytenkulturen schloß sich ohne weitere Manipulation der Wunde direkt an. Nach vier Tagen wurde die Wundoberfläche erneut durch Abstriche kontrolliert. Die mikrobiologische Analyse ergab keinerlei Kolonien mehr. Die Wunde war steril.

Parallel zur klinischen Anwendung der Keratinozytenkulturen wurden S. aureus und Enterobacter aerogenes Stämme vom Patienten vor Transplantation isoliert und in vitro untersucht, inwieweit diese Bakterienstämme sensitiv gegenüber den verwendeten Keratinozyten waren. Das Ergebnis zeigte eine deutliche Hemmwirkung der Patienteni solate durch die getesteten Keratinozytenextrakte (Abb. 4). Damit kann die antibakteriel le Wirkung der Keratinozyten eindeutig auf einen direkten antimikrobiellen Effekt der Zellen auf die Bakterien zurückgeführt werden.

Beispiel 2

2 Patienten mit venösen Ulcera crurum, die seit mehreren Jahren ohne Erfolg konserva tiv behandelt worden waren, wurden mit allogenen Keratinozytenkulturen behandelt.

Die Ulcerationen wurden vor der Transplantation regelmäßig gesäubert und antiseptisch behandelt, um ein möglichst optimales Wundbett zu schaffen.

Ein Abklatschpräparat direkt vor Transplantation ergab dennoch eine rasenförmige Besiedelung mit Pseudomonas aeruginosa und hämolysierende Streptokokken.

Auf diesen infizierten Wundgrund wurden allogene, an Cuticerin befestigte Keratinozy tekulturen transplantiert, d. h. sie wurden aufgelegt, mit sterilen Kompressen abgedeckt und mit leichtem Druck steril verbunden.

Der erste Verbandswechsel und die erste Inspektion der Wunde erfolgte nach 6 Tagen. Die Cuticerin Gaze wurde abgezogen und direkt danach erfolgte ein erneuter Abklatsch der Wunde mit Blutagar. Diesmal war die Kultur steril. Die Keratinozytenkulturen hatten also offensichtlich zur Eliminierung der Infektion geführt. Dies wiederum führte zu einer günstigen Entwicklung des Wundbetts, das nach ungefähr 2 Wochen reepitheli siert war.

Um diesen eindeutigen antimikrobiellen Effekt in vitro nachvollziehen zu können, wurden allogene Keratinozytenkulturen, die parallel mit den Transplantaten angezüchtet worden waren, dann aber nicht für die Klinik benötigt wurden auf verschiedene Bak terienkulturen aufgelegt. Getestete Keime waren: S. aureus, E. aerogenes, P. aeruginosa (s. Abb. 1 und 4).

Eine eindeutige Hemmwirkung, die sich nicht auf den Bereich unter dem Zellkultur epithel beschränkte sondern sich auch auf dem Zellkulturepithel benachbarter Bereiche erstreckte, demonstriert, daß die wirksame Substanz aus dem Sheet in die Umgebung diffundieren kann (Abb. 1). Die Wirkung hält auch bei mehrtägiger Bebrütung an. Somit bestätigen die in vitro Versuche die klinisch beobachteten Ergebnisse vollständig.

Beispiel 3

Nachweis der antimikrobiellen Wirkung in vitro.

Abb. 1 zeigt den antibakteriellen Effekt eines Keratinozytentransplantats in vitro, das in identischer Form klinisch eingesetzt werden kann. Auf der Petrischale wurde Escherichia coli mit einer Gesamtkeimzahl von 1·10⁶ ausplattiert, anschließend das Transplantat aufgelegt und 18 h bei 37°C bebrütet. Auch bei Bebrütung über mehrere Tage bleibt der Hemmhof bestehen.

Abb. 2 zeigt den antibakteriellen Effekt von Keratinozytenextrakten, die aus den Zellen verschiedener Patienten gewonnen wurden auf einem Zellrasen von Staphylococ cus aureus. Der Extrakt wurde in einer Konzentration von 0,4 mg Protein pro Testplätt chen eingesetzt. Die Hemmwirkung der Zellextrakte ist dosisabhängig, wie in Abb. 3 dargestellt ist.

In Abb. 4 ist das bisher ausgetestet Keimspektrum zu sehen. Verschieden gram positive und gram-negative Bakterienstämme, ein Staphylococcus aureus Patientenisolat und ein Enterobacter aerogenes Patientenisolat, sowie Candida albicans wurden als Testkeime eingesetzt. Im Vergleich zu der antimikrobiellen Wirkung der Keratinozyten, die auch wieder als Extrakte mit einer Konzentration von 0,4 mg Protein getestet wurden (entspricht ca 4·106 Zellen), sind noch die Hemmhöfe der Antibiotica Tetra cyclin und Streptomycin dargestellt.

Tabelle 1 demonstriert die selektive antibakterielle Wirksamkeit humaner Keratinozyten und Hautfibroblastenkulturen. Extrakte aus einer Vielzahl anderer Zellen unterschiedli chen Spezies- und Organursprungs, sowie spontan transformierte Humankeratinozyten (HaCat) sind nicht wirksam.

Tabelle 1

Claims

1. Verwendung von kultivierten allogenen oder autologen Keratinozyten oder Hautfibroblasten zur lokalen antibakteriellen Therapie und/oder Infektions prophylaxe von Wunden.

2. Verfahren zur lokalen antibakteriellen Therapie und/oder Infektionsprophylaxe von Wunden, wobei die Wunden mit allogenen oder autologen Zellkulturepithel abgedeckt werden, dadurch gekennzeichnet, daß das Zellkulturepithel in vitro aus allogenen oder autologen Keratinozyten kultiviert wird und einen dreidimensionalen Zellverband bildet.

3. Verfahren zur lokalen antibakteriellen Therapie und/oder Infektionsprophylaxe von Wunden, wobei Extrakte aus allogenen oder autologen Keratinozyten oder Hautfibroblasten eingesetzt werden.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, das das Zellkulturepithel zur Therapie und Prophylaxe gegen grampositive und gramnegative Bakterien eingesetzt wird.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Wunden insbesondere um zweit- und drittgrade Verbren nungswunden sowie schlecht heilende, chronische Wunden handelt (z. B. Ulcera crurum).

6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß kryokonserviertes Zellkulturepithel eingesetzt wird.