JP6801993B2 - 軟骨細胞注入キット - Google Patents

Description

本発明は、軟骨細胞移植用材料に関し、特に関節軟骨欠損部位の修復に適した注入型材料に関する。

関節軟骨欠損傷に対する治療法として、これまで種々の技術が開発されてきた。例えば、特許文献１には、軟骨細胞をコラーゲンゲル内でゲル包埋培養に付すことを特徴とする軟骨移植用材料が開示されている。

また、特許文献２には、コラーゲンとヒアルロン酸とを含むゲル状混合物を架橋させた軟骨移植材が開示されている。

特許文献３には、コラーゲン、ヒアルロン酸及びフィブリンを含有する基質を、注射器の先端の混合チップによって混合し、得られた混合物を軟骨損傷部位に注入する方法が開示されている。

特開２００１−２２４６７８号公報 特開２００７−２８９２５２号公報 特表２００９−５０１６０５号公報

本発明は、軟骨細胞又は軟骨細胞への分化能を有する細胞を含有し、軟骨損傷部位を切開する必要がない注入型の軟骨細胞移植用材料の開発を課題とするものである。

一般に、可溶化コラーゲン溶液を適度なイオン強度及びpHにして適度に加温すると線維化（ゲル化）が引き起こされるという性質が知られており、当該性質の利用も視野に入れて、本発明者らは上記課題について鋭意検討した。その結果、特に線維化速度の速い魚類由来の可溶化コラーゲンを用いた場合には、線維化により生成したコラーゲンゲルが軟骨細胞又は軟骨細胞への分化能を有する細胞をゲル内に取り込み、細胞増殖及び軟骨基質産生の足場材料として有効に作用することを見出し、係る知見を基に本発明を完成させたものである。

ところで、魚類由来の可溶化コラーゲンが線維化して生成したコラーゲンゲルは収縮し易い性質を有し、それが接着依存性細胞の存在下ではより顕著になることが分かった。そこで、収縮抑制が求められる適用処置に好適な注入型の軟骨細胞移植用材料についてさらに検討を重ねた結果、魚類由来の可溶化コラーゲンに加えて哺乳類由来の可溶化コラーゲンを適用することで収縮抑制効果が得られることを見出した。また、コンドロイチン硫酸の適用によっても収縮抑制効果が得られることを見出し、係る知見を基に本発明の更なる完成を成し遂げたものである。

即ち、本発明は下記の通りである。
［１］魚類由来の可溶化コラーゲンを含む細胞等張性コラーゲン溶液と、軟骨細胞又は軟骨細胞への分化能を有する細胞及び細胞用培養液を含む細胞懸濁液と、を構成要素として含むことを特徴とする軟骨細胞注入キット。
［２］さらに、前記細胞等張性コラーゲン溶液が、哺乳類由来の可溶化コラーゲンを含むものである上記［１］記載の軟骨細胞注入キット。
［３］前記細胞等張性コラーゲン溶液中の魚類由来の可溶化コラーゲンと哺乳類由来の可溶化コラーゲンの質量比が、1：2〜3：1の範囲である上記［２］記載の軟骨細胞注入キット。
［４］さらに、細胞等張性コラーゲン溶液及び細胞懸濁液のうちいずれか一方又は双方が、コンドロイチン硫酸を含むものである上記［１］〜［３］のいずれか１項記載の軟骨細胞注入キット。

本発明の軟骨細胞注入キットは、線維化速度の速い魚類由来の可溶化コラーゲンを用いているため、注入型材料として優れた作用を発揮することができる。また、哺乳類由来の可溶化コラーゲン及び／又はコンドロイチン硫酸を併用したときは、収縮し難い特性を付与することができる。

実施例のゲル化時間の確認実験における結果を示したグラフである。 実施例の細胞培養実験１における結果を示したグラフである。 実施例の細胞培養実験１における結果を示した写真である。 実施例の細胞培養実験２における結果を示したグラフである。 実施例の細胞培養実験２における結果を示した写真である。 実施例の動物実験における施術4週間後の欠損部の外観写真である。 実施例の動物実験における施術4週間後の試験群１のヘマトキシリン・エオジン染色による欠損部の組織切片の写真である。 実施例の動物実験における施術4週間後の試験群２のヘマトキシリン・エオジン染色による欠損部の組織切片の写真である。 実施例の動物実験における施術4週間後のサフラニンO染色による欠損部の組織切片の写真である。

以下、本発明の軟骨細胞注入キットについて詳細に説明する。尚、以下において、「軟骨細胞又は軟骨細胞への分化能を有する細胞」を「軟骨系細胞」と称する。

（第一形態）
本発明の軟骨細胞注入キットの第一形態は、魚類由来の可溶化コラーゲンを含む細胞等張性コラーゲン溶液と、軟骨系細胞及び細胞用培養液を含む細胞懸濁液と、を構成要素として含むことを特徴とするものである。

（第二形態）
本発明の軟骨細胞注入キットの第二形態は、第一形態において、前記細胞等張性コラーゲン溶液がさらに哺乳類由来の可溶化コラーゲンを含むものである。即ち、魚類由来の可溶化コラーゲン及び哺乳類由来の可溶化コラーゲンを含む細胞等張性コラーゲン溶液と、軟骨系細胞及び細胞用培養液を含む細胞懸濁液と、を構成要素として含むことを特徴とする軟骨細胞注入キットである。

（第三形態）
本発明の軟骨細胞注入キットの第三形態は、第一形態又は第二形態において、細胞懸濁液及び細胞等張性コラーゲン溶液のうちいずれか一方又は双方がさらにコンドロイチン硫酸を含むものである。即ち、第三形態として、以下の（ａ）〜（ｆ）の形態が挙げられる。
（ａ）第一形態において、細胞等張性コラーゲン溶液にコンドロイチン硫酸が含まれる形態：
魚類由来の可溶化コラーゲン及びコンドロイチン硫酸を含む細胞等張性コラーゲン溶液と、軟骨系細胞及び細胞用培養液を含む細胞懸濁液と、を構成要素として含むことを特徴とする軟骨細胞注入キット。
（ｂ）第一形態において、細胞懸濁液にコンドロイチン硫酸が含まれる形態：
魚類由来の可溶化コラーゲンを含む細胞等張性コラーゲン溶液と、軟骨系細胞、細胞用培養液及びコンドロイチン硫酸を含む細胞懸濁液と、を構成要素として含むことを特徴とする軟骨細胞注入キット。
（ｃ）第一形態において、細胞等張性コラーゲン溶液と細胞懸濁液の両方にコンドロイチン硫酸が含まれる形態：
魚類由来の可溶化コラーゲン及びコンドロイチン硫酸を含む細胞等張性コラーゲン溶液と、軟骨系細胞、細胞用培養液及びコンドロイチン硫酸を含む細胞懸濁液と、を構成要素として含むことを特徴とする軟骨細胞注入キット。
（ｄ）第二形態において、細胞等張性コラーゲン溶液にコンドロイチン硫酸が含まれる形態：
魚類由来の可溶化コラーゲン、哺乳類由来の可溶化コラーゲン及びコンドロイチン硫酸を含む細胞等張性コラーゲン溶液と、軟骨系細胞及び細胞用培養液を含む細胞懸濁液と、を構成要素として含むことを特徴とする軟骨細胞注入キット。
（ｅ）第二形態において、細胞懸濁液にコンドロイチン硫酸が含まれる形態：
魚類由来の可溶化コラーゲン及び哺乳類由来の可溶化コラーゲンを含む細胞等張性コラーゲン溶液と、軟骨系細胞、細胞用培養液及びコンドロイチン硫酸を含む細胞懸濁液と、を構成要素として含むことを特徴とする軟骨細胞注入キット。
（ｆ）第二形態において、細胞等張性コラーゲン溶液と細胞懸濁液の両方にコンドロイチン硫酸が含まれる形態：
魚類由来の可溶化コラーゲン、哺乳類由来の可溶化コラーゲン及びコンドロイチン硫酸を含む細胞等張性コラーゲン溶液と、軟骨系細胞、細胞用培養液及びコンドロイチン硫酸を含む細胞懸濁液と、を構成要素として含むことを特徴とする軟骨細胞注入キット。

（第二形態及び第三形態の特長）
第二形態及び第三形態は、第一形態に収縮抑制の特性を付与したものである。即ち、哺乳類由来の可溶化コラーゲンとコンドロイチン硫酸は、それぞれ単独で収縮抑制作用を発揮することができるものである。また、両者を併用したときには相乗効果の発揮までは期待し難いが、少なくともいずれか大きい方の収縮抑制作用を得ることができる。

（細胞等張性コラーゲン溶液）
細胞等張性コラーゲン溶液は、上記のように各形態において以下の要素を含む。
・第一形態、第三（ｂ）形態：魚類由来の可溶化コラーゲン。
・第二形態、第三（ｅ）形態：魚類由来の可溶化コラーゲン、哺乳類由来の可溶化コラーゲン。
・第三（ａ）（ｃ）形態：魚類由来の可溶化コラーゲン、コンドロイチン硫酸。
・第三（ｄ）（ｆ）形態：魚類由来の可溶化コラーゲン、哺乳類由来の可溶化コラーゲン、コンドロイチン硫酸。

細胞等張性コラーゲン溶液は、魚類単独、又は魚類及び哺乳類に由来の可溶化コラーゲンが溶解し、細胞と浸透圧が等しい液である。細胞等張性の付与のために、上記各形態において含有される要素を勘案した上で、適当な種類と量の塩等の化合物が含有されるようにすることが好ましい。当該化合物の種類は特に限定されることはないが、好適には無機塩であり、例えば、塩化ナトリウム、PBSなどの緩衝液の成分組成を有したもの等が挙げられる。細胞等張性コラーゲン溶液のpHについては、コラーゲンが線維化せずに可溶性が保たれる範囲内に設定する。

細胞等張性コラーゲン溶液中のコラーゲン濃度は、細胞懸濁液との混合比に応じて定まる軟骨細胞注入キット中のコラーゲン濃度（以下「最終コラーゲン濃度」という）に基づいて適宜選択すればよいが、コラーゲン濃度が高くなると粘度が高くなるため、適切な範囲を選択することが好ましい。細胞等張性コラーゲン溶液中のコラーゲン濃度は、例えば、10％以下であることが好ましく、より好ましくは6％以下である。

第二形態及び哺乳類由来の可溶化コラーゲンを含む第三形態において、細胞等張性コラーゲン溶液中の魚類由来の可溶化コラーゲンと哺乳類由来の可溶化コラーゲンの割合は、質量比として1：2〜3：1の範囲であることが好ましい。上記範囲よりも魚類由来の可溶化コラーゲンの割合が多くなると、経時的な収縮が起き易くなる傾向がある。一方、上記範囲よりも哺乳類由来の可溶化コラーゲンの割合が多くなると、ゲル化速度が遅くなる傾向があるため好ましくない。上記範囲は、1：1〜2：1の範囲であることがより好ましく、1：1であることがさらに好ましい。

（細胞懸濁液）
細胞懸濁液は、上記のように各形態において以下の要素を含む。
・第一形態、第二形態、第三（ａ）（ｄ）形態：軟骨系細胞、細胞用培養液。
・第三（ｂ）（ｃ）（ｅ）（ｆ）形態：軟骨系細胞、細胞用培養液、コンドロイチン硫酸。

細胞懸濁液は、細胞等張性が保持されるように細胞用培養液の組成を適宜調整することが好ましい。細胞懸濁液の作製方法として、上記第一形態、第二形態、第三（ａ）（ｄ）形態では軟骨系細胞と細胞用培養液を混合すればよく、さらにコンドロイチン硫酸を用いる上記第三（ｂ）（ｃ）（ｅ）（ｆ）形態では細胞用培養液とコンドロイチン硫酸とを混合した後、当該混合液に軟骨系細胞を添加・混合する方法が好ましい。

細胞懸濁液は、軟骨系細胞が細胞用培養液中で培養されたままの状態のものを用いてもよいし、解凍又は別途増殖させた軟骨系細胞を細胞用培養液と混合したものを用いてもよい。細胞懸濁液中の軟骨系細胞の細胞密度は特に限定はされるものではなく、治療方法等に応じて適宜設定すればよい。細胞密度として、例えば、1×10⁴〜1×10⁸cells/mlの範囲を例示できる。

（軟骨細胞注入キット中のコンドロイチン硫酸の総量）
コンドロイチン硫酸を含む形態においては、必要に応じて、細胞等張性が保持されるようにコンドロイチン硫酸の種類と量に応じた調整を行うことが好ましい。本発明の軟骨細胞注入キット中に含有されるコンドロイチン硫酸の総量は、他の要素との兼ね合いから上限は20質量％とすることが好ましい。例えば、0.1〜20質量％の範囲が好ましく、より好ましくは0.1〜10質量％の範囲であり、さらに好ましくは0.5〜5質量％の範囲である。

（魚類由来の可溶化コラーゲンの特長）
一般的な可溶化コラーゲン溶液と同様に、細胞等張性コラーゲン溶液も適度なイオン強度及びpHにして適度に加温するとゲル化が引き起こされる。魚類由来の可溶化コラーゲンは、線維化速度が特に速いため、注入型に特に適している。

（軟骨細胞注入キットの使用方法）
本発明の軟骨細胞注入キットの好適な使用方法の一形態は、用時調製的使用方法、即ち、細胞等張性コラーゲン溶液と細胞懸濁液とを混合した後に患部に注入する方法である。本使用方法において、線維化速度が速い魚類由来の可溶化コラーゲンを用いることの利点が活かされる。即ち、魚類由来の可溶化コラーゲンは、細胞懸濁液と接触したときに線維化条件の１つである適度なイオン強度及びpH環境下に置かれることになり、次に患部に注入されたときに体温で加温されることによって短時間でゲル化してコラーゲンゲルが生成する。そして、コラーゲンゲルによって包埋された軟骨系細胞が注入部位に固定されることが期待される。また、コラーゲンゲルは軟骨系細胞の足場として好適であるため、軟骨系細胞の増殖及び軟骨基質産生が起き、患部の修復が期待できるものである。尚、本使用方法において、患部に注入するまでは、両液及び混合液はコラーゲンが線維化しないように低温に保つことが望ましい。簡便には、冷蔵保存から取り出した直後のものを用いればよい。注入用器具としては、両液を注入用器具の注入部位において混合できるものを用いてもよい。

本発明の軟骨細胞注入キットにおける細胞等張性コラーゲン溶液と細胞懸濁液の量的割合については、両液を混合した後、加温によって魚類由来の可溶化コラーゲンがゲル化したときに、軟骨系細胞がコラーゲンゲルに包埋されるような割合に設定することが好ましい。例えば、細胞等張性コラーゲン溶液／細胞懸濁液の容積比（以下「液比」ともいう）は、5/1〜1/5の範囲とすることができるが、細胞等張性コラーゲン溶液中の魚類由来の可溶化コラーゲン／哺乳類由来の可溶化コラーゲンの質量比（以下「コラーゲン比」ともいう）の大小に応じて液比の設定範囲を変えることも好ましい態様である。一例として、(i)コラーゲン比が大きいときは液比を広い範囲、例えば5/1〜1/5の範囲に設定することができ、(ii)コラーゲン比が小さいときは液比の値が大きい範囲、例えば5/1〜1/1の範囲に設定することが好ましい。(i)においては2/1〜1/2の範囲がより好ましく、(ii)においては4/1〜2/1の範囲がより好ましい。

本発明の軟骨細胞注入キット中の最終コラーゲン濃度については、細胞等張性コラーゲン溶液中のコラーゲン濃度、及び細胞等張性コラーゲン溶液と細胞懸濁液の混合比を勘案し、さらに使用方法に応じて適宜設定することが望ましい。目安としては、0.3〜8％の範囲内が好ましく、1〜3％の範囲内がさらに好ましい。前記用時調製的使用方法においても、最終コラーゲン濃度として上記好適範囲を適用することができ、とりわけ、適正なゲル化速度等の作用が得られる濃度以上であって、患部への注入時において多大な注入力による作業者への過負荷とそれに伴う軟骨系細胞への圧迫による細胞ダメージが生じない濃度以下とすることが望ましい。

（原料）
以下、本発明の軟骨細胞注入キットに用いる各種原料について説明する。

（魚類由来の可溶化コラーゲン）
魚類由来の可溶化コラーゲンは、コラーゲン含有組織から公知の方法によって取得することができるものであり、例えば、[1]希酸により抽出する方法によって得られる酸可溶化コラーゲン、[2]酵素で可溶化処理する方法によって得られる酵素可溶化コラーゲン、[3]アルカリで可溶化処理する方法によって得られるアルカリ可溶化コラーゲン等が挙げられる。好適には、コラーゲンの抗原決定基であるテロペプタイドを除去することが可能な[2]又は[3]の方法により取得されたものである。尚、ペプチド、アミノ酸、ゼラチン等が一部混入していても構わないが、それらは極力排除されていることが好ましい。

魚類由来の可溶化コラーゲンの中でも各種用途への適用性の観点から変性温度が比較的高いものが好ましく、好例はオレオクロミス属由来のコラーゲンである。オレオクロミス属の中でも中国から東南アジアにかけて食用として主力に養殖されており入手が容易であるティラピアが特に好ましい。コラーゲンのタイプについても特に制限は無いが、生物体内での存在量が多いＩ型が好ましく、必要に応じてＩＩ型を併用しても構わない。コラーゲンの採取組織としては、皮、鱗等があるが、これらに限定されるものではない。

ここで、前記[2]の酵素可溶化コラーゲンの取得法について説明する。取得法は、特に限定されることはなく、常法に従えばよい。例えば、特許第４８６３４３３号公報又は特許第５６９２７７０号公報等に記載の方法を挙げることができる。取得法の一態様を鱗の例で簡単に説明すると、酸によって脱灰した鱗をペプシン等のプロテアーゼを用いて処理することによりコラーゲンをアテロ化し、必要に応じて精製処理を行うことで酵素可溶化コラーゲンを取得することができる。精製処理には、例えば、塩析法又は特許第５５２２８５７号公報に記載のpHが7以下の活性炭を用いる方法を適用することができる。

（哺乳類由来の可溶化コラーゲン）
哺乳類由来の可溶化コラーゲンは、皮、骨、腱等のコラーゲンを多く含む原料から公知の方法によって取得することができるものである。例えば、原料に脱脂、脱灰等の前処理を施した後、魚類由来の可溶化コラーゲンに関する説明で挙げた上記[1]〜[3]のいずれかを適用することによって取得することができるが、好適には上記[2]又は[3]の方法により取得されたものである。

（軟骨系細胞）
軟骨系細胞は、動物由来のものであり、動物の種類として、例えば、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、哺乳類等が挙げられるが、注入対象動物と同じ種に属する動物由来のものを用いることが望ましい。より好適には、注入対象動物自身（ヒトで云えば患者自身）から採取した、即ち、自家細胞であるところの軟骨系細胞である。本発明においては、軟骨系細胞には純粋な軟骨細胞は勿論のこと、軟骨細胞と同等の機能を有する軟骨様細胞も含まれるものとする。尚、以下で説明する「軟骨細胞への分化能を有する細胞」と「軟骨細胞」においては特に言及しないが、軟骨様細胞も含まれるものである。

軟骨細胞への分化能を有する細胞としては、幹細胞が代表例として挙げられる。幹細胞には、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性幹細胞（ES細胞）等が挙げられるが、治療法に適した細胞種を選択することが好ましい。

軟骨細胞としては、軟骨細胞への分化能を有する細胞から軟骨細胞に分化させたものを用いてもよいし、組織から採取したものを用いてもよい。組織から採取するときの軟骨の種類は、硝子軟骨、線維性軟骨及び弾性軟骨のいずれであってもよい。組織から軟骨細胞を採取・調製する方法は、常法にしたがって行えばよい。注入後の修復を考慮すると、非荷重部の軟骨から採取した関節軟骨細胞を用いることが好ましい。また、採取・調製した軟骨細胞は、細胞数確保の観点から、一旦増殖させてから用いることが好ましい。

（細胞用培養液）
細胞用培養液は、注入する軟骨系細胞に適した培養液であれば特に限定されることなく用いることができる。例えば、軟骨細胞の培養液としては、DMEM（ダルベッコ変法イーグル培地）が好適である。また、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞（iPS細胞）及び胚性幹細胞（ES細胞）には、それぞれの幹細胞に適した市販の培地又は独自に調合した培地を用いればよい。

（コンドロイチン硫酸）
コンドロイチン硫酸としては、コンドロイチン硫酸の塩を用いてもよく、好例はナトリウム塩である。コンドロイチン硫酸は、コンドロイチン硫酸Ａ〜Ｅのいずれであっても構わないが、好適にはコンドロイチン硫酸Ａ又はＣであり、より好適にはコンドロイチン硫酸Ｃである。

（第三要素）
本発明の軟骨細胞注入キットには、本発明の効果を損なわない範囲内において、その他要素（以下「第三要素」という）を含んでもよい。第三要素としては、例えば患部へのコラーゲンゲルの固着を促すために糊性を有するものであることが好ましいが、これに限定されるものではない。第三要素の具体例として、フィブリン、トロンビン、ゼラチン、ヒアルロン酸、アルギン酸等が挙げられる。第三要素の適用方法として、患部への注入前の細胞懸濁液と細胞等張性コラーゲン溶液との混合液に第三要素を添加・混合する方法、患部においてコラーゲンのゲル化が誘導されたところに第三要素を添加する方法等を例示することができるが、これ以外の方法も用いることができる。

以下に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。尚、実施例において％は、特に断らない限り全て質量％を示す。

（魚類由来の可溶化コラーゲン）
ティラピアの鱗から製造された多木化学（株）製「AQ-03LE」を凍結乾燥した後、生理食塩水（大塚製薬（株）製「大塚生食注」）に溶解しpH調整を行い、コラーゲン濃度3％、pH3.3、無色透明の魚類由来の可溶化コラーゲン（以下「うろこコラーゲン」という）を含有した溶液を調製した。うろこコラーゲン溶液は細胞等張性を有するものである。

（哺乳類由来の可溶化コラーゲン）
ウシの真皮から製造されたコラーゲン濃度3％の（株）高研製「コーケンアテロコラーゲンインプラント（登録商標）」を無色透明の哺乳類由来の可溶化コラーゲン（以下「牛コラーゲン」という）として用いた。牛コラーゲン溶液は細胞等張性を有するものである。

（軟骨細胞）
軟骨細胞は、ウサギ（日本白色家兎）の膝、股、肩関節から関節軟骨を採取し、トリプシンＥＤＴＡ溶液及びコラゲナーゼ溶液で酵素処理を行い、軟骨細胞を分離・回収したものを用いた。

（細胞用培養液）
細胞用培養液は、１０％FBS（ウシ胎児血清）含有DMEMを用いた。尚、細胞培養液には、抗生物質、緩衝液等を適宜添加している。

（コンドロイチン硫酸）
コンドロイチン硫酸は、生化学工業（株）製「コンドロイチン硫酸ナトリウム ND-K」を用いた。

〔ゲル化時間の確認実験〕
表１に示した組成で細胞等張性コラーゲン溶液を調製した。尚、２系〜４系では、うろこコラーゲンと牛コラーゲンを混合することにより調製した。また、細胞懸濁液として、細胞用培養液とコンドロイチン硫酸の混合液を用いた。本実験では軟骨細胞を使用しなかったが、これは軟骨細胞の有無はゲル化時間にあまり影響を及ぼさないからである。尚、細胞用培養液中のコンドロイチン硫酸の濃度は3％とした。

細胞等張性コラーゲン溶液と細胞懸濁液をシリンジと三方活栓からなる器具を用いて混合し、混合直後から37℃環境下における吸光度（400nm）を経時的に測定した。

ここで、吸光度とゲル化の関係について簡単に説明する。可溶化コラーゲン溶液は一般には透明であり、ゲル化が進行すると白濁化が引き起こされ、完全にゲル化すると白色を呈する。そして、完全にゲル化した後は、白色の状態が維持される。吸光度の測定において、ゲル化の進行に伴い吸光度値が上昇し、完全にゲル化した後は吸光度値の変化がなくなる。

結果を図１に示した。図１の凡例では、細胞等張性コラーゲン溶液：細胞懸濁液の混合割合を「コラーゲン液：懸濁液」として示した（以下の図でも同様）。

測定結果は、それぞれの系における最終測定値を1とし、ブランクを0とする相対値を用いた。細胞懸濁液と細胞等張性コラーゲン溶液の混合直後の混合液は透明であったが、１〜４系の測定値がプラトー（横ばいの状態）となったときは完全にゲル化し白色を呈していた。一方、５系では６０分後でも完全には白色を呈しておらず、６０分では完全なゲル化が完了していないことが観察された。

図１より、うろこコラーゲンの割合が多いほどゲル化時間が短いことが分かった。また牛コラーゲンのみではゲル化までの時間が相当かかることが分かった。

〔細胞培養実験１〕
表２に示した組成で細胞等張性コラーゲン溶液を調製した。また、細胞懸濁液として、コンドロイチン硫酸を含まない軟骨細胞及び細胞用培養液の混合液（CS濃度0％）、及び細胞懸濁液中のコンドロイチン硫酸の濃度が3％である軟骨細胞、細胞用培養液及びコンドロイチン硫酸の混合液（CS濃度3％）を用いた。尚、軟骨細胞の適用量は、細胞培養における細胞の播種密度が3×10⁴cells/mlとなるように設定した。また、CS濃度3％は、細胞等張性が保持される範囲内であったため、塩類濃度調整は行わなかった。

細胞等張性コラーゲン溶液と細胞懸濁液を2：1の容積比でシリンジと三方活栓からなる器具を用いて混合し、これをフッ素樹脂製モールド（φ12mm、厚み1.9mm）に0.2ml注入し膜状に成形した。これを37℃環境下で30分間程度放置しゲル化させ、成形膜を得た。次に、成形膜を6ウェルプレートのウェル内に置き、細胞用培養液3mlを注入した。このとき、成形膜は細胞用培養液中に浸漬した。14日間培養し、各ウェルの細胞数と総グリコサミノグリカン（GAG）量を測定した。

結果を図２に示した。左図は、播種細胞数を1としたときの細胞増殖率を示したものであり、右図は総GAG量の測定値を示したものである。図２中の「No.」は表２のNo.に対応し、CSの「-」と「+」はCS濃度0％と3％にそれぞれ対応する。また、「うろこ：牛」は、細胞等張性コラーゲン溶液中のうろこコラーゲンと牛コラーゲンの混合割合を意味する（以下の図でも同様）。

図２より、No.１は細胞増殖率は低かったものの総GAG量が高かったことより、軟骨基質産生の足場材料として有用であることが分かった。また、No.２〜６は細胞増殖率が高く総GAG量も高かったことより、細胞増殖及び軟骨基質産生の足場材料として有用であることが分かった。一方、No.７は細胞増殖の高さの割には総GAG量が少なく、また図１の結果も合わせて考えると軟骨細胞注入キットには適していないと判断した。

また、培養終了後の成形膜の形状を観察したところ、No.１は収縮が大きかったが、コンドロイチン硫酸を添加したNo.２は、No.１よりも収縮が抑制されていた。一方、No.３とNo.４は、収縮がかなり抑制されており、No.５〜No.７ではほとんど収縮していなかった（図３参照）。

〔細胞培養実験２〕
表３に示した組成で細胞等張性コラーゲン溶液を調製した。また、細胞懸濁液として、細胞懸濁液中のコンドロイチン硫酸の濃度が3％である軟骨細胞、細胞用培養液及びコンドロイチン硫酸の混合液（CS濃度3％）を用いた。尚、軟骨細胞の適用量は、細胞培養における細胞の播種密度が3×10⁴cells/mlとなるように設定した。細胞等張性コラーゲン溶液と細胞懸濁液の混合割合を表３に示した。

細胞等張性コラーゲン溶液と細胞懸濁液の混合から細胞培養までの一連の手順は細胞培養実験１と同様にした。培養16日後に、各ウェルの細胞数と総グリコサミノグリカン（GAG）量を測定した。

結果を図４に示した。左図は、播種細胞数を1としたときの細胞増殖率を示したものであり、右図は総GAG量を示したものである。図４中のNo.は表３のNo.に対応する。

図４より、No.１１〜１６のいずれにおいても、高い細胞増殖率と総GAG量が得られたことが分かった。

また、培養終了後の成形膜の形状を観察したところ、いずれも収縮は抑制されていたが、特にNo.１３〜No.１６ではほとんど収縮していなかった（図５参照）。

〔動物実験〕
軟骨細胞注入キットに用いた材料は、実施例において前述した、うろこコラーゲン、牛コラーゲン及び細胞懸濁液である。この細胞懸濁液は、上記〔細胞培養実験２〕と同じく、軟骨細胞、細胞用培養液及びコンドロイチン硫酸の混合液であり、細胞懸濁液中のコンドロイチン硫酸濃度は3％である。

対照群は無注入とし、試験群１及び２では軟骨細胞注入キットによる注入をおこなった。試験群１及び２における細胞等張性コラーゲン溶液の組成及び細胞等張性コラーゲン溶液と細胞懸濁液の混合割合を表４に示した。

各群のn数は2とし、麻酔下の日本白色家兎（20週齢）の一方の大腿骨滑車部にφ5mm・深さ約2mmの全層欠損を作製した。試験群１及び２では、細胞等張性コラーゲン溶液と細胞懸濁液をシリンジと三方活栓からなる器具を用いて混合し、これを欠損部に注入し、充填させた（以下「充填材料」という）。このとき、試験群１及び２における軟骨細胞の欠損部への適用量がおよそ6×10³cellsとなるように、軟骨細胞注入キットの設計をおこなった。尚、注入した軟骨細胞は、実験に供試した日本白色家兎にとって他家細胞である。

上記充填後、充填材料のゲル化の進行を確認し、充填の約30分後に縫合により閉創した。対照群も、試験群と同様の時間の経過後の縫合により閉創した。尚、縫合をおこなうまでの間、患部に対し保温・止血等の適切な措置を施した。

上記施術4週間後に屠殺し、移植部位を観察した。図６に欠損部の外観を示した。充填材料が脱落することなく欠損部にとどまっていたことを目視により確認した。欠損部を組織観察に供するため、常法によるヘマトキシリン・エオジン（HE）染色とサフラニンO染色を施した。

図７は、試験群１における欠損部のHE染色であり、図８は、試験群２における欠損部のHE染色である。図７及び図８より、再生された軟骨組織中に軟骨細胞が広範に存在し、特に表面付近に多数存在することが示された。また、充填材料と自家組織の境界面においては、剥離部分が無く、良好に接着していることが示された。

図９にサフラニンO染色による欠損部の組織切片を示した。対照群では軟骨組織は再生されず、染色部位は殆ど認められなかったが、試験群１及び２では、欠損部がサフラニンOによって赤く染色した軟骨基質によって充足されており、軟骨組織が再生されたことが示された。

Claims (4)

1. 魚類由来の可溶化コラーゲンを含む細胞等張性コラーゲン溶液と、
   軟骨細胞又は軟骨細胞への分化能を有する細胞及び細胞用培養液を含む細胞懸濁液と、
   を構成要素として含むことを特徴とする軟骨細胞注入キット。
   ただし、上記軟骨細胞注入キットは、上記両液を注入用器具において混合した後に患部に注入する方法に用いるものである。
2. さらに、前記細胞等張性コラーゲン溶液が、哺乳類由来の可溶化コラーゲンを含むものである請求項１記載の軟骨細胞注入キット。
3. 前記細胞等張性コラーゲン溶液中の魚類由来の可溶化コラーゲンと哺乳類由来の可溶化コラーゲンの質量比が、1：2〜3：1の範囲である請求項２記載の軟骨細胞注入キット。
4. さらに、細胞等張性コラーゲン溶液及び細胞懸濁液のうちいずれか一方又は双方が、コンドロイチン硫酸を含むものである請求項１〜３のいずれか１項記載の軟骨細胞注入キット。