CN108030959A - 缓释igf-1生长因子的肌肉脱细胞材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种缓释IGF‑1生长因子的肌肉脱细胞材料及其制备方法，本发明将哺乳动物任意大小的骨骼肌肉组织经含蛋白酶抑制剂的PBS、含KCl的PBS缓冲液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液、含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得可自发、持续缓释IGF‑1生长因子的脱细胞肌肉材料。本发明能同时对肌肉组织上的细胞进行完全去细胞化处理，且条件温和、无ECM损害、快速稳定，所得肌肉脱细胞材料不仅可以自发、持续缓释IGF‑1生长因子，还具有生物相容性好、可塑性强、生物力学强度高等优点，可用于修复临床上各类病因造成的肌肉损伤、退变相关疾病。

Description

缓释IGF-1生长因子的肌肉脱细胞材料及其制备方法
技术领域
本发明主要涉及用于全身骨骼肌肉组织修复及其再生的医学领域，具体是一种新型的肌肉脱细胞材料的制备，该生物支架能自发持续释放IGF-1-1生长因子，且较好的保留了天然肌肉组织的细胞外基质成分，该材料能促进大面积肌肉缺损的修复和再生。
背景技术
虽然骨骼肌在损伤之后有一定的自我修复能力，但是急性、超过20％面积的肌肉损伤常常导致缺损处无法修复，往往由大量的疤痕纤维组织替代，我们称之为大面积肌肉缺损。目前，没有有效治疗手段能促进大面积肌肉缺损的修复和再生。
在骨骼肌细胞外基质(ECM)重塑和肌肉再生过程中，通过释放一系列生长因子,激活肌卫星细胞促进肌纤维分化，并最终促进骨骼肌再生。因此，生长因子对肌肉再生有着重要的意义。而胰岛素样生长因子-1(IGF-1)通过促进卫星细胞增殖和肌原性的分化，血管内皮细胞介导的血管生成以及神经元存活和轴突再生等多种途径而强有力的促进肌肉修复再生。但是通过传统技术制备的肌肉脱细胞材料，其IGF-1生长因子往往不能被很好保留，更无法达到持续缓释。能够自发、持续缓释IGF-1生长因子的脱细胞肌肉支架还未见报道。
单独的应用IGF-1或者将IGF-1加到人工合成材料中去修复大面积肌肉缺损结果并不理想，因为肌卫星细胞的增殖分化需要在数天后(3-7天)，而目前报道的IGF-1释放的最大效能只维持在10-24小时之间。而且人造的合成材料相较于天然的肌肉ECM缺少天然的细胞生长发育所需微环境，无法实现很好的肌肉修复再生。因此本发明通过创新的脱细胞技术制备能自发、持续释放IGF-1生长因子的新型脱细胞肌肉生物支架，并且证实该支架在体内能很好的修复大面积的肌肉缺损同时能恢复受损肌肉组织中的血管和神经再生，在肌肉再生组织工程中有极大的意义。
发明内容
本发明目的在于填补现有技术中，脱细胞肌肉材料不能保留并且缓释IGF-1生长因子而影响肌肉缺损的修复再生，提供一种能自发、持续释放IGF-1生长因子，并且较好促进大面积肌肉缺损再生的新型脱细胞肌肉生物支架的制备方法。
缓释IGF-1生长因子的肌肉脱细胞材料,包括
含蛋白酶抑制剂的生理盐水，蛋白酶抑制剂浓度为10K IU/ml；
含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液，其中蛋白酶抑制剂浓度为10-50KIU/ml；
含KCL的PBS缓冲液，具体为浓度0.1M-1.2M的KCL的PBS缓冲液；
含Triton X的PBS缓冲液，具体为浓度0.05％-1％的Triton X-100或Triton X-200的PBS缓冲液；
含NaCL的PBS缓冲液，具体为浓度0.1M-1.5M的NaCL的PBS缓冲液；
含SDS的PBS缓冲液，具体为浓度0.02％-0.15％的SDS的PBS缓冲液；
含DNA酶的PBS缓冲液中DNA酶浓度为0.5-2mg/ml；
混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为20KIU/ml，20g/ml；青霉素和链霉素的比例为1：1，加入的混合抗菌液与原溶液体积比为1：1。
上述天然哺乳动物或人组织来源的肌肉脱细胞材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)取宰杀12h以内任意哺乳动物的骨骼肌肉组织，用剪刀除去肌肉上的脂肪，裁成一定大小，用含蛋白酶抑制剂的生理盐水漂洗3次，每次20min，去除血液，贴附的脂肪碎片和其他杂质。
(2)在含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡24-48小时；然后用液氮冻融3个循环(-80℃/37℃)
(3)在含KCL的PBS缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡2-12小时；
(4)在含Triton X的PBS缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡8-24小时；
(5)在含SDS的PBS缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡8-24小时；
(6)在含DNA酶的PBS缓冲液中，37℃摇床100rpm震荡6-12小时；
步骤(2)-(6)中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时。
针对目前用于肌肉修复和再生的材料及其制备方法存在的问题，发明人建立了一种新型能自发持续缓释IGF-1生长因子的天然组织来源的肌肉脱细胞材料的制备方法，该法将哺乳动物任意大小的骨骼肌肉组织经含蛋白酶抑制剂的PBS、含KCl的PBS缓冲液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液、含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得可自发、持续缓释IGF-1生长因子的脱细胞肌肉材料。本发明能同时对肌肉组织上的细胞进行完全去细胞化处理，且条件温和、无ECM损害、快速稳定，所得肌肉脱细胞材料不仅可以自发、持续缓释IGF-1生长因子，还具有生物相容性好、可塑性强、生物力学强度高等优点，可用于修复临床上各类病因造成的肌肉损伤、退变相关疾病。
相对于现有技术，本发明的显著进步在于：
(1)本发明通过脱细胞技术制备的新型肌肉材料在去除异种/异体细胞的同时，可较好保留原先ECM的完整性，可以最大限度的模拟正常肌肉天然成分和微观结构。
(2)本发明材料不含细胞、细胞核、DNA等抗原性物质，具有极低的免疫排斥反应，具有很好的生物相容性。
(3)新型脱细胞肌肉材料能自发、持续的释放IGF-1生长因子。
(4)本发明材料在大面积肌肉缺损的模型中能促进肌肉再生的同时，更能够促进肌肉组织中血管和神经的再生，在肌肉再生组织工程中有极大的意义。
附图说明
图1是新型脱细胞肌肉材料大体外观图
图2是本材料HE染色无细胞及无细胞核成分残留图
图3是本材料DNA定量检测几乎不含有DNA成分图
图4是本材料糖胺聚糖成分和定量检测保留大量糖胺聚糖图
图5是本材料胶原成分定量检测保留大量胶原成分图
图6是本材料主要组织相容性复合体免疫组化染色证明极低免疫原性图
图7是本材料大鼠体内皮下包，1周和2周HE染色证明极好的生物相容性图
图8是本材料酶联免疫吸附测定自发、持续释放IGF-1生长因子图
图9是本材料移植大鼠大面积肌肉缺损2周和1、2、4个月等时间点的Masson染色肌纤维再生以及定量统计，证实体内可促进肌肉修复再生图
图10是本材料移植大面积肌肉缺损2周和1、2、4个月等时间点vWF免疫荧光染色血管再生以及定量统计，证实体内可促进肌肉组织中血管修复再生图
图11是本材料移植大面积肌肉缺损2周和1、2、4个月等时间点VAChT免疫荧光染色神经再生以及定量统计，证实体内可促进肌肉组织中神经修复再生图
具体实施方案
下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
实施例1：自发、持续缓释IGF-1生长因子的脱细胞肌肉材料的制备和再生修复研究
1.制备新型的脱细胞肌肉材料
(1)取材：将猪的竖脊肌按肌纤维方向切成长度宽度和厚度均为2cm大小，用含10KIU/ml蛋白酶抑制剂的生理盐水漂洗3次，每次20min，无菌PBS充分漂洗去除血液和其他杂质。
(2)脱细胞步骤如下：
①、在含10K IU/ml蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡48小时，然后用液氮冻融3个循环(-80℃/37℃)；
②、在含0.1M KCL的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡12小时；
③、在浓度为0.05％的Triton X-100的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；
④、在浓度为0.02％的含SDS的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时；
⑤、在浓度为1mg/ml的含DNA酶的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡12小时，即可得到新型脱细胞肌肉材料
注：完成每一步骤后均用生理盐水冲洗5小时。
2.新型脱细胞肌肉材料细胞去除评定
图1是本发明新型脱细胞肌肉材料的大体外观图；图2是本材料HE染色无细胞及无细胞核成分残留图；图3是本发明材料DNA定量检测几乎不含有DNA成分图。
3.新型脱细胞肌肉材料细胞外基质保留的评估
图4是本发明材料糖胺聚糖成分和定量检测保留大量糖胺聚糖图；图5是本发明材料胶原成分定量检测保留大量胶原成分图。
5.新型脱细胞肌肉材料极低免疫原性测定
图6是本发明材料主要组织相容性复合体免疫组化染色证明极低免疫原性图；图7是本发明材料大鼠体内皮下包埋1、2周HE染色证明良好的生物相容性图与免疫原性。
6.新型脱细胞肌肉材料自发释放IGF-1
图8是酶联免疫吸附测定本发明材料1到10天自发持续释放IGF-1图
7.新型脱细胞肌肉材料促进大面积肌肉缺损修复
图9是本发明材料移植大面积肌肉缺损2周，1、2、4个月Masson染色肌纤维再生以及定量统计图；图10是本发明材料移植大面积肌肉缺损2周以及定量统计，1、2、4个月vWF免疫荧光染色血管再生以及定量统计图；图11是本发明材料移植大面积肌肉缺损2周，1、2、4个月VAChT免疫荧光染色神经再生以及定量统计图。
实施例2：自发持续缓释IGF-1生长因子的脱细胞肌肉材料的制备和再生修复研究
1.制备新型的脱细胞肌肉材料
(1)取材：将猪的竖脊肌按肌纤维方向切成长度宽度和厚度均为4cm大小，用含10KIU/ml蛋白酶抑制剂的生理盐水漂洗3次，每次20min，无菌PBS充分漂洗去除血液和其他杂质。
(2)脱细胞步骤如下：
①、在含30K IU/ml蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡36小时，然后用液氮冻融3个循环(-80℃/37℃)；
②、在含0.6M KCL的PBS缓冲液中，1:1加入青霉素和链霉素(20K IU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡6小时；
③、在浓度为0.5％的Triton X-100的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡12小时；
④、在浓度为0.1％的含SDS的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20K IU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡12小时；
⑤、在浓度为2mg/ml的含DNA酶的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20K IU/ml，20g/ml)混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡6小时，其余参考实施例1的方法进行，得到新型自发持续缓释IGF-1生长因子的脱细胞肌肉材料。
实施例3：自发、持续缓释IGF-1生长因子的脱细胞肌肉材料的制备和再生修复研究
1.制备新型的脱细胞肌肉材料
(1)取材：将猪的竖脊肌按肌纤维方向切成长度宽度和厚度均为4cm大小，用含10KIU/ml蛋白酶抑制剂的生理盐水漂洗3次，每次20min，无菌PBS充分漂洗去除血液和其他杂质。
(2)脱细胞步骤如下：
①、在含50K IU/ml蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时，然后用液氮冻融3个循环(-80℃/37℃)；
②、在含1.2M KCL的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20K IU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡2小时；
③、在浓度为1％的Triton X-100的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡8小时；
④、在浓度为0.15％的含SDS的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20K IU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡8小时；
⑤、在浓度为0.5mg/ml的含DNA酶的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20KIU/ml，20g/ml)混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡10小时，其余参考实施例1的方法进行，得到新型自发持续缓释IGF-1生长因子的脱细胞肌肉材料。
实施例4脱细胞肌腱联合骨材料的制备和研究
取牛骨骼肌肉组织，步骤(3)在浓度为0.05％的含Triton X-200的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20K IU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡24小时。其余参考实施例1的方法进行，得到新型自发持续缓释IGF-1生长因子的脱细胞肌肉材料。
实施例5脱细胞肌腱联合骨材料的制备和研究
取牛骨骼肌肉组织，骤(3)在浓度为1％的含Triton X-200的PBS缓冲液中，1：1加入青霉素和链霉素(20K IU/ml，20g/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床100rpm震荡8小时。其余参考实施例1的方法进行，得到新型自发持续缓释IGF-1生长因子的脱细胞肌肉材料。
对实施例2-5所得新型脱细胞肌肉材料分别进行组织学评价、抗原成分定量检测和力学检测，结果与实施例1类似，这表明可通过上述多种方法制得多种组织来源，多种组织大小的脱细胞肌肉材料，并且对脱细胞肌肉材料进行组织学评价、抗原成分定量检测检测均说明材料已经完全去除细胞成分，无明显抗原成分残留。同时用上述方法获得的新型脱细胞肌肉材料均可持续缓释IGF-1生长因子。该新型持续自发缓释IGF-1生长因子的脱细胞肌肉材料可以作为临床上促进肌肉缺损和病变修复再生的，安全可靠、有效、快速的生物材料。

Claims (2)

1.缓释IGF-1生长因子的肌肉脱细胞材料，其特征在于：为一种持续缓释IGF-1生长因子的肌肉脱细胞材料。
2.缓释IGF-1生长因子的肌肉脱细胞材料的制备方法，其特征在于：该方法具体包括以下步骤：
步骤一：取宰杀12h以内任意哺乳动物的骨骼肌肉组织，用剪刀除去肌肉上的脂肪，用含蛋白酶抑制剂的生理盐水漂洗3次，每次20min，去除血液，贴附的脂肪碎片和其他杂质；
步骤二：在含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，在4℃温度下摇床100rpm震荡24～48小时；然后用液氮冻融3个循环，每个循环为-80℃～37℃；
步骤三：在含KCL的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，在4℃温度下摇床100rpm震荡2～12小时；含KCL的PBS缓冲液与青霉素和链霉素混合抗菌液的体积比为1:1；
步骤四：在含Triton X的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，在4℃温度下摇床100rpm震荡8-24小时；含Triton X的PBS缓冲液与青霉素和链霉素混合抗菌液的体积比为1:1；
步骤五：在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，在4℃温度下摇床100rpm震荡8-24小时；含SDS的PBS缓冲液与青霉素和链霉素混合抗菌液的体积比为1:1；
步骤六：在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡6-12小时；含DNA酶的PBS缓冲液与青霉素和链霉素混合抗菌液的体积比为1:1；
步骤二～六中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时；
其中蛋白酶抑制剂的生理盐水中蛋白酶抑制剂浓度为10KIU/ml；
含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中蛋白酶抑制剂浓度为10-50KIU/ml；
含KCL的PBS缓冲液，具体为浓度0.1M-1.2M的KCL的PBS缓冲液；
含Triton X的PBS缓冲液，具体为浓度0.05％-1％的Triton X-100或Triton X-200的PBS缓冲液；
含SDS的PBS缓冲液，具体为含浓度0.02％-0.15％的SDS的PBS缓冲液；
含DNA酶的PBS缓冲液，其中DNA酶浓度为0.5-2mg/ml；
混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为20KIU/ml，20g/ml；青霉素和链霉素的比例为1：1，加入的混合抗菌液与原溶液体积比为1：1。
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