CN113750297B - 一种结构和功能仿生尿道支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种结构和功能仿生尿道支架及其制备方法；制备方法为：(1)将氧化细菌纤维素纳米纤维分散液与脱细胞基质溶液混匀倒入模具I中至完全填充并冷冻干燥得到未交联的多孔支架；(2)将未交联的多孔支架放入交联剂溶液中，交联后用水漂洗，随后冷冻干燥得到交联的多孔支架；(3)将由氧化细菌纤维素纳米纤维、改性或未改性天然高分子材料、成胶助剂和水组成的混合液II倒入硅胶模具II中至完全填充，将交联的多孔支架固定在模具II上，使其与混合液II接触，静置一段时间得到结构和功能仿生尿道支架；制得的支架由仿生尿道黏膜的水凝胶层与仿生尿道海绵体的多孔层组成，植入体内后能够快速上皮化及血管化，具有良好的尿道缺损修复效果。

Description

一种结构和功能仿生尿道支架及其制备方法
技术领域
本发明属于尿道支架的技术领域，涉及一种尿道修复支架及制备方法，特别涉及一种结构和功能仿生尿道支架及其制备方法。
背景技术
尿道狭窄是由创伤、感染、医源性操作等原因引起的泌尿外科疾病，全球尿道狭窄发病率为0.3％，尤其是复杂性长段尿道狭窄，严重影响患者的生活质量，其修复重建一直是泌尿外科临床面临的一大难题。自体组织移植，如口腔内黏膜、阴茎皮瓣、膀胱黏膜，是目前临床上治疗尿道狭窄的主要措施。但这种方法存在“以牺牲正常组织为代价”、“可供移植的组织来源有限”的局限性。近年来，组织工程技术的发展为尿道修复重建开辟了新途径，而组织工程的核心要素是支架材料。
在尿道组织工程支架材料中，二维生物补片脱细胞基质类如小肠黏膜脱细胞基质、膀胱脱细胞基质，这类材料在修复短段尿道缺损(<1cm)时，效果比较理想。但是当缺损段过长、面积过大时，往往出现缺血坏死、瘢痕化、尿道再狭窄的情况。究其原因，是因为二维支架材料无法在体内快速血管化，而尿道修复过程中细胞的迁移、增殖、组织的生成依赖于血管网络为其提供氧气和营养物质。这些血管网络中毛细血管间的最大距离是200μm，毛细血管只能为这个距离以内的细胞提供氧气和营养物质。因此，对于长段尿道缺损组织，在支架材料植入体内后，宿主的滋养血管延伸到缺损的中心区域较为困难，而植入材料往往因不能及时建立有效的血管网络影响细胞迁移、增殖和存活，最终导致修复失败。
为了解决二维支架材料存在的血管化不足的问题，现有技术以丝素蛋白、细菌纤维素、明胶等构建了三维多孔支架，其多孔结构可以促进宿主细胞和血管长入移植物，修复段组织的血管化程度明显提高，但新生尿道的黏膜上皮层数比正常尿道明显薄弱，影响修复段尿道长期功能的发挥。因此，三维支架材料上皮化不足，引起上皮的保护性屏障功能失调，尿液中的细胞毒性成份如硫酸鱼精蛋白和低分子量的阳离子毒性因子，会影响支架内细胞活力，引起纤维化、尿道再狭窄。因此，快速构建血管网络和尿道黏膜上皮再生是以组织工程技术实现尿道生理性修复的关键，二者相辅相成，缺一不可。
目前文献和专利所提供的促进血管化策略大都是把材料和生长因子(例如血管内皮生长因子(VEGF)是血管内皮细胞的特异性丝裂原，也是一种有效的血管形成和血管通透诱导因子，能促进血管内皮细胞增殖，诱导新生血管形成)结合。授权号为CN102488926B的中国发明专利“一种用于尿道重建的组织工程支架及其制备方法”公布了一种以含VEGF的再生丝素蛋白溶液为纺丝液，通过静电纺丝工艺将其喷涂在脱细胞基质上，制备了用于尿道重建的组织工程支架的方法，但生长因子半衰期较短、易失活、成本高，该类方法在临床应用方面还有很长的距离。
目前文献和专利所提供的促进上皮化策略一般是通过材料复合种子细胞促进上皮化的，但这种方法需要大量的种子细胞。公开号为CN110960727A的中国发明专利“一种组织工程化尿道支架移植物及其制备方法和应用”公布了一种接种有上皮细胞和平滑肌细胞的高分子材料可降解纳米纤维管作为组织工程化尿道移植物，以上皮细胞为种子细胞促进移植物植入后快速形成上皮层，然而上皮细胞来源有限，培养过程繁琐，取材部位会出现后遗症。
发明内容
本发明针对现有尿道支架材料上皮化和血管化不足，通过水凝胶层与多孔层复合构建了一种仿生正常尿道组织黏膜层和海绵体层结构和功能的仿生尿道支架，使支架植入后快速上皮化及血管化，促进尿道修复重建。
为了实现上述目的，本发明的方案如下：
一种结构和功能仿生尿道支架，由仿生尿道黏膜的水凝胶层与仿生尿道海绵体的多孔层组成；水凝胶层主要由氧化细菌纤维素纳米纤维、改性或未改性天然高分子材料和水组成；多孔层主要由氧化细菌纤维素纳米纤维和脱细胞基质组成，脱细胞基质为仅脱除细胞成份后的基质，基质中含有胶原、纤连蛋白、生长因子、硫酸化的糖胺聚糖等成份，仅脱除细胞成份，脱细胞基质溶解后，胶原、纤连蛋白、生长因子、硫酸化的糖胺聚糖等成份还保留着，因此最终制得的支架的多孔层中含有这些成份，硫酸化的糖胺聚糖能够与生长因子结合，保护生长因子的活性。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种结构和功能仿生尿道支架，天然高分子材料为海藻酸钠；改性天然高分子材料为甲基丙烯酸酐改性的明胶、甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖或甲基丙烯酸酐改性的透明质酸；脱细胞基质为猪膀胱脱细胞基质、猪小肠黏膜脱细胞基质、猪真皮脱细胞基质或猪食管脱细胞基质；所有的氧化细菌纤维素纳米纤维都为通过2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物氧化细菌纤维素得到的纳米纤维，直径为30～100nm。
如上所述的一种结构和功能仿生尿道支架，水凝胶层的厚度为0.5～1mm，弹性模量(测试方法为：将水凝胶制备成10mm和直径4mm高度的圆柱形状，测量其压缩模量，设定为压缩速率为10mm/min，最大压缩量为40％，平行样n＝3，取应力与应变的线性区间的斜率计算弹性模量，例如海藻酸钠的线性区间是前10％，明胶的线性区间是10～20％)为30～136kPa；多孔层的厚度为4～5mm，平均孔径为56～185μm。
如上所述的一种结构和功能仿生尿道支架，结构和功能仿生尿道支架植入体内3个月后形成2～5层完整的上皮层，血管密度达到6.5～8.6％；上皮层的个数和血管密度是通过动物实验免疫组化染色测试的，具体过程为：建立犬尿道缺损模型，把支架植入体内；实验犬分别于术后3个月处死，对重建的尿道组织用10％福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，制备组织切片；分别对切片进行苏木精和伊红(H&E)、Masson组织学染色，以及血管内皮标记物(CD31)、上皮细胞标记物(AE1/AE3)的免疫组化染色；根据H&E、Masson组织学染色及AE1/AE3的免疫组化染色可以观察到上皮形成情况，根据CD31免疫组化染色结果定量分析计算(用显微镜对切片进行拍摄，对图像中的CD31血管结构用Image J软件进行图像分析计算)得到血管密度。
本发明还提供制备如上所述的一种结构和功能仿生尿道支架的方法，包括以下步骤：
(1)将氧化细菌纤维素纳米纤维分散液与脱细胞基质溶液混匀得到混合液I后，将混合液I倒入聚四氟乙烯模具I(6cm×2cm×0.5cm)中至完全填充并冷冻干燥得到未交联的多孔支架；
(2)将未交联的多孔支架放入交联剂溶液中，在室温下交联后用去离子水反复漂洗，随后冷冻干燥得到交联的多孔支架；
(3)将由氧化细菌纤维素纳米纤维、材料X、成胶助剂和水组成的混合液II倒入硅胶模具II(6cm×2cm×0.1cm)中至完全填充，将交联的多孔支架固定在模具II上，使其与混合液II接触，静置一段时间得到仿生尿道支架；
材料X为海藻酸钠，成胶助剂为摩尔比为1:2的碳酸钙和葡萄糖酸内酯(这个比例是一定的，保证得到的水凝胶是中性的)，碳酸钙是形成海藻酸钠水凝胶的一种离子交联剂，葡萄糖酸内酯是一种缓释酸，碳酸钙与葡萄糖酸内酯发生反应生成钙离子，钙离子与海藻酸钠中的羧酸根发生离子结合，从而生成海藻酸钠水凝胶；碳酸钙与葡萄糖酸内酯、氯化钙、硫酸钙都可以与海藻酸钠发生离子交联生成海藻酸钠水凝胶，但通过碳酸钙与葡萄糖酸内酯生成的水凝胶最均匀，因此选择碳酸钙与葡萄糖酸内酯；
材料X为甲基丙烯酸酐改性的明胶、甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖或甲基丙烯酸酐改性的透明质酸，成胶助剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂；静置的同时还采用功率为25mW/cm2的紫外灯照射。
作为优选的技术方案：
如上所述的方法，步骤(1)中，混合液I中，氧化细菌纤维素纳米纤维与脱细胞基质的质量比为3:7～7:3，氧化细菌纤维素纳米纤维与脱细胞基质的总浓度为8～15mg/mL；冷冻干燥的温度为-20℃，冷冻干燥的时间为24h。
如上所述的方法，步骤(1)中，脱细胞基质溶液制备过程为：首先将脱细胞基质(通过将生物组织用曲拉通和氨水处理去除细胞成份得到)均质、冷冻研磨成粉末，然后将脱细胞基质粉末分散于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到浓度为10～25mg/mL的悬浮液，最后将悬浮液用功率为300～450W的超声波细胞粉碎机处理6～12min。
如上所述的方法，步骤(2)中，交联剂为质量比为1:0.6～1:1的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的混合物，或者为京尼平；交联剂溶液的浓度为0.2～1wt％；步骤(1)中脱细胞基质的质量加入量与步骤(2)中交联剂的质量加入量之比为1:1～3.2；交联的时间为12～24h；漂洗的时间为5～10h；冷冻干燥的温度为-20℃，冷冻干燥的时间为24h。
如上所述的方法，步骤(3)中，混合液II中，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的质量比为1:9～5:5，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为15～100mg/mL，成胶助剂的摩尔浓度为10～180mM(当成胶助剂为混合物时，成胶助剂的摩尔量为各组分的摩尔量之和)；一段时间为1～24h。
本发明的原理为：
水凝胶因其高含水量、生物相容性和机械性能更加类似天然软组织，因此，本发明制备的双层仿生支架与传统双层支架相比，本发明中水凝胶层既含有纳米纤维，模拟了天然尿道上皮组织中的胶原纳米纤维，又具备水凝胶高含水量、机械性能类似软组织的特性，可为上皮细胞提供合适的微环境，在植入体内后有利于促进缺损组织周围的细胞集体迁移、增殖，在缺损部位形成上皮层，从而恢复其屏障功能，本发明提供的仿生支架通过材料特性诱导原位组织再生，避免使用大量种子细胞促进上皮化，节约时间、降低成本。上皮细胞快速迁移爬行覆盖创面，才能快速上皮化，相较于现有技术以丝素蛋白、细菌纤维素、明胶等构建的三维多孔支架，本发明光滑的水凝胶层更有利于上皮细胞的爬行。
另外，本发明制备的双层仿生支架多孔层由纳米纤维与脱细胞基质成份组成，纳米纤维可模拟天然组织中的胶原纳米纤维，多孔层的微孔结构(孔径56～185μm)使得支架在结构上高度模拟尿道的海绵体，仿生支架的组成材料之一为脱细胞基质，脱细胞基质经溶解后仍然保留其细胞外基质成份(胶原、纤连蛋白、生长因子、硫酸化的糖胺聚糖等)，从成份上来说，本发明提供的支架高度仿生天然组织的成份。而且，本发明提供的仿生支架的微纳结构为细胞的长入和增殖提供了空间，仿生成份(胶原、纤连蛋白、生长因子、硫酸化的糖胺聚糖等)能够促进细胞的迁移、增殖，尤其是生长因子能够诱导血管生成，使得支架植入后血管网络的快速建立。现有技术促进血管化大都是把材料和生长因子结合，所用的生长因子都是体外重组制备的生长因子，再使其与材料结合，首先价格昂贵，其次在使用过程中容易失活。本发明的仿生成份生长因子来源于脱细胞基质，价格便宜，且脱细胞基质中含有硫酸化的糖胺聚糖，能够与生长因子结合，保护生长因子的活性。
本发明所得的结构和功能仿生支架的多孔层和水凝胶层之间还具有协同作用，多孔层通过快速建立血管网络，为尿路上皮细胞的迁移和增殖提供氧气和营养物质，进一步促进上皮化；水凝胶层通过快速上皮化为下层组织提供物理屏障，防止尿液毒性成分影响下层组织，并恢复排尿功能，上皮化和血管化相辅相成，植入体内3个月，可形成2～5层完整的上皮层，血管密度可达6.5～8.6％，接近正常组织的血管密度，具有良好的尿道缺损修复效果。
有益效果：
(1)本发明的一种结构和功能仿生尿道支架，通过上皮化和血管化的协同作用，具有良好的尿道缺损修复效果；
(2)本发明的结构和功能仿生尿道支架的制备方法，过程简单，成本低，适用范围广。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围内。
弹性模量的测试方法：将水凝胶制备成10mm和直径4mm高度的圆柱形状，设定为压缩速率为10mm/min，最大压缩量为40％，平行样n＝3，取应力与应变的线性区间的斜率计算弹性模量，例如海藻酸钠的线性区间是前10％，明胶的线性区间是10～20％。
上皮层的个数和血管密度是通过动物实验免疫组化染色测试的，具体过程为：建立犬尿道缺损模型，把支架植入体内；实验犬分别于术后3个月处死，对重建的尿道组织用10％福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，制备组织切片；分别对切片进行苏木精和伊红(H&E)、Masson组织学染色，以及血管内皮标记物(CD31)、上皮细胞标记物(AE1/AE3)的免疫组化染色；根据H&E、Masson组织学染色及AE1/AE3的免疫组化染色可以观察到上皮形成情况，根据CD31免疫组化染色结果定量分析计算(用显微镜对切片进行拍摄，对图像中的CD31血管结构用Image J软件进行图像分析计算)得到血管密度。
实施例1
一种结构和功能仿生尿道支架的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
脱细胞基质溶液：首先将猪膀胱脱细胞基质(通过将生物组织用曲拉通和氨水处理，去除细胞成份得到)均质、冷冻研磨成粉末，然后将猪膀胱脱细胞基质粉末分散于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到浓度为12mg/mL的悬浮液，最后将悬浮液用功率为450W的超声波细胞粉碎机处理6min，即得脱细胞基质溶液；
氧化细菌纤维素纳米纤维：通过2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物氧化细菌纤维素得到的纳米纤维，直径为30～100nm；
交联剂：质量比为1:0.6的EDC和NHS的混合物；
材料X：海藻酸钠；
成胶助剂：摩尔比为1:2的碳酸钙和葡萄糖酸内酯；
(2)将氧化细菌纤维素纳米纤维分散液(分散介质为水)与脱细胞基质溶液混匀得到混合液I后，将混合液I倒入聚四氟乙烯模具I中至完全填充并在-20℃下冷冻干燥24h，得到未交联的多孔支架；混合液I中，氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的质量比为5:5，氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的总浓度为8mg/mL；
(3)将未交联的多孔支架放入浓度为0.64wt％的交联剂溶液(交联剂溶液的溶剂为水)中，在室温下交联8h后用去离子水反复漂洗5h，随后在-20℃下冷冻干燥24h，得到交联的多孔支架；步骤(2)中猪膀胱脱细胞基质的质量加入量与步骤(3)中交联剂的质量加入量之比为1:3.2；
(4)将由氧化细菌纤维素纳米纤维、材料X、成胶助剂和水组成的混合液II倒入硅胶模具II中至完全填充，将交联的多孔支架固定在模具II上，使其与混合液II接触，静置12h得到仿生尿道支架；混合液II中，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的质量比为1:9，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为20mg/mL，成胶助剂的摩尔浓度为81mM。
制得的一种结构和功能仿生尿道支架，由仿生尿道黏膜的水凝胶层与仿生尿道海绵体的多孔层组成；水凝胶层的厚度为0.5mm，弹性模量为58kPa，由氧化细菌纤维素纳米纤维、海藻酸钠和水组成；多孔层的厚度为4mm，平均孔径为185μm，由氧化细菌纤维素纳米纤维和猪膀胱脱细胞基质组成；结构和功能仿生尿道支架植入体内3个月后形成3～4层完整的上皮层，血管密度达到7.3％。
实施例2
一种结构和功能仿生尿道支架的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
脱细胞基质溶液：首先将猪膀胱脱细胞基质(通过将生物组织用曲拉通和氨水处理，去除细胞成份得到)均质、冷冻研磨成粉末，然后将猪膀胱脱细胞基质粉末分散于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到浓度为12mg/mL的悬浮液，最后将悬浮液用功率为450W的超声波细胞粉碎机处理6min，即得脱细胞基质溶液；
氧化细菌纤维素纳米纤维：通过2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物氧化细菌纤维素得到的纳米纤维，直径为30～100nm；
交联剂：京尼平；
材料X：海藻酸钠；
成胶助剂：摩尔比为1:2的碳酸钙和葡萄糖酸内酯；
(2)将氧化细菌纤维素纳米纤维分散液(分散介质为水)与脱细胞基质溶液混匀得到混合液I后，将混合液I倒入聚四氟乙烯模具I中至完全填充并在-20℃下冷冻干燥24h，得到未交联的多孔支架；混合液I中，氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的质量比为5:5，氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的总浓度为10mg/mL；
(3)将未交联的多孔支架放入浓度为0.5wt％的交联剂溶液(交联剂溶液的溶剂为水)中，在室温下交联12h后用去离子水反复漂洗5h，随后在-20℃下冷冻干燥24h，得到交联的多孔支架；步骤(2)中猪膀胱脱细胞基质的质量加入量与步骤(3)中交联剂的质量加入量之比为1:2.5；
(4)将由氧化细菌纤维素纳米纤维、材料X、成胶助剂和水组成的混合液II倒入硅胶模具II中至完全填充，将交联的多孔支架固定在模具II上，使其与混合液II接触，静置12h得到仿生尿道支架；混合液II中，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的质量比为2:8，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为20mg/mL，成胶助剂的摩尔浓度为81mM。
制得的一种结构和功能仿生尿道支架，由仿生尿道黏膜的水凝胶层与仿生尿道海绵体的多孔层组成；水凝胶层的厚度为0.5mm，弹性模量为75kPa，由氧化细菌纤维素纳米纤维、海藻酸钠和水组成；多孔层的厚度为5mm，平均孔径为150μm，由氧化细菌纤维素纳米纤维和猪膀胱脱细胞基质组成；结构和功能仿生尿道支架植入体内3个月后形成3～4层完整的上皮层，血管密度达到8.4％。
实施例3
一种结构和功能仿生尿道支架的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
脱细胞基质溶液：首先将猪膀胱脱细胞基质(通过将生物组织用曲拉通和氨水处理，去除细胞成份得到)均质、冷冻研磨成粉末，然后将猪膀胱脱细胞基质粉末分散于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到浓度为15mg/mL的悬浮液，最后将悬浮液用功率为450W的超声波细胞粉碎机处理6min，即得脱细胞基质溶液；
氧化细菌纤维素纳米纤维：通过2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物氧化细菌纤维素得到的纳米纤维，直径为30～100nm；
交联剂：质量比为1:0.6的EDC和NHS的混合物；
材料X：海藻酸钠；
成胶助剂：摩尔比为1:2的碳酸钙和葡萄糖酸内酯；
(2)将氧化细菌纤维素纳米纤维分散液(分散介质为水)与脱细胞基质溶液混匀得到混合液I后，将混合液I倒入聚四氟乙烯模具I中至完全填充并在-20℃下冷冻干燥24h，得到未交联的多孔支架；混合液I中，氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的质量比为5:5，氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的总浓度为15mg/mL；
(3)将未交联的多孔支架放入浓度为0.32wt％的交联剂溶液(交联剂溶液的溶剂为水)中，在室温下交联12h后用去离子水反复漂洗5h，随后在-20℃下冷冻干燥24h，得到交联的多孔支架；步骤(2)中猪膀胱脱细胞基质的质量加入量与步骤(3)中交联剂的质量加入量之比为1:1.6；
(4)将由氧化细菌纤维素纳米纤维、材料X、成胶助剂和水组成的混合液II倒入硅胶模具II中至完全填充，将交联的多孔支架固定在模具II上，使其与混合液II接触，静置12h得到仿生尿道支架；混合液II中，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的质量比为1:9，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为20mg/mL，成胶助剂的摩尔浓度为81mM。
制得的一种结构和功能仿生尿道支架，由仿生尿道黏膜的水凝胶层与仿生尿道海绵体的多孔层组成；水凝胶层的厚度为0.5mm，弹性模量为58kPa，由氧化细菌纤维素纳米纤维、海藻酸钠和水组成；多孔层的厚度为4mm，平均孔径为56μm，由氧化细菌纤维素纳米纤维和猪膀胱脱细胞基质组成；结构和功能仿生尿道支架植入体内3个月后形成2～3层完整的上皮层，血管密度达到6.5％。
实施例4
一种结构和功能仿生尿道支架的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
脱细胞基质溶液：首先将猪膀胱脱细胞基质(通过将生物组织用曲拉通和氨水处理，去除细胞成份得到)均质、冷冻研磨成粉末，然后将猪膀胱脱细胞基质粉末分散于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到浓度为15mg/mL的悬浮液，最后将悬浮液用功率为450W的超声波细胞粉碎机处理6min，即得脱细胞基质溶液；
氧化细菌纤维素纳米纤维：通过2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物氧化细菌纤维素得到的纳米纤维，直径为30～100nm；
交联剂：质量比为1:0.6的EDC和NHS的混合物；
材料X：海藻酸钠；
成胶助剂：摩尔比为1:2的碳酸钙和葡萄糖酸内酯；
(2)将氧化细菌纤维素纳米纤维分散液(分散介质为水)与脱细胞基质溶液混匀得到混合液I后，将混合液I倒入聚四氟乙烯模具I中至完全填充并在-20℃下冷冻干燥24h，得到未交联的多孔支架；混合液I中，氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的质量比为3:7，氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的总浓度为12mg/mL；
(3)将未交联的多孔支架放入浓度为0.32wt％的交联剂溶液(交联剂溶液的溶剂为水)中，在室温下交联12h后用去离子水反复漂洗5h，随后在-20℃下冷冻干燥24h，得到交联的多孔支架；步骤(2)中猪膀胱脱细胞基质的质量加入量与步骤(3)中交联剂的质量加入量之比为1:1.6；
(4)将由氧化细菌纤维素纳米纤维、材料X、成胶助剂和水组成的混合液II倒入硅胶模具II中至完全填充，将交联的多孔支架固定在模具II上，使其与混合液II接触，静置12h得到仿生尿道支架；混合液II中，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的质量比为2:8，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为20mg/mL，成胶助剂的摩尔浓度为81mM。
制得的一种结构和功能仿生尿道支架，由仿生尿道黏膜的水凝胶层与仿生尿道海绵体的多孔层组成；水凝胶层的厚度为0.5mm，弹性模量为75kPa，由氧化细菌纤维素纳米纤维、海藻酸钠和水组成；多孔层的厚度为5mm，平均孔径为95μm，由氧化细菌纤维素纳米纤维和猪膀胱脱细胞基质组成；结构和功能仿生尿道支架植入体内3个月后形成2～3层完整的上皮层，血管密度达到7％。
实施例5
一种结构和功能仿生尿道支架的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
脱细胞基质溶液：首先将猪膀胱脱细胞基质(通过将生物组织用曲拉通和氨水处理，去除细胞成份得到)均质、冷冻研磨成粉末，然后将猪膀胱脱细胞基质粉末分散于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到浓度为12mg/mL的悬浮液，最后将悬浮液用功率为300W的超声波细胞粉碎机处理6min，即得脱细胞基质溶液；
氧化细菌纤维素纳米纤维：通过2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物氧化细菌纤维素得到的纳米纤维，直径为30～100nm；
交联剂：质量比为1:0.6的EDC和NHS的混合物；
材料X：海藻酸钠；
成胶助剂：摩尔比为1:2的碳酸钙和葡萄糖酸内酯；
(2)将氧化细菌纤维素纳米纤维分散液(分散介质为水)与脱细胞基质溶液混匀得到混合液I后，将混合液I倒入聚四氟乙烯模具I中至完全填充并在-20℃下冷冻干燥24h，得到未交联的多孔支架；混合液I中，氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的质量比为3:7，氧化细菌纤维素纳米纤维与猪膀胱脱细胞基质的总浓度为10mg/mL；
(3)将未交联的多孔支架放入浓度为0.64wt％的交联剂溶液(交联剂溶液的溶剂为水)中，在室温下交联8h后用去离子水反复漂洗5h，随后在-20℃下冷冻干燥24h，得到交联的多孔支架；步骤(2)中猪膀胱脱细胞基质的质量加入量与步骤(3)中交联剂的质量加入量之比为1:3.2；
(4)将由氧化细菌纤维素纳米纤维、材料X、成胶助剂和水组成的混合液II倒入硅胶模具II中至完全填充，将交联的多孔支架固定在模具II上，使其与混合液II接触，静置12h得到仿生尿道支架；混合液II中，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的质量比为5:5，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为20mg/mL，成胶助剂的摩尔浓度为81mM。
制得的一种结构和功能仿生尿道支架，由仿生尿道黏膜的水凝胶层与仿生尿道海绵体的多孔层组成；水凝胶层的厚度为0.5mm，弹性模量为136kPa，由氧化细菌纤维素纳米纤维、海藻酸钠和水组成；多孔层的厚度为5mm，平均孔径为150μm，由氧化细菌纤维素纳米纤维和猪膀胱脱细胞基质组成；结构和功能仿生尿道支架植入体内3个月后形成4～5层完整的上皮层，血管密度达到8.6％。
实施例6
一种结构和功能仿生尿道支架的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
脱细胞基质溶液：首先将猪小肠黏膜脱细胞基质(通过将生物组织用曲拉通和氨水处理，去除细胞成份得到)均质、冷冻研磨成粉末，然后将猪小肠黏膜脱细胞基质粉末分散于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到浓度为10mg/mL的悬浮液，最后将悬浮液用功率为400W的超声波细胞粉碎机处理8min，即得脱细胞基质溶液；
氧化细菌纤维素纳米纤维：通过2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物氧化细菌纤维素得到的纳米纤维，直径为30～100nm；
交联剂：质量比为1:1的EDC和NHS的混合物；
材料X：甲基丙烯酸酐改性的明胶；
成胶助剂：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂；
(2)将氧化细菌纤维素纳米纤维分散液(分散介质为水)与脱细胞基质溶液混匀得到混合液I后，将混合液I倒入聚四氟乙烯模具I中至完全填充并在-20℃下冷冻干燥24h，得到未交联的多孔支架；混合液I中，氧化细菌纤维素纳米纤维与猪小肠黏膜脱细胞基质的质量比为4:6，氧化细菌纤维素纳米纤维与猪小肠黏膜脱细胞基质的总浓度为12mg/mL；
(3)将未交联的多孔支架放入浓度为0.36wt％的交联剂溶液(交联剂溶液的溶剂为水)中，在室温下交联15h后用去离子水反复漂洗10h，随后在-20℃下冷冻干燥24h，得到交联的多孔支架；步骤(2)中猪小肠黏膜脱细胞基质的质量加入量与步骤(3)中交联剂的质量加入量之比为1:1.8；
(4)将由氧化细菌纤维素纳米纤维、材料X、成胶助剂和水组成的混合液II倒入硅胶模具II中至完全填充，将交联的多孔支架固定在模具II上，使其与混合液II接触，采用功率为25mW/cm2的紫外灯照射，静置1h得到仿生尿道支架；混合液II中，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的质量比为2:8，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为100mg/mL，成胶助剂的摩尔浓度为10mM。
制得的一种结构和功能仿生尿道支架，由仿生尿道黏膜的水凝胶层与仿生尿道海绵体的多孔层组成；水凝胶层的厚度为1mm，弹性模量为60kPa，由氧化细菌纤维素纳米纤维、甲基丙烯酸酐改性的明胶和水组成；多孔层的厚度为5mm，平均孔径为98μm，由氧化细菌纤维素纳米纤维和猪小肠黏膜脱细胞基质组成；结构和功能仿生尿道支架植入体内3个月后形成3～4层完整的上皮层，血管密度达到7.1％。
实施例7
一种结构和功能仿生尿道支架的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
脱细胞基质溶液：首先将猪真皮脱细胞基质(通过将生物组织用曲拉通和氨水处理，去除细胞成份得到)均质、冷冻研磨成粉末，然后将猪真皮脱细胞基质粉末分散于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到浓度为15mg/mL的悬浮液，最后将悬浮液用功率为350W的超声波细胞粉碎机处理9min，即得脱细胞基质溶液；
氧化细菌纤维素纳米纤维：通过2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物氧化细菌纤维素得到的纳米纤维，直径为30～100nm；
交联剂：京尼平；
材料X：甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖；
成胶助剂：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂；
(2)将氧化细菌纤维素纳米纤维分散液(分散介质为水)与脱细胞基质溶液混匀得到混合液I后，将混合液I倒入聚四氟乙烯模具I中至完全填充并在-20℃下冷冻干燥24h，得到未交联的多孔支架；混合液I中，氧化细菌纤维素纳米纤维与猪真皮脱细胞基质的质量比为5:5，氧化细菌纤维素纳米纤维与猪真皮脱细胞基质的总浓度为13mg/mL；
(3)将未交联的多孔支架放入浓度为0.4wt％的交联剂溶液(交联剂溶液的溶剂为水)中，在室温下交联20h后用去离子水反复漂洗7h，随后在-20℃下冷冻干燥24h，得到交联的多孔支架；步骤(2)中猪真皮脱细胞基质的质量加入量与步骤(3)中交联剂的质量加入量之比为1:2；
(4)将由氧化细菌纤维素纳米纤维、材料X、成胶助剂和水组成的混合液II倒入硅胶模具II中至完全填充，将交联的多孔支架固定在模具II上，使其与混合液II接触，采用功率为25mW/cm2的紫外灯照射，静置10h得到仿生尿道支架；混合液II中，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的质量比为3:7，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为40mg/mL，成胶助剂的摩尔浓度为15mM。
制得的一种结构和功能仿生尿道支架，由仿生尿道黏膜的水凝胶层与仿生尿道海绵体的多孔层组成；水凝胶层的厚度为1mm，弹性模量为33kPa，由氧化细菌纤维素纳米纤维、甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖和水组成；多孔层的厚度为5mm，平均孔径为78μm，由氧化细菌纤维素纳米纤维和猪真皮脱细胞基质组成；结构和功能仿生尿道支架植入体内3个月后形成2～3层完整的上皮层，血管密度达到6.9％。
实施例8
一种结构和功能仿生尿道支架的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
脱细胞基质溶液：首先将猪食管脱细胞基质(通过将生物组织用曲拉通和氨水处理，去除细胞成份得到)均质、冷冻研磨成粉末，然后将猪食管脱细胞基质粉末分散于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到浓度为25mg/mL的悬浮液，最后将悬浮液用功率为300W的超声波细胞粉碎机处理12min，即得脱细胞基质溶液；
氧化细菌纤维素纳米纤维：通过2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物氧化细菌纤维素得到的纳米纤维，直径为30～100nm；
交联剂：京尼平；
材料X：甲基丙烯酸酐改性的透明质酸；
成胶助剂：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂；
(2)将氧化细菌纤维素纳米纤维分散液(分散介质为水)与脱细胞基质溶液混匀得到混合液I后，将混合液I倒入聚四氟乙烯模具I中至完全填充并在-20℃下冷冻干燥24h，得到未交联的多孔支架；混合液I中，氧化细菌纤维素纳米纤维与猪食管脱细胞基质的质量比为7:3，氧化细菌纤维素纳米纤维与猪食管脱细胞基质的总浓度为8mg/mL；
(3)将未交联的多孔支架放入浓度为0.2wt％的交联剂溶液(交联剂溶液的溶剂为水)中，在室温下交联24h后用去离子水反复漂洗5h，随后在-20℃下冷冻干燥24h，得到交联的多孔支架；步骤(2)中猪食管脱细胞基质的质量加入量与步骤(3)中交联剂的质量加入量之比为1:1；
(4)将由氧化细菌纤维素纳米纤维、材料X、成胶助剂和水组成的混合液II倒入硅胶模具II中至完全填充，将交联的多孔支架固定在模具II上，使其与混合液II接触，采用功率为25mW/cm2的紫外灯照射，静置24h得到仿生尿道支架；混合液II中，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的质量比为5:5，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为100mg/mL，成胶助剂的摩尔浓度为17mM。
制得的一种结构和功能仿生尿道支架，由仿生尿道黏膜的水凝胶层与仿生尿道海绵体的多孔层组成；水凝胶层的厚度为0.5mm，弹性模量为120kPa，由氧化细菌纤维素纳米纤维、甲基丙烯酸酐改性的透明质酸和水组成；多孔层的厚度为4mm，平均孔径为180μm，由氧化细菌纤维素纳米纤维和猪食管脱细胞基质组成；结构和功能仿生尿道支架植入体内3个月后形成4～5层完整的上皮层，血管密度达到8.5％。

Claims (9)

1.一种结构和功能仿生尿道支架，其特征在于，由仿生尿道黏膜的水凝胶层与仿生尿道海绵体的多孔层组成；水凝胶层主要由氧化细菌纤维素纳米纤维、改性或未改性天然高分子材料和水组成；多孔层主要由氧化细菌纤维素纳米纤维和脱细胞基质组成，脱细胞基质为仅脱除细胞成份后的基质。
2.根据权利要求1所述的一种结构和功能仿生尿道支架，其特征在于，天然高分子材料为海藻酸钠；改性天然高分子材料为甲基丙烯酸酐改性的明胶、甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖或甲基丙烯酸酐改性的透明质酸；脱细胞基质为猪膀胱脱细胞基质、猪小肠黏膜脱细胞基质、猪真皮脱细胞基质或猪食管脱细胞基质；所有的氧化细菌纤维素纳米纤维都为通过2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物氧化细菌纤维素得到的纳米纤维，直径为30～100nm。
3.根据权利要求1所述的一种结构和功能仿生尿道支架，其特征在于，水凝胶层的厚度为0.5～1mm，弹性模量为30～136kPa；多孔层的厚度为4～5mm，平均孔径为56～185μm。
4.根据权利要求1所述的一种结构和功能仿生尿道支架，其特征在于，结构和功能仿生尿道支架植入体内3个月后形成2～5层完整的上皮层，血管密度达到6.5～8.6％。
5.制备如权利要求1～4任一项所述的一种结构和功能仿生尿道支架的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将氧化细菌纤维素纳米纤维分散液与脱细胞基质溶液混匀得到混合液I后，将混合液I倒入聚四氟乙烯模具I中至完全填充并冷冻干燥得到未交联的多孔支架；
(2)将未交联的多孔支架放入交联剂溶液中，在室温下交联后用去离子水反复漂洗，随后冷冻干燥得到交联的多孔支架；
(3)将由氧化细菌纤维素纳米纤维、材料X、成胶助剂和水组成的混合液II倒入硅胶模具II中至完全填充，将交联的多孔支架固定在模具II上，使其与混合液II接触，静置一段时间得到仿生尿道支架；
材料X为海藻酸钠，成胶助剂为摩尔比为1:2的碳酸钙和葡萄糖酸内酯；
材料X为甲基丙烯酸酐改性的明胶、甲基丙烯酸酐改性的壳聚糖或甲基丙烯酸酐改性的透明质酸，成胶助剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂；静置的同时还采用功率为25mW/cm2的紫外灯照射。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，混合液I中，氧化细菌纤维素纳米纤维与脱细胞基质的质量比为3:7～7:3，氧化细菌纤维素纳米纤维与脱细胞基质的总浓度为8～15mg/mL；冷冻干燥的温度为-20℃，冷冻干燥的时间为24h。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，脱细胞基质溶液制备过程为：首先将脱细胞基质均质、冷冻研磨成粉末，然后将脱细胞基质粉末分散于pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到浓度为10～25mg/mL的悬浮液，最后将悬浮液用功率为300～450W的超声波细胞粉碎机处理6～12min。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，交联剂为质量比为1:0.6～1:1的EDC和NHS的混合物，或者为京尼平；步骤(1)中脱细胞基质的质量加入量与步骤(2)中交联剂的质量加入量之比为1:1～3.2；交联的时间为12～24h；漂洗的时间为5～10h；冷冻干燥的温度为-20℃，冷冻干燥的时间为24h。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，混合液II中，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的质量比为1:9～5:5，氧化细菌纤维素纳米纤维与材料X的总浓度为15～100mg/mL，成胶助剂的摩尔浓度为10～180mM；一段时间为1～24h。
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