CN110624134A

CN110624134A - 一种负载鹿茸多肽的ⅰ型/ⅲ型胶原软骨修复支架

Info

Publication number: CN110624134A
Application number: CN201910939229.4A
Authority: CN
Inventors: 王建华; 黄晨光; 王营营; 陈杨燕; 陈立
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2019-12-31

Abstract

本发明公开一种负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架。该支架以牛源型胶原蛋白、人重组

Description

一种负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架

技术领域

本发明属于生物医用技术领域，具体涉及一种负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架及其制备方法。

背景技术

关节软骨是一种极复杂的表面光滑且富有光泽的透明样软骨结缔组织，其在关节活动中主要起负重和运动作用。关节软骨生理性的正常老化过程开始于20岁以后，随年龄增加而发展，软骨在化学成分、组织学表现、合成和退变活动等方面发生一系列改变。当软骨发生损伤后，其营养汲取受限，组织缺乏供血，会导致损伤部位病情逐渐恶化，最终可发展为膝骨性关节炎（Knee osteoarthritis，KOA），严重影响了患者的生活和健康。近年来研究表明，软骨组织工程修复技术对软骨再生及修复具有重要意义。因此，从恢复软骨损伤这一根本因素入手，通过组织工程方法，制备一种能取代自体或异体软骨移植的可诱导软骨原位再生的活性支架材料，可能是治疗软骨缺损的一种有效途径。

胶原是细胞外基质（ECM）的主要成份，其被广泛应用在软骨修复材料中。Ⅰ型胶原具有诱导软骨细胞合成Ⅱ型胶原的作用。Ⅰ型胶原还是纤维形成胶原，它的三维网状结构是其产生、分泌和储存Ⅱ型胶原蛋白以及新生软骨细胞外基质内矿物沉积的关键，其支架材料被证明能加快细胞粘附、迁移，促进软骨损伤自我修复。重组人源型胶原蛋白在结构、特性等方面与人类自身胶原蛋白高度一致，并具有良好的生物相容性、细胞黏附性，可为细胞提供充足的养分促进新细胞的形成。Ⅲ型胶原在骨髓发育中的关键作用体现在软骨和骨形成前的间充质干细胞凝聚过程，以及促进间充质干细胞分化为成骨或软骨细胞的潜能。Ⅲ型胶原在成人软骨细胞外基质中存在未加工的n-肽类胶原蛋白分子，它作为共价交联聚合物广泛地与Ⅱ型胶原交叉连接，包覆Ⅱ型胶原的表面以增加被软骨缺损削弱的Ⅱ型胶原网络结构框架。目前的研究结果已证实了其促进软骨缺损修复作用。

鹿茸多肽（PAP）具有强筋骨、益精血、提高人体免疫力、促进骨及软骨愈合等作用，其富含鹿茸胰岛素样生长因子（IGF-1）、鹿茸生长激素（HCH）、鹿茸促生长释放因子（GHRF），鹿茸神经生长因子（NGF）、鹿茸表皮生长因子（EGF）、鹿茸成纤维生长因子（FGF）等鹿茸活性肽成份。体外实验表明PAP可促进骨髓间质细胞的增殖、分化以及软骨细胞、成纤维细胞、表皮细胞的增殖和抑制凋亡、抗衰老作用。对于软骨细胞，PAP中富含的多种生长因子和其它活性成分能有效刺激软骨细胞增殖，在适宜条件下可促进BMSCs定向分化为软骨细胞，同时延缓或逆转软骨细胞的凋亡。

本发明综合天然Ⅰ型胶原和人重组Ⅲ型胶原各自在软骨缺损修复中的作用和优势，并结合鹿茸多肽对软骨修复的促进作用，制备一种可用于软骨缺损修复的修复支架。它通过释放所负载的鹿茸多肽、并协同Ⅰ型/Ⅲ型胶原共同促进软骨组织再生从而达到软骨缺损修复的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架。所制备的修复支架，具有良好的生物相容性、可降解性和免疫原性低的特点，能有效促进软骨的再生性修复，是一种较好的适用于关节软骨损伤修复的医用材料。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架的制备方法，包括如下步骤：

（1）分别将型胶原蛋白、型胶原蛋白溶于乙酸中制备成一定浓度的型胶原蛋白溶液和型胶原蛋白溶液；

（2）将步骤（1）所得的型胶原蛋白溶液和型胶原蛋白溶液混合，搅拌均匀得混合溶液；

（3）制备包载鹿茸多肽的壳聚糖微球；

（4）将步骤（3）制备的包载鹿茸多肽的壳聚糖微球按1.5 mg/mL加入到步骤（2）所得混合溶液中，磁力搅拌过夜，冷冻干燥后浸泡在交联剂中进行交联；

（5）交联后反复用去离子水清洗，二次冷冻干燥即得用于骨关节软骨缺损修复的修复支架。

上述步骤（1）中型、型胶原蛋白溶液的浓度均为0.8wt%。

上述步骤（2）的混合溶液中型胶原蛋白溶液与型胶原蛋白溶液质量比为1:1，1:2，1:3，2:1，3:1中的一种。

进一步的，所述型胶原蛋白源于牛腱，所述型胶原蛋白源于利用基因工程经过酵母菌发酵得出的人重组型胶原蛋白。

上述步骤（3）中所述包载鹿茸多肽的壳聚糖微球的制备方法，包括以下步骤：

（1）准确称取0.1 g脱乙酰度为95%，黏度为 50–800 mPa·s的壳聚糖，溶于10 mL浓度为3wt%的冰醋酸中，制得壳聚糖溶液，置于4℃冰箱密封保存备用；

（2）准确称量50 mL石蜡溶液和1.5 mL司班80溶液置于100 mL三颈瓶中，使其在60℃，800 r/min的水浴锅中进行机械搅拌，形成混合溶液；

（3）再准确称取5 mL步骤（1）制得的壳聚糖溶液，然后逐滴加入到步骤（2）的混合溶液中，使其持续搅拌90 min；

（4）取1mL，25wt%的戊二醛溶液加入到搅拌90 min后的步骤（3）的溶液中，然后再持续搅拌10 min；

（5）将步骤（4）所得乳液充分离心，弃上清液，再用石油醚反复冲洗离心4次，冷冻干燥，于-20℃下避光保存。

上述步骤（4）中所述交联剂为1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺（EDC）、N-羟基丁二酰（NHS）溶于90vol%乙醇溶液中制得，其中EDC和NHS的最终浓度分别为20 mmol/L，50 mmol/L。

一种上述方法制备所得的负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架。

负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架在修复软骨缺损中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1. 本发明制备的负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架呈三维网状结构，具有良好的孔隙率和溶胀率，同时具有良好的生物相容性、无毒性、可降解性和低免疫原性，制备过程简便，价廉易得。其孔隙率和溶胀率可分别高达84.9 %和40.6 %，是一种较好的适用于中、早期骨关节炎软骨缺损修复的医用材料。

2. 本发明所制备的修复支架可用于修复软骨缺损，在动物实验中已经证明了其具有良好的修复软骨缺损的效果。

附图说明

图1是实施例1制备的修复支架中所负载鹿茸多肽壳聚糖微球的扫描电镜图。

图2是负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架的扫描电镜图，1:0、1:1、1:2、1:3、2:1、3:1分别代表支架中型：型胶原蛋白的质量比为1:0、1:1、1:2、1:3、2:1、3:1的修复支架。

图3是实施例1-实施例5制备的负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架孔隙率图。

图4是实施例1-实施例5制备的负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架吸水溶胀率图。

图5是实施例10中A、B、C和D组4、8、12和16 周时组织学检测中的HE染色图。4W、8W、12W、16W分别表示4、8、12和16 周。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

实施例1

一种负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架的制备，包括以下步骤：

（1）称取0.8 g，牛腱型胶原冻干粉，加入99.2 mL浓度为0.1vol% 的冰醋酸溶液配成质量分数为0.8%的型胶原溶液，放置在磁力搅拌器上搅拌溶解6小时；称取0.4g人重组型胶原蛋白，溶于50 mL浓度为0.1vol% 的冰醋酸溶液中，放置在磁力搅拌器上搅拌溶解6小时，制备质量分数为0.8%的人重组型胶原蛋白溶液。

（2）将0.8 %的牛腱型胶原蛋白溶液和0.8%的人重组型胶原蛋白溶液按1：1的质量比加入50 mL烧杯中，放在磁力搅拌器上搅拌过夜，得混合溶液。

（3）准确称取0.1 g 壳聚糖（脱乙酰度为95%，黏度为 50–800 mPa·s ），溶于10mL，3vol%的乙酸中，置于4℃冰箱密封保存备用；准确称量50 mL石蜡溶液和1.5 mL司班80溶液置于100 mL三颈瓶中，使其在60℃，800 r/min的水浴锅中进行机械搅拌；再准确称取5 mL步骤所述壳聚糖溶液，然后逐滴加入到步骤所述装置中，使其持续搅拌90min；取1mL，25wt%的戊二醛溶液加入到搅拌90 min后的步骤所述装置中，然后再持续搅拌10 min；将步骤所得乳液充分离心，弃上清液，再用石油醚反复冲洗离心4次，冷冻干燥，制得包载鹿茸多肽的壳聚糖微球，于-20℃下避光保存。

（4）将步骤（3）制备的包载鹿茸多肽的壳聚糖微球按1.5 mg/mL加入到步骤（2）制备的混合液中，磁力搅拌过夜，冷冻干燥后浸泡在交联剂中进行交联，所述交联剂为1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺（EDC）、N-羟基丁二酰（NHS）溶于90vol%乙醇溶液中制得，其中EDC和NHS的最终浓度分别为20 mmol/L, 50 mmol/L；

（5）交联后反复用去离子水清洗，二次冷冻干燥即得到负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架，记为复合材料A。

实施例1制备的修复支架中所负载鹿茸多肽壳聚糖微球的扫描电镜图见图1。

实施例2

改变步骤（2）中0.8 %的牛腱型胶原蛋白溶液、0.8 % 人重组型胶原蛋白溶液的质量比为1：2，其他步骤与实施例1相同，制备复合材料B。

实施例3

改变步骤（2）中0.8 %的牛腱型胶原蛋白溶液、0.8 % 人重组型胶原蛋白溶液的质量比为1：3，其他步骤与实施例1相同，制备复合材料C。

实施例4

改变步骤（2）中0.8 %的牛腱型胶原蛋白溶液、0.8 % 人重组型胶原蛋白溶液的质量比为2：1，其他步骤与实施例1相同，制备复合材料D。

实施例5

改变步骤（2）中0.8 %的牛腱型胶原蛋白溶液、0.8 % 人重组型胶原蛋白溶液的质量比为3：1，其他步骤与实施例1相同，制备复合材料E。

实施例6

删除步骤（1）和步骤（2）中制备和添加人重组型胶原蛋白溶液部分，其他步骤与实施例1相同，制备型：型胶原蛋白的质量比为1:0的支架材料。

实施例7

删除步骤（3）和步骤（4）中添加的壳聚糖微球，其他步骤与实施例1相同，制备复合材料F。

负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架的扫描电镜图见图2；图中1:0、1:1、1:2、1:3、2:1、3:1分别代表支架中型：型胶原蛋白的质量比为1:0、1:1、1:2、1:3、2:1、3:1的修复支架。

实施例8

负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架的孔隙率测试：

将实施例1-实施例5制备的干燥负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架分别用打孔器打孔，直径为5 mm，厚度为5 mm，称其质量W1，浸入等量乙醇溶液中，放在37℃恒温水浴中浸泡，24 h后取出，吸干表面多余乙醇溶液，称其重量W0。按下式计算孔隙率，实验平行3次，取平均值。

孔隙率（%）= 4（W0- W1）/ρπd²h×100%

式中W1为材料干重（mg），W0为吸乙醇后材料湿重（mg），ρ为乙醇的密度，d为支架直径，h为支架高度。

结果见图3。由图可知，上述5个实施例制备的负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架都具有较高的孔隙率，其中C的孔隙率最高，高达84.9%。

实施例9

负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架的吸水率测试：

将实施例1-实施例5制备的干燥负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架分别用打孔器打孔，直径为5 mm，厚度为5 mm，称其质量W1，浸入PBS (PH=7.4)，放在37 ℃水浴中溶胀，24 h后取出，吸干表面水分，称其重量W0，按下式计算吸水率，实验平行3次，取其平均值。

吸水溶胀率（%）=（W0- W1）/W1×100％

式中W1为材料干重(mg)，W0为溶胀后材料湿重(mg)。

结果见图4。由图可知，上述5个实施例制备的负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架都具有较高的吸水性，其中A的吸水率最高，高达40.6%。

实施例10

负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架的动物在体试验：

手术操作：清洁级新西兰兔24只，随机分成4组，每组6只，共48例关节。实验组（A组）：缺损处移植实施例6制备的复合材料F；实验组（B组）：缺损处移植实施例1制备的复合材料A；缺损组（C组）：缺损处不做处理；空白对照组（D组）：无缺损的正常组。分组后用速眠新Ⅱ（0.3 mL/kg）麻醉后构建膝关节软骨及软骨下骨缺损模型，缺损区直径4 mm，深度约4 mm。

按照分组，将经γ射线灭菌后的修复支架复合材料植入上述关节软骨缺损模型中，切口逐层缝合。术后每只动物肌肉注射15 万单位青霉素钠，连续7 天，以防感染。

术后观察和标本处理：分别于术后4、8、12、16 周，耳缘静脉注射过量速眠新Ⅱ处死实验动物6只（共12例关节，每组3例），行大体观察、HE染色、阿尔新蓝染色、甲苯胺蓝染色、番红O-固绿染色。

结果：与未负载鹿茸多肽的修复支架组（A组）相比，负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架组（B组）在16周时缺损部位完全被填充且与周围组织界限难以辨别，与模型对照组（C组）和未负载鹿茸多肽的修复支架组（A组）比较均有显著性差异（图5）。表明负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架能有效修复动物膝关节软骨缺损。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（3）制备包载鹿茸多肽的壳聚糖微球；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中型、型胶原蛋白溶液的浓度均为0.8wt%。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中型胶原蛋白源于牛腱，型胶原蛋白源于利用基因工程经过酵母菌发酵得出的人重组型胶原蛋白。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）的混合溶液中型胶原蛋白溶液与型胶原蛋白溶液质量比为1:1，1:2，1:3，2:1，3:1中的一种。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中所述包载鹿茸多肽的壳聚糖微球的制备方法，包括以下步骤：

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中所述交联剂为1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺（EDC）、N-羟基丁二酰（NHS）溶于90vol%乙醇溶液中制得，其中EDC和NHS的最终浓度分别为20 mmol/L， 50 mmol/L。

7.一种如权利要求1至6所述制备方法制得的负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架。

8.如权利要要求7所述负载鹿茸多肽的Ⅰ型/Ⅲ型胶原软骨修复支架在修复软骨缺损中的应用。