CN113975461B - 一种可招募内源性间充质干细胞的支架材料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种可招募内源性间充质干细胞的支架材料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种可招募内源性间充质干细胞的支架材料，该支架材料是由巯基化透明质酸与多巴胺改性的丝素蛋白交联形成的具有复合三维网络结构的水凝胶在冷冻干燥后形成的冻干海绵支架依次经马来酰亚胺聚乙二醇活性酯溶液和一端连接半胱氨酸的E7肽的溶液浸泡处理，将E7肽经马来酰亚胺聚乙二醇活性酯接枝在冻干海绵支架上之后经干燥形成的，具有相互贯通的三维多孔结构。本发明还提供了所述支架材料的制备方法及其作为软骨组织工程三维支架或软骨组织工程三维细胞支架的应用。本发明提供的支架材料可为细胞的生长提供合适的微环境及合适的力学性能，并具有招募内源性间充质干细胞的性能。

Description

一种可招募内源性间充质干细胞的支架材料及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，涉及可招募内源性间充质干细胞的支架材料及其制备方法与应用，该支架材料在组织修复领域具有良好的应用前景。
背景技术
关节软骨缺损是一类常见的骨科疾病，由于关节软骨无血管、无淋巴、无神经，因而一旦受到损伤难以自我修复。目前的治疗方法包括微骨折、自体软骨细胞移植等，但是受限于供体细胞的不足以及长期修复效果有限，这些方法在临床上的使用受到了限制。组织工程作为一种前沿的技术在软骨修复领域吸引了众多研究者的关注。组织工程的三要素，包括支架材料、细胞、生长因子，其最基本的原则就是将体外分离扩增的细胞协同生长因子种植在支架材料上，将其移植到人体内之后可以形成新的软骨组织以达到软骨修复与重建的目的。但是，外源性细胞和生长因子的引入具有较大的外来性风险，因此，支架材料的设计对于缺损软骨的重建是至关重要的。
透明质酸是细胞外基质的重要组成成分，它的结构和生物学性能可调控细胞信号、伤口愈合和基质的形成。透明质酸水凝胶有良好的生物相容性、生物降解性、高保水性和促进软骨形成的特性，但透明质酸的降解速度快、力学强度差，且缺乏细胞黏附位点，由透明质酸形成的生物材料会抑制细胞附着，无法达到应用要求。丝素蛋白是一种天然高分子材料，无毒、无刺激性、低免疫原性，具有良好的生物降解性和生物相容性，但丝素蛋白缺乏细胞生长粘附位点，并且对细胞生长不利，这使得其无法满足实际应用需求。目前有关以透明质酸或丝素蛋白为基础构建的支架材料存在着对内源性细胞招募和保留能力不足的缺点，在实际的应用例中还存在着有外源性细胞和生长因子带来的外源性风险的不足。因此，对现有的以透明质酸或丝素蛋白为基础的软骨修复的支架材料进行改进，开发出具有良好的细胞生长微环境及合适的力学性能，并且可招募内源性间充质干细胞的支架材料，是本领域亟待解决的问题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供可招募内源性间充质干细胞的支架材料及其制备方法，以为细胞的生长提供合适的微环境及合适的力学性能，并赋予支架材料招募内源性间充质干细胞的性能，本发明还提供了上述支架材料作为软骨组织工程三维支架或软骨组织工程三维细胞支架的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供的可招募内源性间充质干细胞的支架材料，该支架材料是由巯基化透明质酸与多巴胺改性的丝素蛋白交联形成的具有复合三维网络结构的水凝胶在冷冻干燥后形成的冻干海绵支架依次经马来酰亚胺聚乙二醇活性酯溶液和一端连接半胱氨酸的E7肽的溶液浸泡处理，将E7肽经马来酰亚胺聚乙二醇活性酯接枝在冻干海绵支架上之后经干燥形成的，该支架材料具有相互贯通的三维多孔结构；
所述具有复合三维网络结构的水凝胶由巯基化透明质酸氧化自交联、多巴胺改性的丝素蛋白氧化自交联，以及巯基化透明质酸的巯基与多巴胺改性的丝素蛋白的邻苯二酚基团通过迈克加成反应形成；所述巯基化透明质酸的结构如式(I)所示，巯基化透明质酸中半胱氨的接枝率为5％～65％；所述多巴胺改性的丝素蛋白中多巴胺的接枝率为5％～60％；
Figure BDA0003385349130000021
进一步地，上述可招募内源性间充质干细胞的支架材料的技术方案中，冻干海绵支架在马来酰亚胺聚乙二醇活性酯溶液浸泡的过程中，马来酰亚胺聚乙二醇活性酯的N-羟基琥珀酰亚胺活性酯与冻干海绵支架的氨基反应而接枝在冻干海绵支架上；在一端连接半胱氨酸的E7肽的溶液浸泡的过程中，E7肽一端连接的半胱氨酸的巯基与马来酰亚胺聚乙二醇活性酯的马来酰亚胺基团反应而将E7肽接枝在冻干海绵支架上。
上述可招募内源性间充质干细胞的支架材料的技术方案中，所述冻干海绵支架中，巯基化透明质酸与多巴胺改性的丝素蛋白的质量比优选为(0.25～4):1。
上述可招募内源性间充质干细胞的支架材料的技术方案中，接枝在冻干海绵支架上的E7肽在支架材料中的含量优选为0.05wt.％～10wt.％。
上述可招募内源性间充质干细胞的支架材料的技术方案中，所述马来酰亚胺聚乙二醇活性酯溶液的浓度优选为0.1～5mg/mL、pH值优选为7～9，所述一端连接半胱氨酸的E7肽的溶液的浓度优选为0.01～0.5mg/mL、pH值优选为5.5～7.5。
上述可招募内源性间充质干细胞的支架材料的技术方案中，所述多巴胺改性的丝素蛋白的制备方法如下：
将脱除丝胶、清洗并干燥后的蚕茧浸没于浓度为8～10mol/L的LiBr溶解0.5～6h，然后用水充分透析，向所得丝素蛋白溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，在pH值为4～5的条件下活化1～2h，然后加入盐酸多巴胺反应8～24h，用水充分透析，得到多巴胺改性的丝素蛋白；
丝素蛋白、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与盐酸多巴胺的摩尔比为1:(0.2～2):(1.5～6):(5～10)。
上述可招募内源性间充质干细胞的支架材料的技术方案中，该支架材料的多孔结构的孔径优选为40～100μm。
上述可招募内源性间充质干细胞的支架材料的技术方案中，巯基化透明质酸是以透明质酸为基础通过半胱胺改性得到的，作为改性基础的透明质酸的分子量为0.1～4.0MDa。巯基化透明质酸的制备方法可参见CN104892962A。
上述可招募内源性间充质干细胞的支架材料的技术方案中，所述巯基化透明质酸中半胱氨的接枝率优选为10％～50％，进一步优选为20％～40％；所述多巴胺改性的丝素蛋白中多巴胺的接枝率优选为10％～50％，进一步优选为10％～30％。
本发明还提供了上述可招募内源性间充质干细胞的支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将巯基化透明质酸溶解于去离子水中形成浓度为0.5wt.％～20wt.％的巯基化透明质酸溶液；将多巴胺改性的丝素蛋白配制成浓度为0.5wt.％～20wt.％的多巴胺改性的丝素蛋白溶液；
(2)将巯基化透明质酸溶液与多巴胺改性的丝素蛋白溶液按照(1～15):(1～15)的体积比混合均匀，调节pH值至7.0～8.0，注入模具中，在34～40℃静置形成复合水凝胶，将复合水凝胶冷冻干燥，得到冻干海绵支架；
(3)将冻干海绵支架置于浓度为0.1～5mg/mL、pH为7～9的马来酰亚胺聚乙二醇活性酯溶液中充分浸泡，然后取出置于浓度为0.01～0.2mg/mL、pH为5.5～7.5的一端连接半胱氨酸的E7肽的溶液中在2～7℃充分浸泡，取出，充分清洗，干燥，即得可招募内源性间充质干细胞的支架材料。
上述制备方法的技术方案的步骤(3)中，将冻干海绵支架置于马来酰亚胺聚乙二醇活性酯溶液中浸泡0.5～2h，然后取出置于一端连接半胱氨酸的E7肽的溶液中在2～7℃浸泡18～26h，取出，充分清洗，干燥，即得可招募内源性间充质干细胞的支架材料。
上述制备方法的步骤(2)中，最好是将巯基化透明质酸溶液与丝素-多巴胺溶液在冰浴条件下混合均匀。
上述制备方法的步骤(1)中，巯基化透明质酸溶液的浓度优选为1wt.％～10wt.％，多巴胺改性的丝素蛋白溶液的浓度优选为1wt.％～10wt.％。
上述制备方法的步骤(2)中，优选将巯基化透明质酸溶液与多巴胺改性的丝素蛋白溶液按照(1～4):(1～4)的体积比混合均匀，进一步优选地，将巯基化透明质酸溶液与多巴胺改性的丝素蛋白溶液按照(0.25～4):1的体积比混合均匀。
本发明还提供了上述可招募内源性间充质干细胞的支架材料作为软骨组织工程三维支架或软骨组织工程三维细胞支架的应用。
将上述可招募内源性间充质干细胞的支架材料作为软骨组织工程三维细胞支架应用时，所述三维细胞支架的制备方法如下：
将上述支架材料经紫外照射或辐照灭菌，向灭菌后的支架材料上滴加间充质干细胞的细胞悬液，然后浸没于培养基中，在培养箱中于32～42℃、3％～8％的CO2的条件下培养至少1天即得三维细胞支架，培养期间定期更换培养基；所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素与链霉素的混合液以及胎牛血清得到，α-MEM培养基中青霉素与链霉素混合液的浓度为0.5％～1.5％，胎牛血清的浓度为5％～15％；所述细胞悬液的滴加量：按照1×105～1×107cells/mL的比例向灭菌后的支架材料上滴加细胞悬液。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案产生了以下有益的技术效果：
1.本发明提供了可招募内源性间充质干细胞的支架材料，由巯基化透明质酸与多巴胺改性的丝素蛋白交联形成的具有复合三维网络结构的水凝胶在冷冻干燥后形成的冻干海绵支架依次经马来酰亚胺聚乙二醇活性酯溶液和一端连接半胱氨酸的E7肽的溶液浸泡处理，将E7肽经马来酰亚胺聚乙二醇活性酯接枝在冻干海绵支架上之后经干燥形成的，该支架材料具有相互贯通的三维多孔结构。该支架材料在具有良好的生物相容性和生物可降解性能的基础上，由于该支架材料中巯基化透明质酸与多巴胺改性的丝素蛋白的比例适当，且巯基化透明质酸中半胱氨的接枝率和丝素-多巴胺中多巴胺的接枝率适当，加之在支架材料中引入了适量的E7肽，这些因素的综合作用使得本发明提供的支架材料克服了透明质酸和丝素蛋白缺乏细胞粘附位点、无法实现细胞铺展生长以及降解速度过快且产生酸性环境的问题，不但力学性能和降解性能适当，而且具有相互贯通的三维多孔结构，有利于营养物质的输送、细胞的生长和增殖，同时，该支架材料还能有效地促进间充质干细胞细胞的铺展生长和增殖，利于间充质干细胞的定向迁移，有利于细胞维持表型，在软骨损伤修复领域有着重要的潜在应用价值。
2.本发明通过体外细胞实验证实，本发明提供的支架材料能够很好地促进间充质干细胞细胞增殖，分泌特异性基质，间充质干细胞在以该支架材料为基础形成的软骨组织工程三维细胞支架中铺展生长并且细胞粘附性良好，间充质干细胞团的数量和大小随着培养时间延长而增加，有效改善了丝素蛋白和巯基化透明质酸组三维细胞支架软骨细胞铺展困难的问题。
3.本发明通过动物实验证实，采用本发明提供的支架材料对兔软骨缺损处进行修复，支架材料在植入体内6周后，再生软骨的组织填充较为完整，再生软骨的厚度接近天然骨的软骨厚度，并且再生软骨在缺损部位填充、细胞分布排列情况也接近天然骨，具有良好的组织修复效果。
4.本发明还提供了一种制备可招募内源性间充质干细胞的支架材料的方法，该方法通过调整巯基化透明质酸溶液与丝素蛋白-多巴胺溶液的浓度及体积比，以及调整马来酰亚胺聚乙二醇活性酯溶液和一端连接半胱氨酸的E7肽的溶液的浓度和浸泡时间等因素，可调整凝胶的形成时间、支架降解速度、力学特性、三维多孔结构以及招募内源性间充质干细胞的能力，可制备出满足不同应用需求的支架材料，具有可控性好和灵活性强的特点。
5.本发明还提供了上述支架材料在软骨修复领域的应用，根据具体的应用需求，可将该支架材料植入生物体的待修复部位形成软骨组织工程三维支架，或者是将融合了间充质干细胞等活性物质的复合支架材料植入至生物体的待修复部位形成软骨组织工程三维细胞支架，应用方式多样化，使用方式简单。
附图说明
图1是实施例1制备的HA-SH的核磁共振氢谱图。
图2是实施例2制备的SF和SF-DOPA的红外谱图。
图3是实施例4制备的支架材料的照片。
图4是实施例3制备的冻干支架在接枝短肽前后的的红外谱图。
图5是实施例4制备的支架材料的XPS元素含量测试结果图。
图6是实施例4制备的支架材料的扫描电镜照片。
图7是实施例4中以实施例3的实验组②的冻干支架为基础制备的支架材料在多频模式下的储能模量变化曲线。
图8是实施例4中以实施例3的实验组②的冻干支架为基础制备的支架材料的溶胀曲线。
图9是实施例4中以实施例3的实验组②的冻干支架为基础制备的支架材料的在降解行为测试结果。
图10是实施例9中培养不同时间的三维细胞支架的共聚焦激光扫描显微镜照片。
图11是不同的支架材料和空白对照组的transwell细胞迁移测试的显微镜图。
图12是不同的支架材料和空白对照组的transwell细胞迁移测试的吸光度柱状图。
图13是不同的支架材料与细胞共培养21天后的GAG含量测定结果图。
图14是不同的支架材料对兔软骨缺损处的修复效果图。
图15是不同的支架材料对兔软骨缺损处修复后形成的软骨厚度图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明提供的可招募内源性间充质干细胞的支架材料及其制备方法与应用作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于本发明的保护范围。
下述各实施例中，所采用的马来酰亚胺聚乙二醇活性酯(NHS-PEG-MAL)的结构如下，
Figure BDA0003385349130000061
其分子量约为5000。一端连接半胱氨酸的E7肽购买自北京中科亚光生物科技有限公司。
实施例1
本实施例制备巯基化透明质酸(HA-SH)，步骤如下：
(1)将分子量为0.3MDa的透明质酸钠溶解于去离子水中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，充分溶解，然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，充分溶解，用1mol/L的NaOH溶液和1mol/L的HCl溶液调节混合液的pH值至4.75，在室温反应2h，然后加入半胱氨盐酸盐(CSH·HCl)的水溶液，在室温反应24h，之后用1mol/L的NaOH溶液调节反应液的pH值至8.5，加入二硫苏糖醇(DTT)溶液，在室温反应12h。
该步骤中，透明质酸钠、NHS、EDC·HCl、CSH·HCl与DTT的摩尔比为1:2:4:4:12。
(2)用1mol/L的HCl溶液调节步骤(1)所得反应液的pH值至3.0～3.5，在pH值为3.0～3.5的去离子水中透析72h，冷冻干燥，得到巯基化透明质酸(HA-SH)，其核磁共振氢谱图如图1所示。
采用改进的Ellman法测定HA-SH的巯基取代度，结果显示HA-SH中半胱氨的接枝率约为32％。通过改变EDCI与CSA·HCl的摩尔比、HA的分子量，可改变HA-SH中巯基的取代度，即改变HA-SH中半胱氨的接枝率，随着EDCI与CSA·HCl的摩尔比增加，巯基取代度逐渐升高，而HA的分子量越高，巯基取代度越低，通过调整EDCI与CSA·HCl的摩尔比以及HA的分子量，可以调整HA-SH中半胱氨的接枝率在5％～65％之间。
实施例2
本实施例制备多巴胺改性的丝素蛋白(SF-DOPA)，步骤如下：
(1)将家蚕蚕茧剪碎，按照1:100的浴比在0.02mol/L的Na2CO3溶液中煮沸2h脱除丝胶，清洗、干燥，然后浸没于9.3mol/L的LiBr溶液中溶解4h，将所得反应液转入透析袋中，用去离子水中透析72h，得到丝素蛋白(SF)溶液。
(2)向步骤(1)所得SF溶液中加入，加入EDC·HCl和NHS，用1mol/L的NaOH溶液和1mol/L的HCl溶液调节混合液的pH值至4.75，活化2h，然后加入盐酸多巴胺在室温反应10h，将所得反应液转入透析袋中，用去离子水透析72h，得到SF-DOPA水溶液。
步骤(2)中，控制SF、NHS、EDC·HCl与盐酸多巴胺的摩尔比为1:2:5:5。步骤(1)(2)采用的透析袋的cutoffMW＝8000～13000。
本实施例制备的SF和SF-DOPA的红外谱图如图2所示，SF-DOPA的红外谱图中，在1550cm-1和1280cm-1处出现了多巴胺的特征吸收峰，而SF的红外谱图中并无该特征峰，说明本实施例成功制备了SF-DOPA。
测试本实施例制备的SF-DOPA中多巴胺的接枝率，结果发现其中多巴胺的接枝率约为30％。通过调整NHS、EDC·HCl、盐酸多巴胺与SF的摩尔比，可以改变SF-DOPA中多巴胺的接枝率在5％～60％之间。
实施例3
本实施例中，制备冻干海绵支架，步骤如下：
(1)将实施例1制备的HA-SH溶解于去离子水中形成浓度为1wt.％～10wt.％的HA-SH溶液；将实施例2制备的SF-DOPA水溶液的浓度调整至SF-DOPA的浓度为1wt.％～10wt.％，得到SF-DOPA溶液。
(2)将HA-SH溶液与SF-DOPA溶液按照(1～10):(1～10)的体积比在冰浴条件下混合均匀，用0.5mol/L的NaOH溶液和0.1mol/L的HCl溶液调节pH值至7.4，注入硅胶模具中，在37℃静置5min，即形成复合水凝胶，将复合水凝胶冷冻干燥，得到冻干海绵支架。
本实施例中，通过调整步骤(1)(2)中的浓度和体积比，一共进行了五组实验，制备得到了五种冻干海绵支架，各实验组的实验条件如表1所示。
表1各组实验的实验条件
Figure BDA0003385349130000071
Figure BDA0003385349130000081
实施例4
本实施例中，制备可招募内源性间充质干细胞的支架材料。
将马来酰亚胺聚乙二醇活性酯(NHS-PEG-MAL)配制成浓度为5mg/mL的溶液，用0.5mol/L的NaOH溶液和0.1mol/L的HCl溶液调节pH值至8.5；将一端连接半胱氨酸的E7肽配制成浓度为0.25mg/mL的溶液，用0.5mol/L的NaOH溶液和0.1mol/L的HCl溶液调节pH值至6.5。
分别将实施例3制备的五种冻干海绵支架置于浓度为NHS-PEG-MAL中浸泡2h，然后取出置于一端连接半胱氨酸的E7肽的溶液中，在4℃浸泡24h，取出，用PBS缓冲液充分清洗，干燥，即得支架材料。
本实施例以实施例3的实验组①～⑤制备的冻干支架的照片如图3的(A)～(E)图所示。图4是实施例3制备的冻干支架在接枝短肽前后的的红外谱图，在接枝E7肽后，红外谱图在1629cm-1和1332cm-1处出现了明显的酰胺键特征吸收峰和峰的移动，而在未接枝E7肽时，红外谱图中并无该特征峰，说明本实施例成功接枝了E7肽。图5是本实施例制备的支架材料的XPS元素定量测试结果，根据XPS元素定量测试结果计算，发现接枝在冻干海绵支架上的E7肽在支架材料中的含量为0.616wt.％。通过E7肽溶液的浓度，可以调整接枝在冻干海绵支架上的E7肽的量。
实施例5
本实施例中，对实施例4制备的支架材料进行扫描电镜测试。
将实施例4制备的支架材料分别采用置于电镜下进行观察，结果如图6所示，图6的(A)～(E)图依次为以实施例3中的实验组①～⑤制备的冻干支架为基础制备的支架材料的扫描电镜扫描图。由图3、6可知，实施例4制备的支架材料的表面和内部均具有相互贯通的多孔结构，孔径大小约为40～100μm。这种相互贯通的三维多孔结构有利于营养物质的输送，以及细胞的生长和增殖。由图6还可以看出，通过调节HA-SH与SF-DOPA的比例关系，可调节支架材料的孔径大小。
实施例6
本实施例中，测试实施例4制备的支架材料的力学性能。
将支架材料在室温下置于动态力学分析仪(TAInstrumentsQ800，USA)上，在多频模式(1～10Hz)下测试支架材料的储能模量(G′)的变化曲线，结果表明，支架材料的储能模量(G′)为5～60KPa，可为细胞的生长和增殖提供一定的力学支撑。其中，实施例4中以实施例3的实验组②制备的冻干支架为基础制备的支架材料的储能模量(G′)的变化曲线力学性能如图7所示，由图7可知，该支架材料的储能模量(G′)为10～50KPa。
实施例7
本实施例中，测试实施例4中以实施例3的实验组②制备的冻干支架为基础制备的支架材料的溶胀性能。
将支架材料称重，记作Wo，然后浸入PBS缓冲液中，置于恒温摇床在37℃、90rpm的转速下振荡，每隔一段时间将支架材料取出，用滤纸吸去支架材料表面的水分并称重，记作Wr，按以下公式计算溶胀比：
溶胀比Q＝(Wr-Wo)/Wo×100％
根据不同时间点测得的溶胀比绘制溶胀曲线，如图8所示，由图可知，该支架材料能在短时间内快速吸水达到溶胀平衡，且溶胀比合适，有利于确保营养物质的交换。
实施例8
本实施例中，测试实施例4中以实施例3的实验组②制备的冻干支架为基础制备的支架材料的生物降解性能。
将支架材料称重，记作Wo，然后分别浸入含有100unit/mL透明质酸酶(HAase)的PBS缓冲液，以及含有100unit/mL链霉蛋白酶(Pronase)的PBS缓冲液中，置于恒温摇床在37℃、90rpm的转速下振荡，24h后将支架材料取出冷冻干燥并称重，记作Wr。将支架材料的降解行为用质量损失百分数表示，按以下公式计算：
质量损失百分数＝(Wo-Wr)/Wo×100％
根据24h后测得的质量计算质量损失百分数，如图9所示，由图可知,该支架材料具有生物降解性能，另外我们通过实验发现，在制备支架材料时通过调整支架材料中HA-SH与SF-DOPA的比例，可以调节支架材料的孔径大小。通过调整支架材料的原料比例，可调节支架材料的降解速率，进而可使支架材料的降解速率与细胞增殖速率相匹配。
实施例9
本实施例中，制备软骨组织工程三维细胞支架，步骤如下：
(1)将实施例1制备的HA-SH溶解于去离子水中形成浓度为3wt.％的HA-SH溶液；将实施例2制备的SF-DOPA水溶液的浓度调整至SF-DOPA的浓度为3wt.％，得到SF-DOPA溶液。
(2)将HA-SH溶液与SF-DOPA溶液按照2:1的体积比在冰浴条件下混合均匀，用0.5mol/L的NaOH溶液和0.1mol/L的HCl溶液调节pH值至7.4，注入硅胶模具中，在37℃静置10min，即形成复合水凝胶，将复合水凝胶冷冻干燥，得到冻干海绵支架。
(3)将NHS-PEG-MAL配制成浓度为1mg/mL的溶液，调节pH值至8.5；将一端连接半胱氨酸的E7肽配制成浓度为0.1mg/mL的溶液，调节pH值至6.5。
将冻干海绵支架置于NHS-PEG-MAL溶液中浸泡1h，然后取出置于一端连接半胱氨酸的E7肽的溶液中，在4℃浸泡24h，最后取出，用PBS缓冲液充分清洗，干燥，即得支架材料。
(4)将步骤(3)制备的支架材料经紫外照射灭菌，按照5×106cells/mL的比例向灭菌后的支架材料上滴加细胞悬液，然后浸没于培养基中，置于培养箱中在37℃、5％的CO2的条件下培养7天，培养期间每隔1天更换新鲜的培养基，培养得到软骨组织工程三维细胞支架。
所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素与链霉素的混合液以及胎牛血清得到，α-MEM培养基中青霉素与链霉素的混合液的浓度为1％，胎牛血清的浓度为10％。所述细胞悬液由从出生1～5天的幼兔的关节中提取的骨髓间充质干细胞配制而成。
步骤(1)～(4)中，同时制备多个软骨组织工程三维细胞支架，分别将步骤(4)中培养1天、3天和7天的三维细胞支架取出，用PBS缓冲液清洗2遍，将清洗后的三维细胞支架浸没于含有1μg/mL的FDA和1μg/mL的PI的PBS缓冲液中染色5min，然后用PBS缓冲液清洗1次，通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察三维细胞支架中的软骨细胞的生长状态和分布情况。结果如图10所示，图10的第一列、第二列和第三列分别是培养1、3、7天后的三维细胞支架的共聚焦激光扫描显微镜照片，其中的第一行和第二行分别代表不同的放大倍数。由10图可知，随着培养时间的增加，细胞增殖明显，并且在后期出现成团生长，说明本发明的支架材料可作为软骨组织工程三维细胞支架应用。
对比例1
本对比例中，以丝素蛋白(SF)和巯基化透明质酸(HA-SH)制备支架材料SF-HS，步骤如下：
(1)将实施例1制备的HA-SH溶解于去离子水中形成浓度为3wt.％的HA-SH溶液，将实施例2制备的SF溶液的浓度调整至3wt.％。
(2)将HA-SH溶液与SF溶液按照2:1的体积比在冰浴条件下混合均匀，用0.5mol/L的NaOH溶液和0.1mol/L的HCl溶液调节pH值至7.4，注入硅胶模具中，在37℃静置5min，即形成复合水凝胶，将复合水凝胶冷冻干燥，得到支架材料SF-HS。
对比例2
本对比例中，以SF-DOPA和HA-SH为原料，制备支架材料SFD-HS，步骤如下：
(1)将实施例1制备的HA-SH溶解于去离子水中形成浓度为3wt.％的HA-SH溶液，将实施例2制备的SF-DOPA水溶液的浓度调整至3wt.％，得到SF-DOPA溶液。
(2)将HA-SH溶液与SF-DOPA溶液按照2:1的体积比在冰浴条件下混合均匀，用0.5mol/L的NaOH溶液和0.1mol/L的HCl溶液调节pH值至7.4，注入硅胶模具中，在37℃静置5min，即形成复合水凝胶，将复合水凝胶冷冻干燥，得到支架材料SFD-HS。
实施例10
本实施例中，测试实施例4中以实施例3的实验组②制备的冻干支架为基础制备的支架材料对间充质干细胞定向迁移能力的影响。
将实施例4中以实施例3的实验组②制备的冻干支架为基础制备的支架材料记作E7，将E7置于Transwell小室下层，上层以1×105cells/室～5×106cells/室加入间充质干细胞，培养24h后，用多聚甲醛固定小室，小心擦除上层未迁移的细胞，将小室进行结晶紫染色，并在显微镜下拍摄图片。之后用20％～50％浓度的乙酸溶液浸泡小室0.5～1h，溶解已结合细胞的染料，用酶标仪在573nm波长处测量吸光度。
同时设置SF-HS组、SFD-HS组和空白对照组(CONTROL组)，SF-HS组是将支架材料E7替换为对比例1制备的支架材料SF-HS，SFD-HS组是将支架材料E7替换为对比例2制备的支架材料SFD-HS，CONTROL组中不添加支架材料，直接加入间充质干细胞进行培养。
本实施例的测试结果如图11～12所示，图11是显微镜下拍摄的图片，图12是吸光度柱状图。由图可知，相对于支架材料SF-HS和SFD-HS，本发明在冻干海绵支架上接枝E7肽之后，能更好地促进间充质干细胞的定向迁移。
实施例11
将实施例4中以实施例3的实验组②制备的冻干支架为基础制备的支架材料经紫外照射灭菌，按照1×106cells/mL的比例向灭菌后的支架材料上滴加间充质干细胞的细胞悬液，然后浸没于培养基中，在培养箱中于37℃、5％的CO2的条件下培养21天，培养期间定期更换培养基。所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素与链霉素的混合液以及胎牛血清得到，α-MEM培养基中青霉素与链霉素混合液的浓度为1％，胎牛血清的浓度为10％。
同时设置SF-HS组和SFD-HS组作为对照，SF-HS组是将支架材料E7替换为对比例1制备的支架材料SF-HS，SFD-HS组是将支架材料E7替换为对比例2制备的支架材料SFD-HS。
经过21天的培养后，取出各组支架材料，用PBS缓冲液清洗，加入1mL木瓜蛋白酶消化液，于65℃水浴锅消化18h，取上清液备用。使用BlycanTMSulfatedGlycosaminoglycansAssay试剂盒对硫酸化的GAG进行测定，向待测样品中加入1mL染液(Blyscandyereagent)，震荡10～40min，离心弃上清，加入0.2～2mL溶解液(dissociationreagent)，震荡5～20min，在波长656nm处用酶标仪测定吸光值。根据标准曲线计算每个样品的sGAG含量，结果如图13所示。
由图13可知，相对于支架材料SF-HS和SFD-HS，本发明在冻干海绵支架上接枝E7肽之后，与间充质干细胞共培养相同的时间，样品中sGAG的含量明显更高，说明本发明提供的支架材料能更好地促进间充质干细胞细胞增殖，分泌特异性基质。
实施例12
本实施例中，采用实施例4中以实施例3的实验组②制备的冻干支架为基础制备的支架材对兔软骨缺损处进行修复，考察其修复性能。
将实施例4中以实施例3的实验组②制备的冻干支架为基础制备的支架材料植入兔软骨缺损处(记作SFD-HS+E7组)，6周后通过注射过量麻醉对动物进行安乐死，打开关节后取样进行大体观拍摄，并用10％EDTA溶液脱钙后切开进行截面拍摄，脱钙完成后进行包埋、切片染色处理。
同时设置SFD-HS组和微骨折组(MF组)作为对照，SFD-HS组是将实施例4中以实施例3的实验组②制备的冻干支架为基础制备的支架材料替换为对比例2制备的支架材料SFD-HS。
获取切片样本后进行苏木精-伊红(HE)染色。切片首先浸泡二甲苯里，进行脱蜡处理，重复2～4次，每次2～10min，再用梯度乙醇/水溶液进行水化，每个梯度2～10min。复水完成后，将苏木素染液滴加到切片组织上完全浸没5～10min，自来水浸泡3～10min。接着样本于伊红染液染色1～10min，随后放进95％乙醇中脱水两次，每次0.5～5min，再用100％乙醇脱水处理两次，每次1～5min，二甲苯处理2次，封片保存。
结果如图14所示，相较于MF组，SFD-HS+E7组在植入支架材料6周后，由大体观可得，其再生软骨的组织填充相较于MF和SFD-HS组更加完整，再生软骨的厚度也更接近于天然骨的软骨厚度，如图15所示，图15中的Nature代表天然骨、MF代表微骨折组、SFD-HS代表SFD-HS组、E7代表SFD-HS+E7组。由HE染色得知，SFD-HS+E7组的缺损部位填充，细胞分布排列相较其他两组更趋近于天然软骨，具有更好的组织修复效果。

Claims (10)

1.一种可招募内源性间充质干细胞的支架材料，其特征在于，该支架材料是由巯基化透明质酸与多巴胺改性的丝素蛋白交联形成的具有复合三维网络结构的水凝胶在冷冻干燥后形成的冻干海绵支架依次经马来酰亚胺聚乙二醇活性酯溶液和一端连接半胱氨酸的E7肽的溶液浸泡处理，将E7肽经马来酰亚胺聚乙二醇活性酯接枝在冻干海绵支架上之后经干燥形成的，该支架材料具有相互贯通的三维多孔结构；
所述具有复合三维网络结构的水凝胶由巯基化透明质酸氧化自交联、多巴胺改性的丝素蛋白氧化自交联，以及巯基化透明质酸的巯基与多巴胺改性的丝素蛋白的邻苯二酚基团通过迈克加成反应形成；所述巯基化透明质酸的结构如式(I)所示，巯基化透明质酸中半胱氨的接枝率为5％～65％；所述多巴胺改性的丝素蛋白中多巴胺的接枝率为5％～60％；
Figure FDA0003385349120000011
2.根据权利要求1所述可招募内源性间充质干细胞的支架材料，其特征在于，冻干海绵支架在马来酰亚胺聚乙二醇活性酯溶液浸泡的过程中，马来酰亚胺聚乙二醇活性酯的N-羟基琥珀酰亚胺活性酯与冻干海绵支架的氨基反应而接枝在冻干海绵支架上；在一端连接半胱氨酸的E7肽的溶液浸泡的过程中，E7肽一端连接的半胱氨酸的巯基与马来酰亚胺聚乙二醇活性酯的马来酰亚胺基团反应而将E7肽接枝在冻干海绵支架上。
3.根据权利要求1所述可招募内源性间充质干细胞的支架材料，其特征在于，所述冻干海绵支架中，巯基化透明质酸与多巴胺改性的丝素蛋白的质量比为(0.25～4):1。
4.根据权利要求1所述可招募内源性间充质干细胞的支架材料，其特征在于，接枝在冻干海绵支架上的E7肽在支架材料中的含量为0.05wt.％～10wt.％。
5.根据权利要求1所述可招募内源性间充质干细胞的支架材料，其特征在于，多巴胺改性的丝素蛋白的制备方法如下：
将脱除丝胶、清洗并干燥后的蚕茧浸没于浓度为8～10mol/L的LiBr溶解0.5～6h，然后用水充分透析，向所得丝素蛋白溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，在pH值为4～5的条件下活化1～2h，然后加入盐酸多巴胺反应8～24h，用水充分透析，得到多巴胺改性的丝素蛋白；
丝素蛋白、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与盐酸多巴胺的摩尔比为1:(0.2～2):(1.5～6):(5～10)。
6.根据权利要求1所述可招募内源性间充质干细胞的支架材料，其特征在于，该支架材料的多孔结构的孔径为40～100μm。
7.权利要求1至6中任一权利要求所述可招募内源性间充质干细胞的支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将巯基化透明质酸溶解于去离子水中形成浓度为0.5wt.％～20wt.％的巯基化透明质酸溶液；将多巴胺改性的丝素蛋白配制成浓度为0.5wt.％～20wt.％的多巴胺改性的丝素蛋白溶液；
(2)将巯基化透明质酸溶液与多巴胺改性的丝素蛋白溶液按照(1～15):(1～15)的体积比混合均匀，调节pH值至7.0～8.0，注入模具中，在34～40℃静置形成复合水凝胶，将复合水凝胶冷冻干燥，得到冻干海绵支架；
(3)将冻干海绵支架置于浓度为0.1～5mg/mL、pH为7～9的马来酰亚胺聚乙二醇活性酯溶液中充分浸泡，然后取出置于浓度为0.01～0.5mg/mL、pH为5.5～7.5的一端连接半胱氨酸的E7肽的溶液中在2～7℃充分浸泡，取出，充分清洗，干燥，即得可招募内源性间充质干细胞的支架材料。
8.根据权利要求7所述可招募内源性间充质干细胞的支架材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将冻干海绵支架置于马来酰亚胺聚乙二醇活性酯溶液中浸泡0.5～2h，然后取出置于一端连接半胱氨酸的E7肽的溶液中在2～7℃浸泡18～26h，取出，充分清洗，干燥，即得可招募内源性间充质干细胞的支架材料。
9.根据权利要求7或8所述可招募内源性间充质干细胞的支架材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中将巯基化透明质酸溶液与丝素-多巴胺溶液在冰浴条件下混合均匀。
10.权利要求1至6中任一权利要求所述可招募内源性间充质干细胞的支架材料作为软骨组织工程三维支架或软骨组织工程三维细胞支架的应用。
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