CN114276567A

CN114276567A - 一种用于组织工程皮肤构建的仿生水凝胶支架及其制备方法

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Publication number: CN114276567A
Application number: CN202111655199.8A
Authority: CN
Inventors: 杨建民; 王伟彬; 石贤爱; 何思梦
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114276567B

Abstract

本发明公开了一种用于组织工程皮肤构建的仿生水凝胶支架及其制备方法，属于生物医学技术领域。本发明的仿生水凝胶支架，通过模拟天然皮肤组织中细胞所处的微环境，采用细胞外基质成分衍生物，通过在光引发剂、光照射和氧化作用下，形成具有动态互穿网络结构的仿生水凝胶支架。基于该仿生水凝胶支架构建组织工程皮肤消除了以往组织工程皮肤构建过程中出现的皮肤收缩、皮层分离、细胞增殖慢、构建周期长，以及应用过程中易破损的问题。此外，以该支架构建的组织工程皮肤具有良好的组织学形态和屏障功能，且具有优良的皮肤修复和促慢性创面愈合功能。

Description

一种用于组织工程皮肤构建的仿生水凝胶支架及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于组织工程皮肤构建的仿生水凝胶支架及其制备方法。采用细胞外基质成分衍生物，通过在光引发剂、光照射和氧化作用下，形成具有动态互穿网络结构的水凝胶支架，结合人类皮肤细胞和角质化表皮细胞和气液界面分离培养法用于组织工程全层皮肤的构建。

背景技术

组织工程皮肤在创面修复、药物与化妆品安全性测试、皮肤病理学研究、仿生电子皮肤构建等方面具有重要应用价值和潜力。目前，市面上以及大多数研究报道中的组织工程皮肤主要是基于胶原蛋白凝胶支架构建而成的。胶原蛋白是细胞外基质主要成分，具有优异的生物相容性。但是，胶原凝胶力学性能能差且极易受到胶原酶的酶解影响。因此，以其构建的组织工程工程皮肤在构建过程中往往会出现成纤维细胞介导的胶原收缩，从而影响胶原基质对真皮细胞的支持以及对表皮细胞的粘附，进而出现皮层分离、构建周期长等问题。最终，在很大程度上降低了组织工程皮肤的构建效果及其后续的应用。

为了克服单纯胶原凝胶支架的不足，研究者们通过在胶原凝胶中引入合成高分子，如多臂聚乙二醇（PEG）、聚乳酸（PLA）、聚己内酯（PCL）等，或者直接采用合成高分子材料，制备了高力学性能和高稳定性的水凝胶支架。但是，这些合成高分子缺乏与细胞结合或发生相互作用的活性位点或信号，使支架生物学功能和生物相容性受到了严重影响。从而导致接种细胞活性低，生长速度慢等问题。此外，由于支架材料孔隙难以调控以及降解速度和细胞增殖速度不匹配等问题，影响了接种细胞增殖速度，进而导致组织工程皮肤构建周期长。采用现有技术构建全层组织工程皮肤通常需要4周甚至更长时间。如此长的构建周期不利于组织工程皮肤的应用，特别是不利于临床治疗使用。同时，较低的细胞活性或细胞数量，严重影响了组织工程皮肤在创面修复方面的作用效果。为了快速构建功能化组织工程皮肤，开发兼具生物活性和力学稳定性的组织工程支架十分关键。

天然皮肤组织中的细胞处于三维的微环境中，细胞外基质中的有效成分如胶原蛋白和透明质酸含有能够被细胞识别或结合的特定位点和信号。这些特定位点和信号能够影响细胞的活性和生物学行为，比如粘附、迁移和增殖。同时，细胞外基质的结构，如胶原纤维结构，也会发挥力学传导作用调控细胞命运。此外，细胞外基质结构有序的形成和断裂也会为细胞生长和增殖提供适应性空间。目前，也有采用具有动态网络结构或自愈合功能的水凝胶进行细胞负载的研究报道。这些动态网络虽然能够为负载细胞提供适应性环境，但是水凝胶整体力学性能和稳定性较差、易降解，无法用作组织工程支架。基于此，我们通过模拟天然细胞微环境的成分和结构，设计了一种具有动态网络和稳定网络相结合的互穿聚合物双网络（IPN）仿生水凝胶支架。该支架能够从根本上提高接种细胞的活性和生长以及增殖速度，从而实现功能化组织工程皮肤的快速构建。

发明内容

为了克服以往组织工程皮肤构建过程中出现的皮肤收缩、皮层分离、细胞增殖慢、构建周期长，以及应用过程中易破损、创面修复功能差等问题。本发明提供了一种用于组织工程皮肤构建的仿生水凝胶支架及其制备方法，所制得的仿生水凝胶支架具有相互贯穿的双重网络结构。其中，甲基丙烯酰化胶原蛋白或明胶网络层致密且稳定，为水凝胶提供强机械性能；硫代透明质酸网络层处于可逆动态交联状态，为水凝胶提供弹性形变能力，并且可模拟细胞外基质结构为细胞生长和增殖提供适应性环境。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种仿生水凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）细胞外基质成分衍生物的制备：

将胶原蛋白或明胶溶液与甲基丙烯酸酐溶液反应，经过透析和真空冷冻干燥得到甲基丙烯酰化的胶原蛋白或明胶；

将透明质酸溶液与半胱胺盐酸盐溶液反应，经过透析和真空冷冻干燥得到硫代透明质酸；

（2）仿生水凝胶支架的制备：

用步骤（1）制得的甲基丙烯酰化胶原蛋白或明胶与光引发剂混合配制甲基丙烯酰化胶原蛋白或明胶前体溶液a；用步骤（1）制得的硫代透明质酸配制硫代透明质酸前体溶液b；混合前体溶液a和b，调节混合溶液pH至中性或弱碱性，在光照条件下使甲基丙烯酰化胶原蛋白或明胶发生交联，在氧化作用下使硫代透明质酸发生交联，从而得到动态互穿网络水凝胶支架。

优选的，所述步骤（1）中，胶原蛋白或明胶与甲基丙烯酸酐的用量比为5 g：3~10mL，反应温度为40-60 ℃，反应时间为3-5 h。反应结束后需要将溶液装入透析袋（8000-14000 Da）纯化。

优选的，所述步骤（1）中，透明质酸与半胱胺盐酸盐的用量比为1 g：1~3 g，反应前需要加入用 N-羟基琥珀酰亚胺/1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（NHS/EDC）以活化透明质酸上的羧基。反应温度为室温，反应pH为3-6。反应结束后需要将溶液装入透析袋（8000-14000 Da）纯化。

优选的，步骤（2）所述的甲基丙烯酰明胶前体溶液a中，甲基丙烯酰明胶浓度为5wt%-30wt%，光引发剂的浓度为0.2wt%-2wt%；所述光引发剂包括LAP（苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂盐），光引发剂2959（2-羟基-4’-（2-羟乙氧基）-2甲基苯甲酮），光引发剂1173（2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮），光引发剂819（苯基双（2,4,6-三甲基苯酰甲基）），MBF（苯甲酰甲酸甲酯），DEAPO（4-二乙氨基苯甲酰基二苯基氧化膦）中的任意一种或多种。

优选的，步骤（2）所述的硫代透明质酸前体溶液b中，硫代透明质酸浓度为1wt%-5wt%。

优选的，步骤（2）所述前体溶液a和b的混合比例为10~0.1 : 0.1~10。更优选的，前体溶液a和b的混合比例为7: 3。

优选的，所述步骤（2）中，所述光照为在紫外光或蓝光的照射下混合溶液中的甲基丙烯酰化胶原蛋白或明胶成分在10-90 s快速交联。所述氧化作用为在空气的氧化作用下，混合溶液中的硫代透明质酸成分在5~60 min缓慢交联。

一种上述方法制备所得的仿生水凝胶支架。

本发明的目的之二在于提供上述仿生水凝胶支架在组织工程皮肤构建中的应用。

本发明的一种仿生水凝胶支架的制备原理为：

在光引发剂和光照的作用下，甲基丙烯酰化胶原蛋白或明胶上的烯二键发生加成反应，形成第一层交联网络，该网络结构致密且稳定，为水凝胶提供高机械性能。在空气的氧化作用下，硫代透明质酸上的半胱氨酸以二硫键相互结合，形成第二层交联网络，该网络结构处于可逆动态的交联状态中，为水凝胶提供弹性形变能力，并且可模拟细胞外基质的细胞适应性环境。两层网络之间只存在物理贯穿，没有化学交联，不影响两层网络结构各自的理化特性。

本发明中以仿生水凝胶为细胞支架，结合Transwell气提培养技术构建组织工程全层皮肤。首先将人皮肤成纤维细胞包封于仿生水凝胶中浸没培养3~5。然后在水凝胶表面接种人角质形成细胞并继续浸没培养5~7。最后采用角质形成细胞分化培养基，通过气液界面培养7~10 天得到成熟的组织工程全层皮肤。构建的组织工程复合皮肤克服了以往胶原基组织工程皮肤形态易收缩的缺陷，具有稳定的力学性能、良好的组织学形态和优异的水屏障功能，以及促大鼠皮肤缺损修复，和糖尿病大鼠慢性伤口愈合的能力。

本发明的显著优势在于：

（1）本发明首次结合甲基丙烯酰化胶原或明胶和硫代透明质酸通过光交联和氧化交联的复合交联策略制备了力学性能可调、细胞可适应的动态互穿网络仿生水凝胶。组分上，此水凝胶含有细胞外基质的有效成分—胶原蛋白或明胶和透明质酸组分。其中，胶原蛋白或明胶均含有RGD序列和基质金属蛋白酶活性位点，具有极高的生物相容性。而透明质酸可以介导细胞信号转导和形态发生。结构上，水凝胶含有甲基丙烯酰化胶原或明胶网络层和硫代透明质酸网络层。其中，甲基丙烯酰化胶原或明胶网络层致密且稳定，为水凝胶提供强机械性能。硫代透明质酸网络层处于可逆动态交联状态，为水凝胶提供弹性形变能力，并且可模拟细胞外基质的细胞适应性环境。细胞外基质成分衍生物含有特定活性基团能够增强细胞粘附和活性；光交联形成的稳定网络结构赋予水凝胶支架较高力学性能和稳定性，氧化作用形成的动态可逆网络结构为细胞生长和增殖提供适应性环境。

（2）本发明制备的动态互穿网络仿生水凝胶具有广泛可调的物理性能，并且具有契合人皮肤弹性模量和杨氏模量的力学性能。由于其动态互穿网络结构和组分特点，能够促进细胞附着、迁移和形态发生，为细胞提供适应性的生长环境，具有优异的生物相容性，可同时满足人皮肤成纤维细胞和人角质形成细胞的生长要求。本发明以此动态互穿网络仿生水凝胶为支架，在体外构建组织工程复合皮肤。所制备的组织工程皮肤拥有理想的力学稳定性、组织学形态以及优异的水屏障功能。动物伤口模型试验证明了该复合皮肤可以显著促进全层缺损皮肤甚至糖尿病慢性伤口的愈合。

此外，本发明的互穿网络仿生水凝胶由于其氧化和光交联特性、优异的生物相容性和可调的物理力学性能，在3D生物打印、骨和肌腱组织工程以及药物传递系统等生物医学技术领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1-4中的仿生水凝胶和对比例1中的胶原凝胶进行降解性能测试的结果图。

图2为实施例1、实施例4以及对比例1所制得水凝胶的收缩效果图。

图3为实施例1、实施例4以及对比例1 三组组织工程皮肤的 H&E 染色图。

图4为实施例1、实施例4以及对比例1 三组组织工程皮肤的 Masson 染色图。

图5为实施例1、实施例4以及对比例1 三组组织工程皮对普通大鼠伤口愈合效果比较图。

图6为实施例1、实施例4以及对比例1 三组组织工程皮对普通大鼠伤口愈合分析图。

图7为实施例1、实施例4以及对比例1 三组组织工程皮对糖尿病（II型）大鼠伤口愈合效果比较图。

图8为实施例1、实施例4以及对比例1 三组组织工程皮对糖尿病（II型）大鼠伤口愈合分析图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

本发明所述胶原蛋白包括常用的牛、猪、鱼类等动物来源来源Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅲ型胶原以及重组人源胶原蛋白（如人源重组Ⅲ型胶原蛋白），明胶为所述胶原蛋白的水解产物。

实施例1

一种仿生水凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备甲基丙烯酰明胶和硫代透明质酸：

a、制备甲基丙烯酰明胶：将5 g明胶溶解于50 mL磷酸盐缓冲液中，在50 ℃下搅拌1 h。然后将5 mL甲基丙烯酸酐逐滴加入到明胶溶液中，在50 ℃下搅拌3 h。接着加入250mL磷酸盐缓冲液稀释反应液，将稀释后的溶液转移至透析袋（8000-14000 Da）中，在50 ℃下，用去离子水透析72 h。最后透析后的溶液经冻干后制得甲基丙烯酰明胶，置于超低温冰箱中保存备用。

b、制备硫代透明质酸：将1 g透明质酸和580 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶解在200 mL去离子水中，在室温下搅拌24 h。然后加入2.4 g 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）盐酸盐，搅拌2 h以活化透明质酸的羧基。接着将1.42 g半胱胺盐酸盐溶解在10 mL去离子水中，逐滴滴加到上述溶液中后，调节溶液的pH至4.7-5.0，搅拌反应24 h。之后将反应后的溶液转移至透析袋（8000-14000 Da）中，并用NaCl盐溶液（100 mM，pH 3.5）透析72 h。最后透析后的溶液经冻干后制得硫代透明质酸，装入真空袋中真空封口，并置于超低温冰箱中保存备用。

（2）制备仿生水凝胶支架：用去离子水分别配制含10wt%甲基丙烯酰明胶、0.5wt%LAP光引发剂的甲基丙烯酰明胶前体溶液a和 3wt%的硫代透明质酸前体溶液b。将甲基丙烯酰明胶前体溶液a和硫代透明质酸前体溶液b以7:3比例混合（GelMA/HASH，7/3），用NaOH溶液（1M）调节混合溶液的PH至7.0-7.5，从而制得水凝胶前体溶液。接着水凝胶前体溶液中放入紫外灯下，紫外光波长250 nm，辐射照度10 m W·cm^-2的UV-A，照射1 min，使甲基丙烯酰化明胶（GelMA）组分交联。最后将混合溶液暴露于空气30 min，使硫代透明质酸（HASH）组分交联，最终得到甲基丙烯酰化明胶/硫代透明质酸（GelMA/HASH）动态互穿网络仿生水凝胶。

（3）制备组织工程全层皮肤：将所制得的仿生水凝胶进行组织工程全层皮肤的构建。具体步骤为：提前配制水凝胶前体溶液(用于组织培养的水凝胶前体溶液配制方法如实施例1，步骤（2），所不同的为：前体溶液a需将去离子水的溶剂换为高糖DMEM培养液，前体溶液b另外需要加入1/10前体溶液b体积的10×PBS缓冲溶液)。首先提前配制水凝胶前体溶液，然后将人体皮肤成纤维细胞（HSF）包封于水凝胶中浸没培养5天。接着将人体角质形成细胞（HaCaT）接种在包封有人体皮肤成纤维细胞（HSF）的水凝胶表面继续浸没培养7天；最后采用角质形成细胞分化培养基（使用的分化培养基为：DMEM/F12 (3:1, v/v)培养基中补充有10vol%胎牛血清，1vol%青霉素/链霉素，1.8 mmol·L⁻¹Ca²⁺，5 mg·L⁻¹胰岛素，0.4mg·L⁻¹氢化可的松，20⁻¹² mol·L⁻¹三碘甲状腺氨酸，0.18 mmol·L⁻¹腺嘌呤，5 mg·L⁻¹转铁蛋白，2 μg·L⁻¹转化生长因子（TGF-α）和100 μg·L^-1粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF），通过气液界面培养7天得到成熟的组织工程全层复合皮肤。

实施例2

本实施例的仿生水凝胶支架的制备方法与实施例1不同之处在于：步骤（2）中，将甲基丙烯酰明胶前体溶液a和硫代透明质酸前体溶液b以5:5比例混合（GelMA/HASH，5/5），其余均与实施例1的相同。

实施例3

本实施例的仿生水凝胶支架的制备方法与实施例1不同之处在于：步骤（2）中，将甲基丙烯酰明胶前体溶液a和硫代透明质酸前体溶液b 3:7比例混合（GelMA/HASH，3/7），其余均与实施例1的相同。

实施例4

本实施例的仿生水凝胶支架的制备方法与实施例1不同之处在于：步骤（1）中，采用胶原蛋白代替明胶制备甲基丙烯酰化胶原蛋白。其余均与实施例1的相同。制备获得甲基丙烯酰化胶原蛋白/硫代透明质酸（ColMA/HASH）动态互穿网络仿生水凝胶。

实施例5

一种仿生水凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备甲基丙烯酰明胶和硫代透明质酸：

a、制备甲基丙烯酰明胶：将5 g明胶溶解于50 mL磷酸盐缓冲液中，在50 ℃下搅拌1 h。然后将3mL甲基丙烯酸酐逐滴加入到明胶溶液中，在40 ℃下搅拌4 h。接着加入250 mL磷酸盐缓冲液稀释反应液，将稀释后的溶液转移至透析袋（8000-14000 Da）中，在50 ℃下，用去离子水透析72 h。最后透析后的溶液经冻干后制得甲基丙烯酰明胶，置于超低温冰箱中保存备用。

b、制备硫代透明质酸：将1 g透明质酸和580 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶解在200 mL去离子水中，在室温下搅拌24 h。然后加入2.4 g 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）盐酸盐，搅拌2 h以活化透明质酸的羧基。接着将1 g半胱胺盐酸盐溶解在10mL去离子水中，逐滴滴加到上述溶液中后，调节溶液的pH至3，搅拌反应24 h。之后将反应后的溶液转移至透析袋（8000-14000 Da）中，并用NaCl盐溶液（100 mM，pH 3.5）透析72 h。最后透析后的溶液经冻干后制得硫代透明质酸，装入真空袋中真空封口，并置于超低温冰箱中保存备用。

（2）制备仿生水凝胶支架：用去离子水分别配制浓度为1wt%的硫代透明质酸前体溶液b，和含5wt%甲基丙烯酰明胶、0.2wt%LAP光引发剂的甲基丙烯酰明胶前体溶液a。将硫代透明质酸前体溶液b和甲基丙烯酰明胶前体溶液a以0.1:10比例混合，用NaOH溶液（1M）调节混合溶液的PH至7.0-7.5。

接着混合溶液放入紫外灯下，紫外光波长250 nm，辐射照度10 m W·cm^-2的UV-A，照射90s，使甲基丙烯酰化明胶（GelMA）组分交联。最后将混合溶液暴露于空气5 min，使硫代透明质酸（HASH）组分交联，最终得到动态互穿网络仿生水凝胶。

实施例6 一种仿生水凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备甲基丙烯酰明胶和硫代透明质酸：

a、制备甲基丙烯酰明胶：将5 g明胶溶解于50 mL磷酸盐缓冲液中，在50 ℃下搅拌1 h。然后将10mL甲基丙烯酸酐逐滴加入到明胶溶液中，在50 ℃下搅拌5h。接着加入250 mL磷酸盐缓冲液稀释反应液，将稀释后的溶液转移至透析袋（8000-14000 Da）中，在60 ℃下，用去离子水透析72 h。最后透析后的溶液经冻干后制得甲基丙烯酰明胶，置于超低温冰箱中保存备用。

b、制备硫代透明质酸：将1 g透明质酸和580 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶解在200 mL去离子水中，在室温下搅拌24 h。然后加入2.4 g 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）盐酸盐，搅拌2 h以活化透明质酸的羧基。接着将3 g半胱胺盐酸盐溶解在10mL去离子水中，逐滴滴加到上述溶液中后，调节溶液的pH至6，搅拌反应24 h。之后将反应后的溶液转移至透析袋（8000-14000 Da）中，并用NaCl盐溶液（100 mM，pH 3.5）透析72 h。最后透析后的溶液经冻干后制得硫代透明质酸，装入真空袋中真空封口，并置于超低温冰箱中保存备用。

（2）制备仿生水凝胶支架：用去离子水分别配制浓度为5wt%的硫代透明质酸前体溶液b，和含30wt%甲基丙烯酰明胶、2wt%LAP光引发剂的甲基丙烯酰明胶前体溶液a。将硫代透明质酸前体溶液b和甲基丙烯酰明胶前体溶液a以10:0.1比例混合，用NaOH溶液（1M）调节混合溶液的PH至7.0。

接着混合溶液放入紫外灯下，紫外光波长250 nm，辐射照度10 m W·cm^-2的UV-A，照射10s，使甲基丙烯酰化明胶（GelMA）组分交联。最后将混合溶液暴露于空气60 min，使硫代透明质酸（HASH）组分交联，最终得到动态互穿网络仿生水凝胶。

对比例1

本对比例的传统胶原蛋白水凝胶制备方法为：量取大鼠尾Ⅰ型胶原溶液、10 ×PBS、dH₂O和NaOH（1 M），其比例为260： 100：635：6，吹打混匀后置于37℃培养箱，在30 min内形成乳白色凝胶。

实施例7仿生水凝胶性能测试

1、对实施例1—4中的仿生水凝胶和对比例1中的胶原凝胶进行抗降解性能测试。具体方法为：将所制得的水凝胶分别置于1 mM DTT （二硫苏糖醇）、0.02 U/mL胶原酶和10wt% FBS的DMEM培养液中，并在1 d、3 d、5 d、7 d、14 d和21 d时测量水凝胶样品的质量，并计算出水凝胶的降解率。计算结果如图1所示，各组水凝胶在前期的降解速率都比较快，而到后期，降解速率趋于平缓。但是，仿生水凝胶组明显慢于胶原凝胶组。当甲基丙烯酰明胶或胶原蛋白与硫代透明质酸的比例为7:3（GelMA或ColMA/HASH，7/3）（即实施例1和实施例4）时，降解相对较慢。这说明仿生水凝胶作为细胞支架在组织工程细胞的长期培养中可以保持结构的完整，支持细胞的粘附和生长，适当的降解速率可以为细胞的增殖提供足够的空间环境。

2、对实施例1—4中的仿生水凝胶和对比例1中的胶原凝胶进行压缩、拉伸性能测试。具体方法为：利用质构仪所制得的水凝胶分别进行压缩和拉伸测试。弹性模量和杨氏模量结果如表1所示，由表1知，随着甲基丙烯酰化明胶（GelMA）组分比例的下降，水凝胶的杨氏模量逐渐下降，范围在 15 kPa 到 35 kPa 之间。杨氏模量较高的组别是7/3（GelMA/HASH）组和7/3（ColMA/HASH）组，因为GelMA组分的存在，赋予其更好的柔韧性，增强了水凝胶的杨氏模量。据相关研究报道，人皮肤的杨氏模量范围为20—40 kPa。本实施例中的仿生水凝胶支架杨氏模量能够与皮肤相仿。同时，GelMA 浓度与压缩模量之间呈正相关，所有实施例水凝胶的压缩模量检测结果范围在 40 kPa 到 125 kPa 之间。压缩模量较高的组别是7/3（GelMA/HASH）组（实施例1）和7/3（ColMA/HASH）组（实施例4），这是由于 GelMA或ColMA 网络层的交联密度更致密，交联结构更稳定。因此，可选用7/3（GelMA/HASH）或7/3（ColMA/HASH）组水凝胶作为组织工程皮肤的支架。

表1 仿生水凝胶的压缩模量、杨氏模量比较

3、对实施例1和4中的仿生水凝胶和对比例1中的胶原凝胶进行人体皮肤成纤维细胞和角质形成细胞活性和增殖能力检测。具体方法为：针对角质形成细胞，首先配制水凝胶前体溶液，并在孔板上进行成胶处理。然后在水凝胶表面接种角质形成细胞并培养。具体步骤如下，取一无菌的24孔板，在孔内预铺300 μL的前体溶液（前体溶液的配置方法如实施例1，步骤（3）所示）。然后用便携式固化光源分别照射孔板的底部和顶部各30 s后，将孔板置于37 ℃二氧化碳培养箱15 min。各组前体溶液成胶后，将收获的HaCaT细胞以1 × 10⁵个/孔接种至各组凝胶支架上。之后将孔板放入37 ℃二氧化碳培养箱中2 h，待细胞贴壁后，往孔板各孔加入1mL HaCaT生长培养基（10vol%胎牛血清+ 1vol%青霉素/链霉素+89vol%高糖DMEM培养基）。最后将孔板放入37 ℃培养箱培养。利用MTT法检测细胞接种后12小时的存活率以及随时间增殖情况；针对人皮肤成纤维细胞，首先配制水凝胶前体溶液，然后混合成纤维细胞并在孔板上进行成胶处理。利用MTT法检测细胞接种后12小时的存活率以及随时间增殖情况。水凝胶人表皮角质形成细胞的存活率与增殖倍数结果见表2，在第 5天，7/3（ColMA/HASH）组水凝胶（即实施例4）增殖倍数最大，7/3（GelMA/HASH）组水凝胶（即实施例1）次之。因此，可以选用7/3（GelMA/HASH）或7/3（ColMA/HASH）组水凝胶用于体外表皮层的构建。

表2 水凝胶人表皮角质形成细胞的存活率与增殖倍数

水凝胶内部成纤维细胞的存活率与增殖倍数结果见表3，在第 1 天时，细胞的增殖速度较缓慢。第 3 天，细胞增殖速度变快，其中，胶原组（即对比例1）的增殖倍数最大，而7/3（GelMA/HASH）组水凝胶（即实施例1）时，增殖倍数较小。这是由于胶原组水凝胶含有更多的活性序列，有利于细胞的增殖，而在第 5 天，人体皮肤成纤维细胞（HSF）继续增殖，但胶原组有所减缓，这是由于胶原水凝胶出现了形态收缩，阻碍了 HSF 的生长。

表3 水凝胶内部成纤维细胞的存活率与增殖倍数

4、采用实施例1、4和对比例1进行组织工程全层皮肤构建。首先对构建过程中的水凝胶支架抗收缩能力进行表征。如图2所示，在培养期间，前5 天胶原组（对比例1）水凝胶连续地快速收缩至初始水凝胶面积的 43.12 ± 4.7％，而之后，收缩有所减缓。这是由于胶原水凝胶的机械性能较差，前期 HSF 快速生长导致胶原快速收缩，而到第五天时，细胞在水凝胶中生长状态达到稳定，所以胶原收缩有所减缓。与之相比，7/3（GelMA/HASH）组（实施例1）、7/3（ColMA/HASH）组（实施例4）水凝胶，在第5天分别保持初始面积的96.5 ± 3.9%、93.0 ± 2.4%因此，所构建的 IPN 水凝胶具有较强的抗收缩能力，可以支持HSF 细胞体外良好的生长。

5、对实施例1、4和对比例1所构建完成的组织工程全层皮肤进行H&E 染色，结果如图 3 所示，比例为7/3（GelMA/HASH）组织工程皮肤组（实施例1）与比例为7/3（ColMA/HASH）组织工程皮肤组（实施例4）不仅具有更厚的表皮层，而且它们的表皮层和真皮层在结构上更紧密地连接。而胶原组织工程皮肤组（对比例1），明显可看到表皮层一定程度上脱离了真皮层，这是由于在自组织培养过程中，HaCaT 细胞单层没有稳定粘附在胶原支架上导致的。因此，由GelMA/HASH或ColMA/HASH支架构建的组织工程皮肤具有真皮-表皮稳定结构和与天然皮肤更近厚度的表皮层。

6、对构建完成的组织工程皮肤进行 Masson 染色，结果如图 4 所示。染色结果反应胶原沉积程度，颜色越深代表胶原沉积越高。三组组织工程皮肤出现不同程度的胶原沉积，其中，GelMA/HASH 组（实施例1）约为 60%，ColMA/HASH（实施例4）组为 60%，胶原组（对比例1）为 20%。比例为7/3（GelMA/HASH）组织工程皮肤组与比例为7/3（ColMA/HASH）组织工程皮肤组组的胶原沉积显著高于胶原组。并且胶原分布更加致密和均匀，说明这两组组织工程皮肤的构建质量优于胶原组，HSF在此支架中可以进行良好的生长和基质分泌。

7、采用实施例1、4和对比例1所构建的组织工程全层皮肤进行皮肤修复应用，并与空白组（伤口未处理）对照。具体方法为：首先将24只SD雄性大鼠随机分成四组，分别为：①空白组（阴性对照）；②7/3（GelMA/HASH）组织工程皮肤组（实施例1）；③7/3（ColMA/HASH）组织工程皮肤组（实施例4）；④无细胞胶原凝胶组（对比例1）。然后根据大鼠的体重，以 1 mL/kg 的剂量注射 2wt%的戊巴比妥钠溶液。之后将大鼠的背部脱毛，并用打孔器（直径 10mm）在背部两侧制造两个相同大小的全层皮肤缺损伤口。接着对空白组大鼠无处理，对其它三组分别用组织工程皮肤组和无细胞胶原组覆盖大鼠的全厚度切除伤口，并用留置针贴进行固定。每三天对大鼠进行敷料的更换，直至伤口完全愈合。皮肤修复结果如图5所示，第0 天，各组伤口均为直径 10 mm 的圆形全层伤口，说明造模成功。第 14 天，造模伤口几乎愈合。其中，比例为7/3（GelMA/HASH）组织工程皮肤组与比例为7/3（ColMA/HASH）组织工程皮肤组伤口完全愈合，其它两组都有少数区域未完全愈合。同时，伤口闭合率统计结果也能证明，仿生水凝胶支架构建的皮肤能够更快的促进创面愈合，见图6。

8、采用实施例1、4和对比例1所构建的组织工程皮肤进行促糖尿病（II型）慢性创面愈合的应用。选用II型糖尿病老鼠进行实验，具体方法同上。慢性创面愈合结果如图7所示，通过宏观的伤口观察可以看出，与空白组相比，组织工程皮肤组（实施例1、4）、胶原凝胶组（对比例1）都可显著促进伤口的愈合。由此说明敷料对伤口的治疗具有促进作用，可以防止伤口受到病原微生物的入侵，具有吸收伤口渗出液和减缓创面处水分的流失等作用。与胶原凝胶组相比，组织工程皮肤组的愈合效果更加明显。这是由于比例为7/3（GelMA/HASH）水凝胶与比例为7/3（ColMA/HASH）水凝胶具有与细胞外基质更相似的水合环境、更高的生物相容性，以及它们含有的透明质酸，明胶和胶原成分可以促进伤口处细胞的增殖和迁移，从而加速伤口的愈合。此外，伤口闭合率统计结果进一步证明，仿生水凝胶支架构建的皮肤具有更高的促慢性创面愈合功能，见图8。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种仿生水凝胶支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）细胞外基质成分衍生物的制备：

将透明质酸溶液与半胱胺盐酸盐溶液反应，经过透析和真空冷冻干燥得到硫代透明质酸;

（2）仿生水凝胶支架的制备：

2.根据权利要求1所述一种仿生水凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，胶原蛋白或明胶与甲基丙烯酸酐的用量比为5 g：3~10 mL，反应温度为40-60 ℃，反应时间为3-5 h，反应结束后将溶液装入透析袋透析纯化。

3.根据权利要求1所述一种仿生水凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，透明质酸与半胱胺盐酸盐的用量比为1 g：1~3 g，反应前加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐以活化透明质酸上的羧基；反应温度为室温，反应pH为3-6，反应结束后将溶液装入透析袋透析纯化。

4.根据权利要求1所述一种仿生水凝胶支架的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的甲基丙烯酰化胶原蛋白或明胶前体溶液a中，甲基丙烯酰化胶原蛋白或明胶浓度为5wt%-30wt%，光引发剂的浓度为0.2wt%-2wt%；所述光引发剂包括LAP，光引发剂2959，光引发剂1173，MBF，DEAPO中的任意一种或多种。

5.根据权利要求1所述一种仿生水凝胶支架的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的硫代透明质酸前体溶液b中，硫代透明质酸浓度为1wt%-5wt%。

6.根据权利要求1所述一种仿生水凝胶支架的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述前体溶液a和b的混合比例为10~0.1 : 0.1~10。

7.根据权利要求6所述一种仿生水凝胶支架的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述前体溶液a和b的混合比例为7: 3。

8.根据权利要求1所述一种仿生水凝胶支架的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所述光照为在紫外光或蓝光的照射下混合溶液中的甲基丙烯酰化胶原蛋白或明胶成分在10-90 s快速交联；所述氧化作用为在空气的氧化作用下，混合溶液中的硫代透明质酸成分在5~60 min缓慢交联。

9.权利要求1-8任一项所述方法制备所得的仿生水凝胶支架。

10.权利要求9所述仿生水凝胶支架在在组织工程皮肤构建中的应用。