CN111068116A - 一种注射用软骨修复温敏凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种注射用软骨修复温敏凝胶，其包括如下组分：壳聚糖、胶原蛋白、β‑甘油磷酸钠和成骨细胞因子，本发明制备的温敏凝胶以壳聚糖与β‑甘油磷酸盐共混为基础，同时加入胶原蛋白和细胞生长因子，使温敏凝胶在软骨缺损修复中，不但具有了可注射性、生物相容性和生物可降解性等功能，同时还为成骨细胞提供了有力的生长空间和诱导定向分化功能。本发明所提供的温敏凝胶备使用操作简单，软骨修复效果良好，能缩短康复时间，极大地减轻了患者的痛苦。

Description

一种注射用软骨修复温敏凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地涉及一种注射用软骨修复温敏凝胶及其制备方法。
背景技术
软骨主要由分散的圆形或椭圆形的软骨细胞和浓密的细胞外基质组成，是一种无血管、神经和淋巴腺的组织。其细胞外基质主要由Ⅱ型胶原的网络结构和羽毛状的糖蛋白组成，为软骨组织提供足够的力学强度。这种结构特点使损伤的软骨组织自修复能力十分有限。然而，软骨组织的损伤或功能缺失在外科上很常见。随着人口老年化和肥胖问题的日益严重，患关节炎的人数每年都在增加，也有很多人由于过度运动造成关节软骨缺损。目前临床上关节软骨修复的治疗方法主要有微骨折法、自体软骨移植和同种异体软骨移植。虽然这些方法成功地减轻了患者的痛苦、提高了软骨的功能，但是上述方法存在供体来源不足、手术过程复杂、排异、修复的软骨缺乏天然软骨结构等缺点。这些缺陷甚至可能阻碍这些治疗方法在临床上的长期应用。
在组织工程领域，水凝胶是具有较大开发潜力的一类生物医用高分子材料。水凝胶内部的三维网状结构使得水凝胶自身能够吸收大量的水分而发生溶胀，并在溶胀后继续保持结构的稳定而不被溶剂溶解。水凝胶在与人体组织相接触时，不会影响机体正常的代谢过程,同时培养在水凝胶中软骨细胞的代谢产物又可以通过水凝胶内部的孔隙排出,表现出良好的生物相容性。与合成生物材料相比，以天然高分子材料为基础的水凝胶在性质上更加类似于细胞外基质。水凝胶材料同时具备优良的力学性能，可以承载一定的力学载荷与压缩变形。软骨细胞在水凝胶支架中呈现圆形或者椭圆形的形态,与在天然软骨基质中的形态更为接近,所以有利于软骨细胞的正常表达。一定条件下，水凝胶可以保持流动性能，这样就使得水凝胶具备可注射性。可注射的水凝胶支架可以充满复杂的缺损组织部位，发挥在微创治疗方面的优势，作为组织工程支架材料，水凝胶具备生物相容性，生物降解性和力学性能等方面的优势。
原位形成凝胶体系是一个研究的热点，具有多种生物用途,主要应用于药物缓释，细胞培养和组织工程。原位形成凝胶体系在注射前保持溶液状态，注射后可在人体温度下形成凝胶。溶剂、紫外辐射、离子交联剂、pH和温度等因素都能够导致原位凝胶的形成。以上形成方式不需要有机溶剂，共聚剂和引发剂等化学试剂，可降低水凝胶的生物毒性。其中通过温度改变实行溶液-凝胶转变可原位凝固的温敏型材料，也是可注射植入材料的研究热点。
壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的衍生物，具有良好的生物相容性、可降解活性以及促，进组织再生活性。以壳聚糖为基材的温敏凝胶系统可以在低温或常温下保持液体状态，当温度升高后发生相转变。由于其相转变条件温和、具有良好的生物相容性等优点，近年来受到广泛关注，已被应用于组织工程、药物载体等领域。当凝胶形成后，由于疏水作用、氢键及共价键等静电作用，使之具有多孔的网状支架形态，并具有一定的机械强度和空间保持能力。因此，利用壳聚糖制备温敏性凝胶具有广阔的应用前景。其中壳聚糖与β-甘油磷酸钠盐共混凝胶是用壳聚糖与β-甘油磷酸钠以适当的比例混合，可制得性能优良的温敏凝胶。其温敏性凝胶以其独特的温度敏感性能，再加上可注射性、优良的组织相容性、生物可降解性等特点，使其在组织工程领域有很高的用价值。然而，该凝胶诱导细胞增殖和促进软骨修复的效果并不是很理想。
胶原蛋白是细胞外最重要的不溶于水的纤维蛋白，是构成细胞外基质的骨架主要成分之一；胶原蛋白在细胞外基质中形成半晶体的纤维，给细胞提供张力和弹性，并在细胞的迁移和发育中起作用。在软骨修复中，胶原纤维形成网络结构和支架，连接细胞，通过润滑和趋化作用，引导成骨细胞迁入缺损区，因此在壳聚糖温敏凝胶中加入胶原蛋白，有利于细胞的迁移和发育。
生长因子可促进细胞的增殖、组织与器官的修复与再生，所以被广泛地用于组织再生工程领域。这些因子能够诱导细胞向特定系分化，也能够调节组织的生长。生长因子作为一类高活性、多功能的多肽或蛋白质，极易受到外界影响而失活，因此，找到适当的方法将生长因子固定在可控降解的组织工程支架上，从而达到生长因子的缓慢释放的作用在组织工程学中是至关重要的。
目前在温敏凝胶的制备过程中，通常先把壳聚糖溶解在酸性溶液中，在酸性条件下加入β-甘油磷酸钠盐，得到温敏凝胶体系，然而，在上述体系中加入胶原蛋白和/或骨形态形成蛋白(BMP)后，会出现沉淀和/或温敏性变差等问题，现有技术中并无相关方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种性能稳定，修复效果好、能缩短康复时间的注射用软骨修复温敏凝胶，并提供其制备方法。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明一方面提供了一种注射用软骨修复温敏凝胶，其包括如下组分：壳聚糖、胶原蛋白、β-甘油磷酸钠和成骨细胞因子。
作为本发明的一些实施方式，所述各组分含量如下：壳聚糖、胶原蛋白、β-甘油磷酸钠0.15~0.30g/ml、成骨细胞因子1000ng/ml。
本发明另一方面提供了一种上述注射用软骨修复温敏凝胶的制备方法，其具体包括如下步骤：
（1）将壳聚糖粉未加入到磷酸盐缓冲液中，室温搅拌24-48h，高速离心去掉沉淀获得壳聚糖溶液；
（2）将胶原蛋白加入到步骤（1）获得的壳聚糖溶液中，室温搅拌24-48h，3~5℃静置48-72h，得到混合物；
（3）在0~5℃条件下，将β-甘油磷酸钠溶液逐滴缓慢加入到步骤（2）获得的混合物中；
（4）在0~5℃条件下，将成骨细胞因子逐滴缓慢加入步骤3)获得的混合物中，混合均匀，即得。
作为本发明的一些实施方式，所述步骤（1）中壳聚糖溶液的浓度为0.001~0.003g/ml。
作为本发明的一些实施方式，所述步骤（1）中磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mo1/，pH为6.0。
作为本发明的一些实施方式，其特征在于，所述步骤（2）混合物中胶原蛋白的浓度为0.015~0.025 g/ml。
作为本发明的一些实施方式，所述步骤（3）中，β-甘油磷酸钠的终浓度为0.15~0.30g/ml。
作为本发明的一些实施方式，所述步骤（4）中，加入的成骨细胞生长因子（美国ScienCell）的终浓度为1000ng/ml。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
本发明制备的温敏凝胶以壳聚糖与β-甘油磷酸盐共混为基础，同时加入胶原蛋白和细胞生长因子，使温敏凝胶在软骨缺损修复中，不但具有了可注射性、生物相容性和生物可降解性等功能，同时还为成骨细胞提供了有力的生长空间和诱导定向分化功能。本发明所提供的温敏凝胶备使用操作简单，质均稳定，温敏性好，软骨修复效果良好，能缩短康复时间，极大地减轻了患者的痛苦。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1 本发明实施例1制备的凝胶电镜图；
图2本发明实施例1制备的温敏凝胶4℃和37℃状态图；
图3小猪软骨缺损模型康复图，图中A：3周；B：5周；C：7周；
图4小猪软骨缺损模型局部放大图，图中A：3周；B：5周；C：7周。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对发明进行清楚、完整的描述。
本实施方式部分的成骨细胞因子为市售产品，购自美国ScienCell。
本实施方式部分所用的0.1mo1/L 200 ml磷酸盐缓冲液（pH：6.0）配制方法：1mo1/L K2HPO4 26.4 ml，1mo1/L KH2PO4 173.6 ml混合均匀，即可。
实施例1
配制0.1mo1/L磷酸盐缓冲液200ml，在搅拌条件下，将3g壳聚糖(脱乙酰度95%)缓慢加入，室温25℃搅拌24h，然后将溶液高速离心，去掉沉淀即获得初始浓度为0.015g/ml的壳聚糖溶液。
取0.1g初始浓度为0.001g/ml的胶原蛋白初溶液，加入到上述200ml壳聚糖溶液中，搅拌24h，4℃静置48h，制得壳聚糖和胶原蛋白混合物。
配制0.60g/ml的β-甘油磷酸钠溶液，取200μL的壳聚糖和胶原蛋白混合物与1ml离心管中，并在4℃，搅拌条件下将50μL的β-甘油磷酸钠溶液逐滴缓慢加入到上述混合物溶液中,使β-甘油磷酸钠溶液的终浓度为0.12g/ml。
然后在0℃搅拌条件下将成骨细胞因子逐滴缓慢加入上述混合物中，使成骨细胞因子的终浓度为1000ng/ml，制得温敏壳聚糖凝胶，将离心管置于37℃水浴中，0.5h后形成固体凝胶，见图1和图2。
实施例2
配制0.1mo1/L磷酸盐缓冲液200ml，在搅拌条件下，将4g壳聚糖(脱乙酰度95%)缓慢加入，室温25℃搅拌24h，然后将溶液高速离心，去掉沉淀即获得初始浓度为0.02g/ml的壳聚糖溶液。
取0.2g初始浓度为0.001g/ml的胶原蛋白初溶液，加入到上述200ml壳聚糖溶液中，搅拌24h，4℃静置48h，制得壳聚糖和胶原蛋白混合物。
配制0.60g/ml的β-甘油磷酸钠溶液，取200μL的壳聚糖和胶原蛋白混合物与1ml离心管中，并在4℃，搅拌条件下将100μL的β-甘油磷酸钠溶液逐滴缓慢加入到上述混合物溶液中，使β-甘油磷酸钠溶液的终浓度为0.2g/ml。
然后在0℃搅拌条件下将成骨细胞因子逐滴缓慢加入上述混合物中，使成骨细胞因子的终浓度为1000ng/ml，制得温敏壳聚糖凝胶，将离心管置于37℃水浴中，0.5h后形成固体凝胶。
实施例3
配制0.1mo1/L磷酸盐缓冲液200ml，在搅拌条件下，将6g壳聚糖(脱乙酰度95%)缓慢加入，室温25℃搅拌24h，然后将溶液高速离心，去掉沉淀即获得初始浓度为0.03g/ml的壳聚糖溶液。
取0.3g初始浓度为0.001g/ml的胶原蛋白初溶液，加入到上述200ml壳聚糖溶液中，搅拌24h，4℃静置48h，制得壳聚糖和胶原蛋白混合物。
配制0.60g/ml的β-甘油磷酸钠溶液,取200μL的壳聚糖和胶原蛋白混合物与1ml离心管中，并在4℃，搅拌条件下将200μL的β-甘油磷酸钠溶液逐滴缓慢加入到上述混合物溶液中,使β-甘油磷酸钠溶液的终浓度为0.3g/ml。
然后在4℃搅拌条件下将成骨细胞因子逐滴缓慢加入上述混合物中，使成骨细胞因子的终浓度为1000ng/ml，制得温敏壳聚糖凝胶，将离心管置于37℃水浴中，0.5h后形成固体凝胶。
对比例1
配制0.1mo1/L盐酸溶液200ml，在搅拌条件下，将3g壳聚糖(脱乙酰度95%)缓慢加入，室温25℃搅拌24h，然后将溶液高速离心，去掉沉淀即获得初始浓度为0.015g/ml的壳聚糖溶液。
取0.1g初始浓度为0.001g/ml的胶原蛋白初溶液，加入到上述200ml壳聚糖溶液中，搅拌24h，4℃静置48h，制得壳聚糖和胶原蛋白混合物。
配制0.60g/ml的β-甘油磷酸钠溶液，取200μL的壳聚糖和胶原蛋白混合物与1ml离心管中，并在4℃，搅拌条件下将50μL的β-甘油磷酸钠溶液逐滴缓慢加入到上述混合物溶液中,使β-甘油磷酸钠溶液的终浓度为0.12g/ml，在加入过程中，溶液极易有絮状沉淀产生，造成溶解不均匀。
然后在4℃搅拌条件下将成骨细胞因子逐滴缓慢加入上述混合物中，使成骨细胞因子的终浓度为1000ng/ml，温敏凝胶固化速度很慢，且固化程度差。
实验例1 小猪软骨愈合实验
在小猪软骨处制造6mm软骨缺损模型，使用本发明凝胶，分别在3周、5周和7周观察软骨修复情况，并对其缺损部位纵截面进行组织学观察，如图3和4所示。从图中可以看出使用本发明凝胶对软骨的修复作用明显，效果良好。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种注射用软骨修复温敏凝胶，其特征在于，其包括如下组分：壳聚糖、胶原蛋白、β-甘油磷酸钠和成骨细胞因子。
2.根据权利要求1所述的一种注射用软骨修复温敏凝胶，其特征在于，所述各组分含量如下：壳聚糖0.001~0.003g/ml、胶原蛋白0.015~0.025 g/ml、β-甘油磷酸钠0.15~0.30g/ml、成骨细胞因子1000ng/ml。
3.一种如权利要求1或2所述的注射用软骨修复温敏凝胶的制备方法，其特征在于，其具体包括如下步骤：
（1）将壳聚糖粉未加入到磷酸盐缓冲液中，室温搅拌24~48h，高速离心去掉沉淀获得壳聚糖溶液；
（2）将胶原蛋白加入到步骤（1）获得的壳聚糖溶液中，室温搅拌24~48h，3~5℃静置48~72h，得到混合物；
（3）在0~5℃条件下，将β-甘油磷酸钠溶液逐滴缓慢加入到步骤（2）获得的混合物中；
（4）在0~5℃条件下，将成骨细胞因子逐滴缓慢加入步骤（3)获得的混合物中，混合均匀，即得。
4.根据权利要求3所述的注射用软骨修复温敏凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中壳聚糖溶液的浓度为0.001~0.003g/ml。
5.根据权利要求3所述的注射用软骨修复温敏凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mo1/，pH为6.0。
6.根据权利要求3所述的注射用软骨修复温敏凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）混合物中胶原蛋白的浓度为0.015~0.025 g/ml。
7.根据权利要求3所述的注射用软骨修复温敏凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，β-甘油磷酸钠的终浓度为0.15~0.30g/ml。
8.根据权利要求3所述的注射用软骨修复温敏凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，加入的成骨细胞生长因子的终浓度为1000ng/ml。
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