CN111184917A - 一种负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于骨关节软骨缺损修复的负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶及其制备方法。该温敏胶原基水凝胶以N‑乙烯基己内酰胺、甲基丙烯酸、重组人源Ⅲ型胶原蛋白、生物活性多肽和PLGA等为原料制成，具有生物相容性好、细胞附着能力强、无毒性、可降解性和无免疫原性的特点，对动物软骨缺损有良好的修复作用。其利用温敏胶原基水凝胶的可注射性，Ⅲ型胶原蛋白的增弹性以及促软骨分化潜能，再结合生物活性多肽对关节软骨损伤修复的促进作用，使其成为一种符合目前需求、能极好的适于临床软骨缺损修复及治疗的组织再生材料。

Description

一种负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用领域，具体涉及一种用于骨关节软骨缺损修复的负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶及其制备方法。
背景技术
关节软骨自我修复能力低下，若长期缺乏治疗将会导致损伤部位病情逐渐恶化，最终可发展为膝骨性关节炎（Knee osteoarthritis，KOA），严重影响患者的生活质量。现如今治疗软骨缺损的传统疗法主要包括：关节软骨磨削成形术、关节清创术、软骨下骨钻孔术、微骨折术、自体骨软骨移植术等，这些传统疗法虽能在一定程度上修复受损的软骨，但需要手术开刀，往往令许多患者对此感到恐惧。因而无需开刀就能治疗软骨疾病的疗法成了当代的迫切需要。从治疗软骨疾病这一根本因素入手，通过组织工程构建一种可注射的智能材料正好能满足当下的需求。
温敏水凝胶是一种有前景的可注射水凝胶，其温度敏感性的原理是基于亲水基团和疏水基团的微妙平衡。N-乙烯基己内酰胺是合成聚N-乙烯基己内酰胺系列温度敏感高聚物的重要中间体。聚N-乙烯基己内酰胺高聚物以及N-乙烯基己内酰胺的共聚物均具有众多优点，如良好的离子型水溶性、热敏性、生物相容性、高吸收能力，以及处在生理温度范围（30-40℃）内的相转变温度。前期研究表明，N-乙烯基己内酰胺自聚较难得到37℃相转变温度以下的高聚物，难以实现其医学价值。通过将含亲水基团的甲基丙烯酸与N-乙烯基己内酰胺共聚能降低聚合物的相转变温度至37℃以下，从而使其适用于医学领域。
Ⅲ型胶原是天然软骨基质的成分之一，以结合N末端前肽二硫键的形式存在于软骨内，虽含量较少，但在软骨发生退行性病变早期存在异常减少，中后期异常增多，与软骨的病变密切相关。Ⅲ型胶原是一种细纤维，能够增强组织的弹性和完整性，在骨髓发育中，能促进间充质干细胞凝聚和分化成骨或软骨细胞的潜能。重组人源Ⅲ型胶原蛋白不仅具有天然Ⅲ型胶原蛋白的生物学特性，还附带自身特性，如：低免疫原性、无病毒隐患、极好的水溶性和可加工性强等优点，是组织工程中的理想添加材料。鹿茸多肽（PAP）富含多种细胞生长因子，具有促进伤口愈合、抗氧化、抗炎和提高免疫力等功效，并能通过抑制β半乳糖苷酶的表达从而限制软骨细胞复制性老化的现象。在特定培养条件下能促使骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化，对软骨细胞的增值和表型也具有促进作用。
现在技术中关于胶原基温敏水凝胶已有相关研究，例如中国专利CN 107540744A公开了一种重组胶原蛋白及其温敏水凝胶，通过将重组胶原蛋白、壳聚糖和甘油磷酸钠反应，制备出适合关节滑膜修复的温敏水凝胶。然而该专利中没有涉及细胞毒性的研究，也没有开展软骨组织的修复研究，对于重组胶原蛋白不同亚型的作用没有深入开展。中国专利CN 103751102A公开了一种胶原酶温敏水凝胶及其制备方法和应用，其中包含水凝胶和胶原酶多糖颗粒，然而该专利用于手掌腱膜挛缩症的治疗，没有涉及到关节软骨的修复，并且其体外释放天数只有7天。中国专利CN 105664250A公开了一种可注射可降解温敏性水凝胶及其治备方法，通过添加多种天然高分子（海藻酸钠、壳聚糖、胶原和透明质酸）使该水凝胶可生物降解，该水凝胶主体是聚N-异丙基丙烯酰胺，但张文晶等研究表明（张文晶, 毛峥伟, 高长有. PNIPAM微凝胶微粒的制备、表征及其与细胞的相互作用. 第九届全国高聚物分子与结构表征学术讨论会论文集.杭州, 2014: 343-344）：采用NIPAM、聚乙二醇二丙烯酸酯和丙烯酸沉淀聚合法制备了具有热响应体积膨胀能力的交联聚异丙基丙烯酰胺（PNIPAM）微凝胶粒子，该微凝胶颗粒在25 °C时对细胞有一定的细胞毒性，而该专利没对混合水凝胶进行细胞毒性研究，且未提及具体组织修复领域。
鉴于上述现有技术的不足及研究过程中发现的聚合N-乙烯基己内酰胺较PNIPAM具有更好的生物相容性，且水解不会产生有毒物质。本发明综合温敏高聚物的可注射性、Ⅲ型胶原对组织的增弹性与促软骨分化潜能，并结合生物活性多肽对软骨修复的促进作用，制备了一种可用于软骨缺损修复的温敏水凝胶。将它通过非开刀法注射入软骨缺损处，缓慢释放所负载的生物活性多肽，并协同Ⅲ型胶原共同促进软骨组织再生，从而达到软骨缺损修复的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于骨关节软骨缺损修复的负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶，其具有可注射性、良好的生物相容性、可降解性和无免疫原性等特点，能有效促进软骨的再生性修复，是一种适用于关节软骨损伤修复的较好的医用材料。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于骨关节软骨缺损修复的负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶，其是以甲基丙烯酸、N-乙烯基己内酰胺、重组人源Ⅲ型胶原蛋白和鹿茸多肽为主要原料制得。
所用重组人源Ⅲ型胶原蛋白是利用基因工程经过酵母菌发酵得到的产物。
所述的负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶的制备方法包括如下步骤：
（1）将N-乙烯基己内酰胺、过硫酸铵和重组人源Ⅲ型胶原蛋白分别溶于去离子水中，制成质量浓度为4 %的N-乙烯基己内酰胺水溶液、质量浓度为10 %的过硫酸铵水溶液和质量浓度为4 %的Ⅲ型胶原蛋白水溶液；
（2）将所得的N-乙烯基己内酰胺水溶液与甲基丙烯酸混合，真空搅拌去除气泡，用1mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0后，加入过硫酸铵水溶液混合均匀；
（3）65℃、氮气气氛下持续搅拌反应3 h后，透析冻干，并于4℃下加去离子水溶解，得到质量浓度为10 %的p(NVCL-co-MAA)水凝胶；
（4）将得到的p(NVCL-co-MAA)水凝胶与Ⅲ型胶原蛋白水溶液和去离子水按体积比1:1:9混合，添加其体积4.5%的交联剂进行交联；
（5）二次透析冻干，并于4℃下加去离子水溶解，得到质量浓度为10 %的p(NVCL-co-MAA)-g-COL水溶液；
（6）制备包载生物活性多肽的PLGA微球；
（7）将步骤（6）制备的包载生物活性多肽的PLGA微球按1.5 mg/mL的量加入到步骤（5）所得p(NVCL-co-MAA)-g-COL水溶液中，吹打均匀，即得到所述负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶。
步骤（2）中所用N-乙烯基己内酰胺水溶液与甲基丙烯酸的体积比为500:1、357:1、278:1或227:1；所用N-乙烯基己内酰胺水溶液与过硫酸铵水溶液的体积比为125:2。
步骤（4）所述交联剂是将1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺（EDC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）于去离子水中溶解制得，其中EDC的浓度为0.2 mol/L，NHS的浓度为2mol/L。
步骤（6）所述包载生物活性多肽的PLGA微球的制备方法如下：
a）准确称取0.06 g PLGA（乳酸和羟基乙酸单体的摩尔比为75:25），溶于1.2 mL二氯甲烷中，得共聚物溶液，置于4℃冰箱密封保存备用；
b）取600 μL、质量浓度为0.5 %的鹿茸多肽水溶液与步骤a）所得共聚物溶液混合后，立刻放入细胞破碎仪（3 mm锥形探头，探头振幅为30 %）内，超声2 min；
c）超声后立即倒入9 mL、质量浓度为1 %的PVA水溶液，继续超声2.5 min；
d）磁力搅拌5-6 h以去除复孔中大量刺激且易挥发的二氯甲烷，并促使球体之间均匀分散且使球体更为结实，然后将所得乳液于4℃、5000 rpm下离心6 min，弃上清液，沉淀用去离子水反复冲洗离心2次，冷冻干燥，即得所述包载生物活性多肽的PLGA微球，常温避光保存。
本发明具有以下有益效果：
1. 本发明制备的负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶呈三维网状结构，具有良好的生物相容性、无毒性、可降解性和无免疫原性，且其制备过程简便，价廉易得。其中搭载的生物活性多肽具有促进软骨修复的能力，Ⅲ型胶原蛋白具有增强组织弹性与促软骨分化的潜能，再结合温敏水凝胶的可注射性，能达到不开刀治疗软骨疾病的效果，是一种适应当前临床需求的骨关节软骨缺损修复医用材料。
2. 本发明制备的负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶对所负载的生物活性多肽具有长达25天以上的缓释作用，且经动物实验证明，该水凝胶具有良好的修复软骨缺损的效果。
附图说明
图1是本发明制备的负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶的扫描电镜图。
图2是本发明制备的负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶的相转变温度测试结果图。
图3是不同体系中的鹿茸多肽在37℃条件下的累计释放图。
图4是模型对照组（A）、注射温敏水凝胶（B）、温敏胶原基水凝胶（C）和负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶（D）的实验组家兔12周时病理学标本的番红O-固绿染色对比图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
所用甲基丙烯酸和N-乙烯基己内酰胺购买于sigma，所用重组人源Ⅲ型胶原蛋白是利用基因工程经过酵母菌发酵得到的产物。
所用交联剂是将1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺（EDC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）于去离子水中溶解制得，其中EDC的浓度为0.2 mol/L，NHS的浓度为2 mol/L。
实施例1
（1）准确量取25 mL质量浓度为4%的N-乙烯基己内酰胺水溶液与90 μL甲基丙烯酸混合于三颈烧瓶内，真空搅拌去除气泡；
（2）用1 M的NaOH溶液调节pH至7.0后，加入400 μL质量浓度为10%的过硫酸铵水溶液，混合均匀；
（3）65℃、氮气气氛下持续搅拌反应3 h后，透析冻干，并于4℃下加去离子水溶解，得终浓度为10%的p(NVCL-co-MAA)温敏水凝胶，记为A。
实施例2
将步骤1）中甲基丙烯酸的添加量替换为50 μL，其他步骤同实施例1，制备温敏水凝胶，记为B。
实施例3
将步骤1）中甲基丙烯酸的添加量替换为70 μL，其他步骤同实施例1，制备温敏水凝胶，记为C。
实施例4
将步骤1）中甲基丙烯酸的添加量替换为110 μL，其他步骤同实施例1，制备温敏水凝胶，记为D。
实施例5
1）取实施例1制备的10%的p(NVCL-co-MAA)温敏水凝胶5 mL，与4%的Ⅲ型胶原蛋白水溶液5 mL和45 mL去离子水混合，添加交联剂2.5 mL，于4℃下进行避光交联；
2）二次透析冻干，并于4℃下加去离子水溶解，得终浓度为10%的p(NVCL-co-MAA)-g-COL水溶液，记为E。
实施例6
准确称取0.06 g PLGA（乳酸和羟基乙酸单体的摩尔比为75:25），溶于1.2 mL二氯甲烷中，置于4℃冰箱密封保存备用；取600 μL、质量浓度为0.5 %的鹿茸多肽水溶液与上述PLGA-二氯甲烷溶液混合后立刻放入细胞破碎仪（3 mm锥形探头，探头振幅为30 %）内超声2min；立即倒入9 mL、质量浓度为1 %的PVA水溶液，继续超声2.5 min；磁力搅拌5-6 h以去除复孔中大量刺激且易挥发的二氯甲烷，并促使球体之间均匀分散且使球体更为结实；然后将所得乳液于4℃、5000 rpm下离心6 min，弃上清液，沉淀用去离子水反复冲洗离心2次，冷冻干燥，得到包载鹿茸多肽的PLGA微球，常温避光保存。
将上述制备的包载鹿茸多肽的PLGA微球按1.5 mg/mL的量于4℃下加入到实施例5所得10% p(NVCL-co-MAA)-g-COL水溶液中，吹打均匀，制备负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶，记为F。
图1是所制备的负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶的扫描电镜图。由图中可见该水凝胶为三维网状结构，包载生物活性多肽的PLGA微球能很好的附着于网状结构内。
1. 负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶的相转变温度（LCST）测定：
将实施例1-实施例5制备的10%温敏水凝胶用去离子水于4℃下稀释成0.5%的水溶液。采用紫外可见分光光度计于540 nm处记录该水溶液由10℃到37℃下的透光率变化情况，结果见图2。
由图2可知，实施例1-4中共聚物的LCST随着甲基丙烯酸添加量的升高而升高，当甲基丙烯酸添加量达到110 μL时，共聚物不具有温敏性能。在甲基丙烯酸添加量为90 μL时（即为A），其LCST为22.5℃，与B、C相比更接近室温。向A中加入Ⅲ型胶原蛋白（E）能促使其LCST升为23.5℃，最接近室温。因而就LCST而言，E相比其他水凝胶更具有其实用性。
2. 负载生物活性多肽的体外释放试验：
将实施例6制得的包载鹿茸多肽的PLGA微球按1.5 mg/mL的量加入PBS溶液（pH=7.4)中，然后取含有包载鹿茸多肽PLGA微球的PBS溶液和实施例6制备的负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶各0.2 mL，加入到2 mL的EP管中，并分别加入1 mL PBS溶液（pH=7.4)，置于37℃恒温培养箱内进行释放试验。试验时定时取出0.2 ml释放液，然后向试管中补加0.2ml新鲜的PBS溶液，继续进行释放培养。将所取的0.2 ml释放液用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测其中鹿茸多肽的吸光度，以计算释放液中鹿茸多肽的浓度，然后计算鹿茸多肽的累计释放量，结果见图3。
由图3可知，包载鹿茸多肽的PLGA微球自身具有控缓释特性，在37℃下可连续释放达11天以上；而将包载鹿茸多肽的PLGA微球负载在温敏胶原基水凝胶中，鹿茸多肽的累计释放天数明显增加，长达25天以上。这表明将包载鹿茸多肽的PLGA微球与温敏胶原基水凝胶复合对鹿茸多肽长期稳定发挥作用提供了保证。
3. 负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶的动物在体试验：
手术操作：清洁级新西兰兔20只，按体重随机分成5组，每组4只，每组8例关节。分组如下：模型对照组（A组）：缺损处不做任何处理；缺损组（B组）：缺损处注射实施例1制备的无菌温敏水凝胶；缺损组（C组）：缺损处注射实施例5制备的无菌温敏胶原基水凝胶；缺损组（D组）：缺损处注射实施例6制备的无菌负载生物活性多肽温敏胶原基水凝胶；空白对照组（E组）：无缺损的正常组。分组后用速眠新Ⅱ（0.3 mL/kg）麻醉后构建软骨及软骨下骨缺损模型，缺损区直径4 mm，深度约5 mm。
按照分组，将经γ射线灭菌后的温敏水凝胶分别注射入上述关节软骨缺损模型中，逐层缝合伤口。术后每只兔子肌肉注射10万单位青霉素钠，连续1周，以防感染。
术后观察和标本处理：于术后12周，耳缘静脉注射过量速眠新Ⅱ处死各组实验动物，进行大体观察、HE染色、甲苯胺蓝染色、番红O-固绿染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色。
结果：相比温敏胶原基水凝胶组，负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶组在12周时缺损部位填充完整且与周围组织的界限不明显，且二者均比温敏水凝胶组和模型对照组较优（如图4），证明负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶可有效修复动物膝关节软骨缺损。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (10)

1.一种用于骨关节软骨缺损修复的负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶，其特征在于：所述水凝胶是以甲基丙烯酸、N-乙烯基己内酰胺、重组人源Ⅲ型胶原蛋白和鹿茸多肽为主要原料制得。
2.根据权利要求1所述的一种负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶，其特征在于：所述重组人源Ⅲ型胶原蛋白是利用基因工程经过酵母菌发酵得到的产物。
3.一种如权利要求1所述的负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）将N-乙烯基己内酰胺、过硫酸铵和重组人源Ⅲ型胶原蛋白分别溶于去离子水中，制成N-乙烯基己内酰胺水溶液、过硫酸铵水溶液和Ⅲ型胶原蛋白水溶液；
（2）将所得的N-乙烯基己内酰胺水溶液与甲基丙烯酸混合，真空搅拌去除气泡，用1mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0后，加入过硫酸铵水溶液混合均匀；
（3）65℃、氮气气氛下持续搅拌反应3 h后，透析冻干，并于4℃下加去离子水溶解，得到p(NVCL-co-MAA)水凝胶；
（4）将得到的p(NVCL-co-MAA)水凝胶与Ⅲ型胶原蛋白水溶液和去离子水按体积比1:1:9混合，添加其体积4.5%的交联剂进行交联；
（5）二次透析冻干，并于4℃下加去离子水溶解，得到p(NVCL-co-MAA)-g-COL水溶液；
（6）制备包载生物活性多肽的PLGA微球；
（7）将步骤（6）制备的包载生物活性多肽的PLGA微球按1.5 mg/mL的量加入到步骤（5）所得p(NVCL-co-MAA)-g-COL水溶液中，吹打均匀，即得到所述负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶。
4. 根据权利要求3所述的一种负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（1）所制备的N-乙烯基己内酰胺水溶液、过硫酸铵水溶液和Ⅲ型胶原蛋白水溶液的质量浓度分别为4 %、10 %和4 %。
5.根据权利要求3所述的一种负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所用N-乙烯基己内酰胺水溶液与甲基丙烯酸的体积比为500:1、357:1、278:1或227:1；
所用N-乙烯基己内酰胺水溶液与过硫酸铵水溶液的体积比为125:2。
6. 根据权利要求3所述的一种负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（3）所得p(NVCL-co-MAA)水凝胶的质量浓度为10 %。
7. 根据权利要求3所述的一种负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（5）所得p(NVCL-co-MAA)-g-COL水溶液的质量浓度为10 %。
8. 根据权利要求3所述的一种负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述交联剂是将1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺于去离子水中溶解制得，其中1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺的浓度为0.2mol/L，N-羟基丁二酰亚胺的浓度为2 mol/L。
9.根据权利要求3所述的一种负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（6）所述包载生物活性多肽的PLGA微球的制备方法如下：
a）准确称取0.06 g PLGA，溶于1.2 mL二氯甲烷中，得共聚物溶液，置于4℃冰箱密封保存备用；
b）取600 μL、质量浓度为0.5 %的鹿茸多肽水溶液与步骤a）所得共聚物溶液混合后，立刻放入细胞破碎仪内，超声2 min；
c）超声后立即倒入9 mL、质量浓度为1 %的PVA水溶液，继续超声2.5 min；
d）磁力搅拌5-6 h后将所得乳液于4℃、5000 rpm下离心6 min，弃上清液，沉淀用去离子水反复冲洗离心2次，冷冻干燥，即得所述包载生物活性多肽的PLGA微球。
10.根据权利要求9所述的一种负载生物活性多肽的温敏胶原基水凝胶的制备方法，其特征在于：所用PLGA中乳酸和羟基乙酸单体的摩尔比为75:25；
所用细胞破碎仪采用3 mm锥形探头，探头振幅为30 %。
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