CN108404207A - 温敏壳聚糖水凝胶细胞因子复合支架的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物材料领域。技术方案是：温敏壳聚糖水凝胶细胞因子复合支架的制备方法，包括以下步骤：1)将壳聚糖和明胶以2.5:0.8‑1.2的质量比例混合；2)将步骤1)获得的混合物溶解成浓度为0.1M的醋酸溶液或水溶液中，4摄氏度下混匀24小时以上；3)将浓度为44.4％的甘油磷酸二钠盐溶液逐滴加入步骤2)获得的混合物，在4摄氏度超净台中边加入边搅拌；甘油磷酸二钠盐与混合物的质量比例为1:0.5‑1.0；4)将细胞因子逐滴加入步骤3)获得的混合物，在4摄氏度超净台中边加入边搅拌；5)步骤4)获得的混合物在4摄氏度保持液体状态，37摄氏度10分钟后凝固成固体凝胶。该方法获得的支架能够缓释细胞因子。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料、医用材料技术领域，具体涉及一种新型温敏壳聚糖水凝胶细胞因子复合支架的制备方法。
背景技术
临床上目前治疗角膜上皮损伤主要采用促进上皮生长因子眼药水、抗炎眼药水治疗，这些传统的治疗方法有一定的作用，但修复的时间长，修复的上皮结构和功能都远远低于正常角膜上皮，最终导致角膜不可逆的疤痕形成，影响患者的视觉效果。
壳聚糖材料，它主要是从甲壳动物的外骨骼和真菌的细胞壁中提取，由几丁质脱乙酰化形成的氨基多糖。它有许多优良的生物性能：透明、无毒性、低的免疫原性、良好的生物降解性和组织向相容性，这些使它成为生物医学应用的候选者。壳聚糖应用非常广泛，可以被制备成薄膜，水凝胶，纳米微球，海绵等各种形式；并且可以通过释放生长因子、多肽、抗生素等促进修复。水凝胶是由亲水性聚合物构成的，能在水或生物体液中溶胀并保持大量水分而不被溶解的交联网络。水凝胶结构类似于机体组织，既不影响生命体的代谢过程，代谢产物又可以通过水凝胶排出，因此常常被用作人体器官/组织替代物。目前水凝胶，作为在损伤修复材料界一种特殊的吸附剂，受到了很多关注，并且研究表明修复过程在湿的环境下比干的环境下更好。基于水凝胶的材料在一个高度肿胀的状态被用于传递细胞或者生物因子。壳聚糖水凝胶有着良好的水吸收能力和水潴留能力，被广泛用于软骨组织工程、角膜内皮重建和药物加载移植物。壳聚糖温敏水凝胶能够在4度保持液体状态，然后在人体温度时转化成凝胶状。前人研究表明壳聚糖支架能够促进角膜损伤修复。然而在这些研究中，修复的上皮的结构和功能都远远低于正常角膜上皮，这些表明一种理想的、能吸引目的细胞在损伤部位集聚的有生物活性的壳聚糖支架组合仍然面临着巨大的挑战。
细胞因子是一类能调节细胞的各类活动与功能的天然蛋白。这些因子能够诱导细胞向特定系分化，也能够调节组织的生长。如TGF-β1能够加强细胞的迁移，增殖和细胞外基质(胶原蛋白以及蛋白聚糖等)的合成。另外，Wolfman也报道了GDF-5，6，7可诱导种子细胞在异位形成肌腱韧带样组织。但同时，这些细胞因子不单单促进了细胞外基质的形成，同时也诱导了细胞向其他系的分化，如局部软骨组织和骨组织的形成。且细胞因子有一定的生物效力期限，而原位多次注射在手术治疗各类组织时将是个技术困难。
发明内容
本发明的目的是克服上述背景技术中的不足，提供一种温敏壳聚糖水凝胶细胞因子复合支架的制备方法；所获得的支架具有温度敏感性、良好的生物组织相容性且能够缓释细胞因子，从而能吸引目的细胞在组织损伤部位集聚促进组织损伤修复、尤其是促进角膜上皮损伤修复的效果。
本发明提供技术方案是：
温敏壳聚糖水凝胶细胞因子复合支架的制备方法，包括以下步骤：
1)将壳聚糖和明胶以2.5:0.8-1.2的质量比例混合；
2)将步骤1)获得的混合物溶解成浓度为0.1M的醋酸溶液或者水溶液中，4摄氏度下混匀24小时以上；
3)将浓度为44.4％的甘油磷酸二钠盐溶液逐滴加入步骤2)获得的混合物中，在4摄氏度超净台中边加入边搅拌；甘油磷酸二钠盐与混合物的质量比例为1:0.5-1.0；
4)将细胞因子逐滴加入步骤3)获得的混合物中，在4摄氏度超净台中边加入边搅拌；
5)步骤4)获得的混合物在4摄氏度保持液体状态，37摄氏度10分钟后凝固成固体凝胶。
所述壳聚糖的分子量为300,000Da，脱乙酰化程度为>95％，黏度200mPa。
作为优选，所述壳聚糖、明胶以及甘油磷酸二钠盐的质量比例为2.5:1:5
作为优选，步骤4)中，细胞因子加入的終浓度为2000ng/ml；
作为优选，所述壳聚糖和明胶预先粉碎成粉末；粉末的细度小于100目。
所述方法获得的混合物即温敏壳聚糖水凝胶细胞因子复合支架，用于各类体外组织工程的构建、各类组织局部应用治疗作用，组织损伤修复机制研究等。
本发明的有益效果是：
本发明通过体外构建的温敏壳聚糖水凝胶细胞因子复合支架，具有许多优良特性：材料来源丰富、制作过程简单、温度敏感性、优良的生物组织相容性和缓释各类细胞因子。该复合支架制备完成后可以局部注射或者移植到各类组织损伤部位进行修复，在损伤部位，因温度升高可以凝固成胶状，起到保护和缓释的作用。该复合支架制备成眼药水后，利用该复合支架眼药水局部缓释给药，可以达到一个持续的药物作用浓度(高浓度药物缓释时间达48小时以上)，从而获得良好的修复效果(修复效果明显优于对照组)；并且该温敏壳聚糖水凝胶细胞因子复合支架也不会像滴眼药水那样因为流到外面、泪腺或者结膜囊中而损失作用的药物浓度。该发明可以在眼球、骨骼、皮肤等众多组织中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为温敏壳聚糖水凝胶支架的制备过程示意图。
图2为温敏壳聚糖水凝胶在4摄氏度呈液体状、37摄氏度呈凝固状的照片。
图3为温敏壳聚糖水凝胶化学结构图。
图4为温敏壳聚糖水凝胶表明微观结构图。
图5为温敏壳聚糖水凝胶缓释SDF-1alpha缓释曲线图。
图6为温敏壳聚糖水凝胶SDF-1alpha因子复合物促进角膜上皮损伤修复示意图。
具体实施方式
以下结合附图所示的实施例进一步说明。
本发明构建的温敏壳聚糖水凝胶细胞因子复合支架，是一种理想的、能吸引目的细胞在损伤部位集聚的有生物活性的复合温敏壳聚糖支架，能够促使身体已损伤组织的再生，为提高组织的修复质量带来了全新的机会。
温敏壳聚糖水凝胶细胞因子复合支架制备方法，包括以下步骤：
1)将分子量300,000Da、脱乙酰化程度>95％、黏度200mPa的壳聚糖和明胶以2.5:1的质量比例混合；壳聚糖和明胶预先制成粉末状(粉末细度优选120目)；
2)将步骤(1)获得的混合物溶解成浓度为0.1M的醋酸溶液中，4摄氏度下混匀24小时；
3)将浓度为44.4％的无菌甘油磷酸二钠盐溶液逐滴加入步骤2)获得的混合物中，在4摄氏度超净台中边加入边搅拌；所述壳聚糖、明胶以及甘油磷酸二钠盐的质量比例为2.5:1:5；
4)将细胞因子SDF-1alpha逐滴加入步骤3)获得的混合物中，在4摄氏度超净台中边加入边搅拌；细胞因子加入的終浓度为2000ng/ml(也可根据需要，决定细胞因子加入的終浓度)；
5)步骤4)获得的混合物在4摄氏度保持液体状态，37摄氏度10分钟后凝固成固体凝胶。
本发明获得的温敏壳聚糖水凝胶(参见图4)，水凝胶分子之间的孔径有序排列呈现一个网络状结构，该结构表明该材料具有包裹各类细胞因子、多肽及干细胞的功能。从而具备了具有良好的缓释效果(参见图5)：温敏壳聚糖水凝胶在各个时间点累计缓释SDF-1alpha浓度分别为0小时：30.47±4.91％；1小时:54.99±3.04％；3小时:58.39±0.98％；5小时:65.68±1.47％；7小时:67.00±0.79％；24小时:79.92±3.73％；36小时:80.61±4.91％；48小时:81.93±4.62％。该缓释体系证实了温敏壳聚糖水凝胶能持续缓释高浓度SDF-1alpha48小时以上。
为了解温敏壳聚糖水凝胶SDF-1alpha复合支架的治疗效果，我们建立了大
鼠严重碱烧伤模型，将传统眼药水治疗作为对照组，温敏壳聚糖水凝胶SDF-1alpha复合支架为实验组进行角膜碱烧伤后的修复过程治疗观察(参见图6)。图中显示：在术后第7天，大鼠角膜大体图和荧光素钠染色图均显示温敏壳聚糖水凝胶SDF-1alpha复合支架组显著的加速了角膜上皮修复的速度，与对照组相比(P<0.01)具有显著性差异。在术后第13天，温敏壳聚糖水凝胶SDF-1alpha复合支架组已经完全修复了角膜上皮，而对照组只有80.92％的治愈面积(P<0.05)。且温敏壳聚糖水凝胶SDF-1alpha复合支架组修复的角膜与对照组相比更加透明(P<0.01)，而且角膜缘血管的面积(P<0.05)实验组比对照组显著性减少。这些结果表明温敏壳聚糖水凝胶SDF-1alpha复合支架加速了角膜上皮损伤修复，且修复的上皮结构更加完美。
Claims (6)
1.温敏壳聚糖水凝胶细胞因子复合支架的制备方法，包括以下步骤：
1)将壳聚糖和明胶以2.5:0.8-1.2的质量比例混合；
2)将步骤1)获得的混合物溶解成浓度为0.1M的醋酸溶液或者水溶液中，4摄氏度下混匀24小时以上；
3)将浓度为44.4％的无菌甘油磷酸二钠盐溶液逐滴加入步骤2)获得的混合物中，在4摄氏度超净台中边加入边搅拌；甘油磷酸二钠盐与混合物的质量比例为1:0.5-1.0；
4)将细胞因子逐滴加入步骤3)获得的混合物中，在4摄氏度超净台中边加入边搅拌；
5)步骤4)获得的混合物在4摄氏度保持液体状态，37摄氏度10分钟后凝固成固体凝胶。
2.根据权利要求1所述的温敏壳聚糖水凝胶细胞因子复合支架的制备方法，其特征在于：
所述壳聚糖的分子量为300,000Da，脱乙酰化程度为>95％，黏度200mPa。
3.根据权利要求2所述的温敏壳聚糖水凝胶细胞因子复合支架的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖、明胶以及甘油磷酸二钠盐的质量比例为2.5:1:5。
4.根据权利要求3所述的温敏壳聚糖水凝胶细胞因子复合支架的制备方法，其特征在于：步骤4)中，细胞因子加入的終浓度为2000ng/ml。
5.根据权利要求4所述的温敏壳聚糖水凝胶细胞因子复合支架的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖和明胶预先粉碎成粉末；粉末的细度小于100目。
6.权利要求1所述的制备方法获得的温敏壳聚糖水凝胶细胞因子复合支架，用于各类体外组织工程的构建、各类组织局部应用治疗，以及组织损伤修复机制研究。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20180817 |
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |