CN107823699A - 止血防粘连膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种止血防粘连膜，包括胶原蛋白和透明质酸钠。本发明还提供了止血防粘连膜的制备方法，包括：将胶原蛋白冻干粉与透明质酸钠混合均匀，得到混合物；向混合物中加入交联剂进行交联反应，得到共混溶液；将共混溶液干燥、压制成膜片并灭菌。本发明的止血防粘连膜同时具有止血和防粘连双重效果，无免疫原性，无动物源性传染病风险，吸水性强，止血氨基酸序列含量高，可体内完全降解。

Description

止血防粘连膜及其制备方法
技术领域
本发明属于医疗外科技术领域，具体地，本发明涉及一种可生物降解的止血防粘连膜及其制备方法。
背景技术
在医疗领域中，止血材料及产品在临床中应用十分广泛，特别是外科科室中，相当数量的外伤死亡患者都是由于急性出血过多造成，所以快速止血，有效控制失血量是挽救生命的关键，在许多手术过程中，对于各种创面的出血点控制，也是减少并发症，提高手术成功的重要因素。外科手术中除了出血控制，另外一个值得关注的问题即是术后粘连问题，作为术后严重并发症之一，术后粘连给患者带来很大痛苦和折磨。因此一种具有超强止血作用及良好防粘连功效的产品是外科领域亟待需要的临床产品之一。
申请号为201410532551.2的中国发明专利申请公开了一种具有止血作用的微纤维胶原海绵，具有较强的吸水能力，止血效果良好，但采用热交联对蛋白结构有一定影响，同时存在动物源性风险，且不具有防粘连作用。
申请号为201410020527.0的中国发明专利申请公开了一种防粘连的可降解高分子材料，该产品主要是将透明质酸钠交联，提高耐降解度，同时与水性壳聚糖混合，用于预防术后粘连，具有一定的抑菌效果。所述的壳聚糖为动物源提取，具有致敏及免疫原性风险。
申请号为200910107412.4的中国发明专利申请公开了一种水溶性止血材料，主要成分为氧化再生纤维素醚，止血效果显著，但存在强度不足的问题，且体内难以降解，吸收后可能沉积在人体其它器官中。
申请号为201310380614.2的中国发明专利申请公开了一种防粘连止血膜，主要成分为右旋糖酐，交联后采用静电纺丝技术制备，生产工艺相对复杂，成本较高，且未对产品的交联剂残留及产品生物相容性进行研究。
上述文献中公开的材料都存在一定的不足，无法同时具备止血、防粘连、可生物降解并且生物相容性及组织粘附性良好的特性，不能很好的满足当前外科领域的需求。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供了一种可生物降解的止血防粘连膜及其制备方法。
一方面，本发明提供了一种止血防粘连膜，包括胶原蛋白和透明质酸钠，其中，所述胶原蛋白和所述透明质酸钠的重量比是10:(1-5)。
前述的止血防粘连膜，所述胶原蛋白和所述透明质酸钠的重量比是10:2.5。
前述的止血防粘连膜，所述胶原蛋白是重组人源胶原蛋白。
前述的止血防粘连膜，所述重组人源胶原蛋白的分子量是35-95Kda，优选是70Kda。
前述的止血防粘连膜，所述透明质酸钠是医药级透明质酸钠。
前述的止血防粘连膜，所述医药级透明质酸钠的分子量是100-300Kda，优选是180Kda。
另一方面，本发明提供了前述的止血防粘连膜的制备方法，包括：
(1)将胶原蛋白冻干粉与透明质酸钠按照重量比是10:(1-5)混合均匀，得到混合物；
(2)向步骤(1)得到的混合物中加入交联剂进行交联反应，得到共混溶液；
(3)将步骤(2)得到的共混溶液干燥、压制成膜片并灭菌。
前述的制备方法，所述交联剂浓度为0.01mol/L-0.1mol/L。
前述的制备方法，所述交联反应在0-37℃(优选4℃)进行4-12小时(优选5-10小时)。
前述的制备方法，所述交联剂是戊二醛、1,4丁二醇二缩水甘油醚、碳化二亚胺、二乙烯基砜、京尼平中的任意一种或多种。
前述的制备方法，步骤(2)包括：按照浓度0.01mol/L-0.05mol/L向步骤(1)得到的混合物中加入第一交联剂，在0-37℃(优选4℃-25℃)进行第一次交联反应1-8小时(优选2-4小时)，随后按照浓度0.01mol/L-0.1mol/L加入第二交联剂，在0-37℃(优选4℃-20℃)进行第二次交联反应2-12小时(优选4-6小时)。
前述的制备方法，所述第一交联剂和所述第二交联剂分别是戊二醛、1,4丁二醇二缩水甘油醚、碳化二亚胺、二乙烯基砜、京尼平中的任意一种或多种。
前述的制备方法，步骤(2)中交联反应结束之后的交联强度为0.5％-10％。
前述的制备方法，步骤(3)中，灭菌采用低温辐照灭菌，其中，温度是-20～-10℃，辐照剂量是15～20kGy。
相对于现有技术，本发明的止血防粘连膜及其制备方法具有如下有益效果：
(1)本发明采用的胶原蛋白是以基因工程的方法通过微生物发酵获得的重组人源胶原蛋白，其纯度高，无免疫原性，无动物源性传染病风险，吸水性强，止血氨基酸序列含量高，可体内完全降解。
(2)重组人源胶原蛋白与医药级透明质酸钠共混制成，具有优良的生物相容性，同时具有止血和防粘连双重效果，对于腹内手术的止血及术后防粘连具有重要的临床意义。
(3)本发明通过轻度交联，有效降低交联剂残留，保证产品生物相容性。经交联后，既保证产品具有良好的吸水凝胶性及组织粘附性以保证止血效果；同时通过轻度交联控制的体内降解速率可确保1-2周的粘连高发期产品良好保留，起预防粘连的作用，低度交联也避免了材料体内残留过久可能引起的炎症、排异性等风险。
(4)采用低温环境辐照，既可以保证产品的无菌水平(SAL≤10-6)，也可防止胶原及多糖结构损坏。
具体实施方式
为了充分了解本发明的目的、特征及功效，通过下述具体实施方式，对本发明作详细说明。本发明的工艺方法除下述内容外，其余均采用本领域的常规方法或装置。除非另有说明，否则本发明中涉及的术语均具有本领域技术人员通常理解的含义。
第一方面，本发明提供了一种止血防粘连膜，包括胶原蛋白和透明质酸钠，其中，所述胶原蛋白和所述透明质酸钠的重量比是10:(1-5)，且优选是10:2.5。
其中，本发明采用的胶原蛋白优选是采用微生物发酵法获得的重组人源胶原蛋白，例如，将人胶原蛋白序列利用基因工程技术，连接表达载体，转化毕赤酵母，筛选高表达毕赤酵母工程菌进行发酵生产，并经一系列纯化工艺后，无菌过滤冷冻干燥得到。具体可参考申请号为201610388271.8、名称为“一种重组人源胶原蛋白及其编码基因和制备方法”的发明专利申请，该专利申请通过引用的方式整体并入本申请中。这种重组人源胶原蛋白的纯度高，无免疫原性，无动物源性传染病风险，吸水性强，止血氨基酸序列含量高，可体内完全降解。优选地，该重组人源胶原蛋白的分子量是35Kda-95Kda，并且更优选是70Kda。
其中，透明质酸钠优选是医药级透明质酸钠，其不同于化工级别，是一种安全性极高的高分子物质，对人体无毒、无副作用且具有良好的生物相容性，其中所谓医药级(或称作医用)是根据《中国药典》2015年版标准来界定的，本发明采用的医药级透明质酸钠通常为常规市购获得。优选地，该医药级透明质酸钠的分子量是100Kda-300Kda，并且更优选是180Kda。
发明人通过研究出乎意料地发现，将分子量为35Kda-95Kda的重组人源胶原蛋白与分子量为100Kda-300Kda的医药级透明质酸钠按照10:(1-5)重量比进行组合时，特别是将分子量为70Kda的重组人源胶原蛋白与分子量为180Kda的医药级透明质酸钠按照10:2.5重量比进行组合时，得到的止血防粘连膜具有分子链交联点丰富，降解率稳定，交联剂残留低，吸水性强等优势。
第二方面，本发明提供了一种止血防粘连膜的制备方法，包括：将胶原蛋白冻干粉与透明质酸钠按照上述重量比混合均匀，得到混合物；向混合物中加入交联剂进行交联反应，得到共混溶液；以及将共混溶液干燥、压制成膜片并灭菌。
具体地，本发明的制备方法包括如下步骤：
第一步，胶原蛋白与透明质酸钠混合。
如上所述，胶原蛋白优选是采用微生物发酵法获得的重组人源胶原蛋白，并经过滤除菌和冻干后获得重组人源胶原蛋白冻干粉。如上所述，透明质酸钠优选是医药级透明质酸钠。在混合时，先将医药级透明质酸钠溶于纯化水，终浓度为0.08％-0.5％(重量)，再将重组人源胶原蛋白冻干粉加入其中，终浓度0.1％-0.8％(重量)，混合均匀，得到二者的混合物。
第二步，交联反应。
按照交联剂的终浓度(即将交联剂加入混合物得到的溶液中交联剂的浓度)为0.01mol/L-0.1mol/L向上述混合物中加入交联剂，在0℃-37℃(优选4℃)进行交联反应4-12小时(优选5-10小时)。其中，交联剂是戊二醛、1,4丁二醇二缩水甘油醚、碳化二亚胺、二乙烯基砜、京尼平中的任意一种或多种。
在一种优选的具体实施方式中，交联反应分两步进行。具体地，先按照0.01mol/L-0.05mol/L的终浓度向第一步制备的混合物中加入第一交联剂，在0℃-37℃(优选4℃-25℃)进行第一次交联反应1-8小时(优选2-4小时)，随后按照0.01mol/L-0.1mol/L的终浓度向发生第一次交联反应后的溶液中加入第二交联剂，在0℃-37℃(优选4℃-20℃)进行第二次交联反应2-12小时(优选4-6小时)。其中，第一交联剂和第二交联剂可以分别是戊二醛、1,4丁二醇二缩水甘油醚、碳化二亚胺、二乙烯基砜、京尼平中的任意一种或多种。
交联反应结束之后，使用PBS(磷酸盐缓冲液)进行清洗以去除交联剂，交联剂的总残留量不超过0.003％。在实际操作中，本领域技术人员根据实际情况能够确定PBS用量以及清洗次数等参数。
在本发明中，交联剂、第一交联剂和第二交联剂均指的是溶液形式，即交联剂溶液、第一交联剂溶液和第二交联剂溶液，终浓度可以是0.01mol/L至0.1mol/L，例如，可以是0.02mol/L的碳化二亚胺、0.05mol/L的1,4丁二醇二缩水甘油醚、0.03mol/L的戊二醛、0.03mol/L的二乙烯基砜、0.01mol/L的京尼平或者0.05mol/L的碳二亚胺。
在本发明中，交联反应是轻度交联，交联反应彻底结束之后的产品交联强度为0.5％-10％。本发明通过轻度交联，有效降低交联剂残留，保证产品生物相容性。特别是，通过两步交联后，既保证产品具有良好的吸水凝胶性及组织粘附性以保证止血效果；同时通过轻度交联控制的体内降解速率可确保1-2周的粘连高发期产品良好保留，起预防粘连的作用，轻度交联也避免了材料体内残留过久可能引起的炎症、排异性等风险。
第三步，干燥、压制成膜片与灭菌。
将交联反应获得的共混溶液置于模具中，进行干燥，随后裁剪成需要的尺寸，并进行灭菌。在实际操作中，本领域技术人员根据实际情况能够选择合适的模具与裁剪尺寸。
其中，干燥方式包括烘干、冻干、真空干燥等。
其中，灭菌优选是低温辐照灭菌，温度是-20～-10℃，辐照剂量是15-20kGy，照射时间是2-8小时。采用低温环境辐照，既可以保证产品的无菌水平(SAL≤10-6)，也可防止胶原及多糖结构损坏。
实施例
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下列实施例中采用的胶原蛋白是采用申请号为201610388271.8、名称为“一种重组人源胶原蛋白及其编码基因和制备方法”的发明专利申请中公开的方法制备获得的重组人源胶原蛋白，由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成，通过调整中空纤维超滤系统的截留分子量来获得目标分子量的重组人源胶原蛋白，确认分子量范围为35Kda-95Kda，纯度约为99.2％。
实施例1
(1)将2.5克分子量为180Kda的医药级透明质酸钠溶于纯化水，再将10克分子量为70Kda的重组人源胶原蛋白冻干粉加入其中，重组人源胶原蛋浓度为0.8％，透明质酸钠浓度为0.2％，搅拌均匀，得到混合物；
(2)向上述混合物中加入戊二醛进行第一次交联反应，戊二醛终浓度为0.03mol/L，反应温度20℃，时间4h；随后加入二乙烯基砜进行第二次交联反应，二乙烯基砜的终浓度为0.03mol/L，反应温度20℃，时间6h，PBS反复清洗除去剩余交联剂，得到共混溶液；
(3)采用模具分装上述共混溶液，经预冻后冷冻干燥处理并压制成膜，随后将膜裁剪成6cm×8cm，并封装于医用铝箔袋中，封口，于-10℃冷冻处理8h，20kGy Co60辐照灭菌，获得止血防粘连膜1#。
实施例2
(1)将5克分子量为150Kda的医药级透明质酸钠溶于纯化水，再将10克分子量为40Kda的重组人源胶原蛋白冻干粉加入其中，重组人源胶原蛋浓度为0.4％，透明质酸钠浓度为0.2％，搅拌均匀，得到混合物；
(2)向上述混合物中加入碳化二亚胺进行第一次交联反应，碳化二亚胺终浓度为0.02mol/L，反应温度4℃，时间2h；随后继续加入1,4丁二醇二缩水甘油醚进行第二次交联反应，1,4丁二醇二缩水甘油醚的终浓度为0.05mol/L，反应温度4℃，时间5h，PBS反复清洗除去剩余交联剂，得到共混溶液；
(3)采用模具分装上述共混溶液，经预冻后冷冻干燥处理并压制成膜，随后将膜裁剪成6cm×8cm，并封装于医用铝箔袋中，封口，于-15℃冷冻处理5h，15kGy Co60辐照灭菌，获得止血防粘连膜2#。
实施例3
(1)将1克分子量为250Kda的医药级透明质酸钠溶于纯化水，再将8克分子量为90Kda的重组人源胶原蛋白冻干粉加入其中，重组人源胶原蛋浓度为0.8％，透明质酸钠浓度为0.1％，搅拌均匀，得到混合物；
(2)向上述混合物中加入终浓度为0.01mol/L的京尼平进行第一次交联反应，反应温度25℃，时间2h；随后按照终浓度为0.05mol/L比例加入碳二亚胺进行第二次交联反应，反应温度20℃，时间3h，PBS反复清洗除去剩余交联剂，得到共混溶液；
(3)采用模具分装上述共混溶液，经预冻后冷冻干燥处理并压制成膜，随后将膜裁剪成6cm×8cm，并封装于医用铝箔袋中，封口，于-20℃冷冻处理2h，10kGy Co60辐照灭菌，获得止血防粘连膜3#。
应用实施例1 细胞毒性测试
根据GB/T16886.5医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验要求进行样品的细胞毒性评价，并与同类产品进行对比，具体为：将传代48～72h生长旺盛的L929细胞胰酶消化收集，用高糖DMEM培养基配置成1×104个/mL的细胞悬液，接种至96孔板中，每孔200μL。分别制备试验组(实施例1制备的止血防粘连膜1#)、对照组(止血海绵，广州市快康医疗器械有限公司，MHC-2型)与空白对照组样品浸提液，加入细胞悬液进行共培养，在培养第68h时，对照组和试验组各孔加入MTT试剂20μL，细胞培养箱内孵育4h，吸弃液体，每孔加入160μL DMSO，调零孔此时也加入160μl DMSO，低速震荡10min，使用酶联免疫检测仪在490nm波长下测各孔吸光度值(OD值)。
根据各组的吸光度均值按照公式(1)计算细胞的相对增殖率，结果如表1所示。
表1
由表1可知，本发明制备的止血防粘连膜与上市相似产品细胞毒性均为1级，但本发明制备的止血防粘连膜的细胞增殖率为98.5％，而对照组为87.2％，差异具有显著性(P<0.05)。
应用实施例2 止血效果测试
取实施例1制备的6cm×8cm的止血防粘连膜1#(试验组)，同时称取相同质量的市售止血海绵产品(止血海绵，广州市快康医疗器械有限公司，MHC-2型)(对照组)，分别置于培养皿中，滴加5g纯水，观察对比两种样品的吸水性，成凝胶性及粘附性，对比结果如下表2所示。
表2
试验组 对照组
吸水性 3秒完全吸收 3.4秒完成吸收
成凝胶性 吸水后即刻凝胶态 吸收后逐渐凝胶态
粘附性 吸附于培养皿底部 轻微与皿底吸附
由表2的结果可知，本发明制备的止血防粘连膜成凝胶性快，吸水性强，粘附性高，吸附后不易脱落。
应用实施例3 防粘连测试(动物实验)
取4只成年新西兰白兔，后肢肌腱手术模型，分别采用本发明实施例1制备的止血防粘连膜1#(试验组)和同类防粘连膜(防粘连膜，强生(上海)医疗器材有限公司，4350XL)(对照组)对肌腱部位进行包裹，缝合伤口，分别于7d、10d、14d、21d取一只兔子进行手术部位观察，观察植入样品的存留情况，结果如表3所示。
表3
取材时间 试验组材料状态 对照组材料状态
7d 透明凝胶状覆于组织外层 透明凝胶状覆于组织外层
10d 透明凝胶状覆于组织外层 透明凝胶状覆于组织外层
14d 透明凝胶状分散状覆于组织外层 透明凝胶状覆于组织外层
21d 完全降解，组织部位无粘连发生 有部分材料残留痕迹，未完全降解
由表3的结果可知，本发明制备的止血防粘连膜经有效轻度交联，精确控制降解时间，极佳的预防了术后粘连高发期的组织粘连风险。并且最终材料3周内完全降解，无残留及其它毒副作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本方面的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的替代、修饰、组合、改变、简化等，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种止血防粘连膜，其特征在于，包括胶原蛋白和透明质酸钠，其中，所述胶原蛋白和所述透明质酸钠的重量比是10∶(1-5)。
2.根据权利要求1所述的止血防粘连膜，其特征在于，所述胶原蛋白和所述透明质酸钠的重量比是10∶2.5。
3.根据权利要求1或2所述的止血防粘连膜，其特征在于，所述胶原蛋白是重组人源胶原蛋白。
4.根据权利要求3所述的止血防粘连膜，其特征在于，所述重组人源胶原蛋白的分子量是35Kda-95Kda，优选是70Kda。
5.根据权利要求1或2所述的止血防粘连膜，其特征在于，所述透明质酸钠是医药级透明质酸钠。
6.根据权利要求5所述的止血防粘连膜，其特征在于，所述医药级透明质酸钠的分子量是100Kda-300Kda，优选是180Kda。
7.权利要求1-6任一项所述的止血防粘连膜的制备方法，其特征在于，包括：
(1)将胶原蛋白冻干粉与透明质酸钠按照重量比是10：(1-5)混合均匀，得到混合物；
(2)向步骤(1)得到的混合物中加入交联剂进行交联反应，得到共混溶液；
(3)将步骤(2)得到的共混溶液干燥、压制成膜片并灭菌。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂浓度为0.01mol/L-0.1mol/L。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述交联反应在0℃-37℃(优选4℃)进行4-12小时(优选5-10小时)。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂是戊二醛、1，4丁二醇二缩水甘油醚、碳化二亚胺、二乙烯基砜、京尼平中的任意一种或多种。
11.根据权利要求7-10任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括：按照终浓度为0.01mol/L-0.05mol/L向步骤(1)得到的混合物中加入第一交联剂，在0-37℃(优选4℃-25℃)进行第一次交联反应1-8小时(优选2-4小时)，随后按照终浓度0.01mol/L-0.1mol/L加入第二交联剂，在0-37℃(优选4℃-20℃)进行第二次交联反应2-12小时(优选4-6小时)。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述第一交联剂和所述第二交联剂分别是戊二醛、1，4丁二醇二缩水甘油醚、碳化二亚胺、二乙烯基砜、京尼平中的任意一种或多种。
13.根据权利要求7-12任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中交联反应结束之后的交联强度为0.5％-10％。
14.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，灭菌采用低温辐照灭菌，其中，温度是-20～-10℃，辐照剂量是15～20kGy。
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