CN117085182A - 一种仿生生物材料的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种仿生角膜基质或皮肤的制备方法，以异种或同种角膜基质或皮肤为模板，将硫酸软骨素衍生物灌注到角膜基质或皮肤间隙中，待其固化后，消化掉原有角膜基质或皮肤，得到拷贝天然基质结构特征的聚合物骨架。重新填充胶原蛋白后得到具有天然角膜结构特征的仿生角膜基质或皮肤。本发明提供的制备方法除了天然生物组织中的异种蛋白，降低了免疫原性，同时保留了天然组织的结构特征，实现了人造生物材料对天然生物组织结构的仿生。
Description
技术领域
本发明属于组织工程和再生医学领域，具体涉及一种仿生生物材料的制备方法及其应用。
背景技术
角膜盲是世界第四大致盲病，有超过1000万人患有双眼角膜盲。由于供体角膜短缺，每年仅有约18.5万例角膜移植手术，移植后患者终身面临免疫排斥的风险。角膜基质层是角膜5层中的一层，占角膜厚度的90%以上，是角膜透明度和屈光功能的最重要的一层。角膜基质层的严重损伤是导致角膜盲的最主要原因。角膜基质的前1 / 3层由单向排列的胶原纤维板层交织而成，后3/2层由非交织的胶原纤维板层组成，每层板层之间偏差45°或90°。这种高度特殊化的结构对角膜组织透明度和机械强度尤为重要。复杂的基质层结构使其很难通过生物工程的方法模拟。为了找到最佳的基质替代物，人们正在研究各种各样的方法。随材料学发展，近年来多种生物组织替代材料被研发，主要包括胶原基和脱细胞生物材料。胶原基材料由单一胶原蛋白交联制备，缺少天然生物组织的超微结构特征。脱细胞材料是通过异种动物组织经脱细胞处理后得到的细胞外基质支架，具有天然生物组织的结构特点和力学特性，但脱细胞过程中仍存在细胞碎片残留，抗原暴露，以及传播病毒，批间差异难以控制的不足。由于天然生物组织结构的复杂性，仿生天然生物组织超微结构的研究鲜有报道。中国发明专利（申请号202210102037.X）公开了一种人工角膜的制备方法。该发明通过电化学沉积技术，制备了一种由有序胶原微纤维排列组成的人工角膜，但该发明仍不能模拟天然角膜正交排列的板层结构特征。
发明内容
为解决当前生物材料结构单一难以模拟天然生物组织超微结构的不足，本发明一方面提供了一种仿生生物材料的制备方法，包括如下步骤：将拟仿生物组织浸泡到单体聚合物溶液中，使单体聚合物充分浸入到拟仿生物组织内部；通过聚合反应在拟仿生物组织内部形成聚合网络；消化并冲洗拟仿生物组织，得到聚合网络构成的聚合物骨架；将生物材料填充并固定到该聚合物骨架中，得到仿生生物材料。
本发明中，所述拟仿生物组织选自具有与目标制得的仿生生物材料相同或近似结构的结缔组织，来源于同种或异种的天然生物组织或脱细胞生物组织，例如当目标制得的仿生生物材料为人角膜时，拟仿生物组织可以选择猪角膜、脱细胞猪角膜；当目标制得的仿生生物材料为人皮肤时，拟仿生物组织可以选择猪皮肤、脱细胞猪皮肤。
在一个优选的实施方式中，所述拟仿生物组织选自主要由细胞外基质组成的结缔组织，例如角膜或皮肤，优选尺寸为0.1-5cm2。
本发明中，所述单体聚合物选自甲基丙基酰化多糖、聚乙二醇二丙烯酸酯或聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯一种或多种；其中甲基丙基酰化多糖选自甲基丙烯酰化透明质酸、甲基丙烯酰化硫酸软骨素、甲基丙烯酰化右旋糖酐中的一种或多种；所述单体聚合物溶液浓度范围为5%-30%（w/v）。
进一步，所述单体聚合物溶液中含有光引发剂或温度引发剂。光引发剂的为浓度0.1%-0.5%；温度引发剂的浓度为0.1-0.2 mol/L。所述光引发剂为蓝光或紫外光引发剂,包括2,4,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂盐（LAP）、光引发剂2959；所述温度引发剂包括偶氮二异丁腈（AIBN）。
在一个优选的实施方式中，所述单体聚合物溶液为含有0.1-0.5%光引发剂的甲基丙基酰化多糖，浓度为5-20%（w/v）。
在一个优选的实施方式中，所述单体聚合物溶液至少包括甲基丙烯酰化硫酸软骨素。
在一个更优选的实施方式中，所述单体聚合物溶液为含有0.2-0.3%光引发剂的甲基丙烯酰化硫酸软骨素溶液，浓度为10-15%（w/v）。
本发明中，所述聚合网络由单体聚合物穿插于拟仿生物组织之间，通过聚合反应形成。
本发明中，所述聚合物骨架是由聚合网络构成，因聚合网络在仿生生物材料内部形成，从而具有与拟仿生生物材料反向相同或近似的结构，待将生物材料填充并固定到该聚合物骨架后，得到的仿生生物材料则具有与拟仿生生物材料相同或近似的结构。
本发明中，所述生物材料选自天然胶原蛋白、重组胶原蛋白及其改性衍生物，包括但不限于I型胶原蛋白，III型胶原蛋白，明胶，重组人源胶原蛋白或去端肽胶原蛋白。
所述生物材料为胶原蛋白时，制备浓度为2%-20%的溶液；所述生物材料为明胶时，制备浓度为10%-20%的溶液。
生物材料溶液的制备方法，以制备20%的胶原溶液为例，方法为：将2g可溶性去端肽胶原I型蛋白溶解到10ml磷酸盐缓冲液中，120rpm摇床震荡混匀10分钟。
在上述浸泡过程中，可以同时采用超声、抽真空或搅拌的方式加速浸泡或浸入的过程。
在一个优选的实施方式中，所述浸泡为将拟仿生组织完全浸入至少10倍体积量的单体聚合物溶液中，置于120转/分钟摇床，室温震荡12-36小时。
本发明中，所述聚合反应包括光激活和温度激活。采用光激活时，300nm - 600nm波长，照射2-3分钟。采用温度激活时，60-70℃条件下，反应12-24小时。
在一种优选的实施方式中，所述光引发剂为0.1%-0.3%的LAP溶液；所述激活的时间为60-120秒。
在一种更优选的实施方式中，所述聚合反应方法为将拟仿生组织在365 nm紫外光下聚合2分钟。
本发明中，所述消化包括但不限于酸消化，生物酶消化，采用常规方法即可。
在一个优选的实施方式中，酸消化为使用浓度为10%-25%的盐酸溶液；生物酶消化为使用1%-5%的胃蛋白酶或胶原酶溶液；消化时间为18-48小时。
本发明中，所述冲洗采用常规方法即可。在一个优选的实施方式中，冲洗方法是将消化处理后的仿生材料浸入至少20倍体积的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，置于摇床120转/分钟室温震荡搅拌15分钟。随后换入新的磷酸盐缓冲液，进行冲洗，该步骤至少重复6次，直至磷酸盐缓冲液的PH值为中性（6.8-7.6）。
本发明中，所述填充生物材料的方法包括但不限于浸泡、超声、抽真空，采用常规方法即可。
在一个优选的实施方式中，填充方法为将冲洗后的仿生材料浸入至少10倍体积的生物材料溶液中，使其完全浸泡，随后置于摇床120转/分钟室温震荡12-24小时。
填充过程中，可以通过超声，抽真空的方式提高浸入的效率。优选的，超声频率为20-40Hz，真空度为100 mTorr。
本发明中，所述固定的方法为交联剂交联，将单体聚合物固定在聚合物骨架内。所述交联剂的种类包括但不限于EDC/NHS、CMC/NHS、京尼平、原花青素等。
在一个优选的实施方式中，所述交联剂的浓度为0.1%-5%CMC/NHS溶液，配置交联剂的溶液为50mM的MES溶液。
在一个优选的实施方式中，所述固定采用EDC/NHS溶液交联，包括如下步骤：将浸有生物材料的仿生材料，取出后，用无尘吸水纸去除表面多余的溶液，随后置于4℃环境中，预固定15-30分钟；随后用PH值为4.7,浓度为50mM的MES溶液，制备0.5%的EDC/NHS溶液，并置于4℃环境预冷；将预固定的仿生材料置于EDC/NHS溶液中浸泡8-12小时；将固定后的仿生材料，置于至少20倍体积的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，置于摇床120转/分钟室温震荡搅拌15分钟，随后换入新的磷酸盐缓冲液，进行冲洗，该步骤至少重复5次。
在一个优选的实施方式中，所述固定采用CMC/NHS交联，包括如下步骤：将浸有生物材料的仿生材料，取出后，用无尘吸水纸去除表面多余的溶液，随后置于4℃环境中，预固定15-30分钟；随后用PH值为4.7,浓度为50mM的MES溶液，制备1%的CMC/NHS溶液，并置于4℃环境预冷；将预固定的仿生材料置于CMS/NHS溶液中浸泡12小时；将固定后的仿生材料，置于至少20倍体积的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，置于摇床120转/分钟室温震荡搅拌15分钟，随后换入新的磷酸盐缓冲液，进行冲洗，该步骤至少重复5次。
本发明另一方面提供了根据上述方法制备的仿生生物材料。所述仿生生物材料具有与拟仿生物组织相同或近似的结构，透明度和机械性能。
本发明另一方面提供了根据上述方法制备及其制备得到的仿生生物材料在制备组织替代物、医用敷料或药物载体的医疗器械中的应用，例如角膜基质替代物、皮肤替代物、眼部医用敷料。
有益效果
本发明以异种或同种拟仿生生物材料（角膜基质）为模板，将硫酸软骨素等衍生物灌注到拟仿生生物材料（角膜基质）间隙中，待其固化后，消化掉原有拟仿生生物材料（角膜基质），得到拷贝天然拟仿生生物材料（角膜基质）结构特征的聚合物骨架。重新填充胶原蛋白后得到具有天然拟仿生生物材料（角膜基质）结构特征的仿生生物材料（角膜基质）。本发明提供的制备方法除了天然生物组织中的异种蛋白，降低了免疫原性，同时保留了天然组织的结构特征，实现了人造生物材料对天然生物组织结构的仿生。
附图说明
图1仿生角膜基质与天然角膜基质超微结构特征。
图2仿生角膜基质与胶原基人造角膜和氰基丙烯酸酯明胶基角膜的超微结构特征。
图3仿生角膜基质与天然角膜和胶原基角膜的透光率对比。
图4仿生角膜基质与天然角膜和胶原基角膜的降解率对比。
图5仿生角膜基质与天然角膜和胶原基角膜的吸水率对比。
图6仿生角膜基质修复角膜基质缺损术前和术后的大体照，光学相干断层扫描和厚度扫描结果对比。
图7在体内动物实验中通过裂隙灯、荧光素染色、光学相干断层扫描和厚度扫描结果对比仿生角膜基质修复效果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的步骤、物质或材料、反应条件，但本文描述了优选的步骤、物质或材料、反应条件。
当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数，并且该范围内的所有数值均能实现本发明的效果。
除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。
本文所用，单词的单数形式包括复数，反之亦然。因此， “一”、“一个”和“该”通常包括相应术语的复数。本文所用“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本文所用，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的材料或方法步骤。
脱细胞角膜：以常规脱细胞方法（包括反复冻融，高低渗透压处理，表面活性剂处理，超静压处理，核酸酶处理，磷脂酶处理）处理自于人、猪、马、牛等哺乳动物的眼角膜，使其基质细胞和内皮细胞脱落，即得到脱细胞角膜。
脱细胞猪角膜：经病毒灭活与脱细胞工艺制备而成，包括前弹力层和角膜基质层。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明实施例的部分材料来源：
新鲜猪角膜：从市场购置的未变性的新鲜猪角膜。
SDS溶液：十二烷基硫酸钠溶液，购于北京索莱宝科技有限公司，货号S8010。
核酸酶：脱氧核糖核酸酶，购于北京义翘神州科技股份有限公司，货号SSNP01。
光引发剂LAP 苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐，购于上海源叶生物科技有限公司，货号Y43995。
甲基丙烯酸化硫酸软骨素:购于苏州永沁泉智能设备有限公司，货号EFL-ChsMA-001
PEGDA溶液：聚乙二醇二丙烯酸酯溶液，购于Sigma，货号455008。
PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，购于北京索莱宝科技有限公，货号P1020。
兔：购于济南西岭角养殖繁育中心。
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)， 购于阿拉丁，货号E106172。
N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）：购于阿拉丁，货号H109330。
1-环己基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(CMC）：购于麦克林，货号M812751。
吗啉乙磺酸（MES）：购于麦克林，货号M813436。
实施例1 制备仿生生物角膜材料
（1）制备脱细胞猪角膜：新鲜猪角膜刮除上皮和内皮，浸泡在0.5% SDS溶液中，500U/ml核酸酶处理2小时，随后用足量的PBS缓冲液清洗6-8次。
（2）制备单体聚合物溶液：用0.3% LAP配置10%甲基丙烯酸化硫酸软骨素溶液。
（3）浸入脱细胞猪角膜：将脱细胞猪角膜浸泡到至少10倍体积量的甲基丙烯酰化硫酸软骨素溶液中。置于真空釜中，抽真空6小时，随后置于120转/分钟摇床，常温震荡18小时。
（4）聚合反应：将甲基丙烯酰化硫酸软骨素浸润的脱细胞猪角膜置于具有角膜曲率的固化台上，在365 nm紫外光下聚合2分钟。
（5）消化脱细胞猪角膜：将聚合后的脱细胞猪角膜置于30 mg/ml的胃蛋白酶消化液中，37℃ 120转/分钟处理24小时，随后用大量生理盐水冲洗。
（6）生物材料重新填充：将去除脱细胞猪角膜的甲基丙烯酰化硫酸软骨素骨架浸泡到10%的一型胶原蛋白溶液中，室温120转/分钟处理24小时。随后4℃固化胶原蛋白，并用1%的CMC/NHS溶液交联。
实施例2 制备仿生生物角膜材料
（1）制备脱细胞猪角膜：新鲜猪角膜刮除上皮和内皮，浸泡在0.5% SDS溶液中，500U/ml核酸酶处理2小时，随后用足量的PBS缓冲液清洗6-8次。
（2）制备单体聚合物溶液：用0.25% LAP配置10%甲基丙烯酸化右旋糖酐溶液。
（3）浸入脱细胞猪角膜：将脱细胞猪角膜浸泡到至少10倍体积量的甲基丙烯酸化右旋糖酐溶液中。置于真空釜中，抽真空6小时，随后置于120转/分钟摇床，常温震荡18小时。
（4）聚合反应：将甲基丙烯酸化右旋糖酐溶液浸润的脱细胞猪角膜置于具有角膜曲率的固化台上，在365 nm紫外光下聚合2分钟。
（5）消化脱细胞猪角膜：将30 mg/ml的胃蛋白酶消化液中，37℃ 120转/分钟处理24小时，随后用大量生理盐水冲洗。
（6）生物材料重新填充：将去除脱细胞猪角膜的甲基丙烯酸化右旋糖酐骨架浸泡到10%的一型胶原蛋白溶液中，室温120转/分钟处理24小时。随后4℃固化胶原蛋白，并用5%的CMC/NHS溶液交联。
实施例3 制备仿生生物角膜材料
（1）制备脱细胞猪角膜：新鲜猪角膜刮除上皮和内皮，浸泡在0.5% SDS溶液中，500U/ml核酸酶处理2小时，随后用足量的PBS缓冲液清洗6-8次。
（2）制备单体聚合物溶液：用0.3% LAP配置0.2g/ml的PEGDA溶液。
（3）浸入脱细胞猪角膜：将脱细胞猪角膜浸泡到至少10倍体积量的PEGDA溶液中。置于真空釜中，抽真空6小时，随后置于120转/分钟摇床，常温震荡18小时。
（4）聚合反应：将PEGDA溶液浸润的脱细胞猪角膜置于具有角膜曲率的固化台上，在365 nm紫外光下聚合2分钟。
（5）消化脱细胞猪角膜：将聚合后的脱细胞猪角膜置于25%的盐酸溶液中，120转/分钟处理48小时，随后用大量生理盐水冲洗。
（6）生物材料重新填充：将去除脱细胞猪角膜的PEGDA骨架浸泡到10%的一型胶原蛋白溶液中，室温120转/分钟处理24小时。随后4℃固化胶原蛋白，并用0.5%的EDC/NHS溶液交联。
实施例4 制备仿生皮肤材料
（1）制备脱细胞猪皮肤：新鲜猪皮肤用0.25%胰蛋白酶振荡6小时，随后浸入5%TritonX-100溶液中，振荡6小时，最后用平衡盐溶液清洗6次。
（2）制备单体聚合物溶液：用0.3%LAP溶液配置10%的甲基丙烯酸化透明质酸溶液。
（3）浸入脱细胞猪皮肤：将脱细胞猪皮肤浸泡到至少10倍体积量的甲基丙烯酸化透明质酸溶液。置于真空釜中抽真空6小时，随后置于120转/分钟摇床，震荡18小时。
（4）聚合反应：将甲基丙烯酸化透明质酸浸润的脱细胞猪皮肤铺展开，在365 nm紫外光下聚合2分钟。
（5）消化脱细胞猪皮肤：将聚合后的脱细胞猪皮肤置于30 mg/ml的胃蛋白酶消化液中，37℃ 120转/分钟处理48小时，随后用大量生理盐水冲洗。
（6）生物材料重新填充：将去除脱细胞猪皮肤的甲基丙烯酸化透明质酸骨架浸泡到10%的I型胶原蛋白（北京湃生生物）溶液中，室温120转/分钟处理24小时。随后将浸有胶原蛋白的聚合物骨架用EDC/NHS交联，得到仿生生物皮肤材料。
对比例1 仿生角膜与人角膜的超微结构对比
将仿生角膜与人角膜进行戊二醛固定、超微切片和透射电子显微镜观察。结果显示，仿生角膜基质与人角膜的超微结构对比，两者具有极高的相似性。低倍率观察可见仿生角膜基质具有天然角膜类似的板层样结构，高倍率观察可见仿生角膜基质具有平行排列的胶原纤维（图1）。
对比例2 仿生角膜基质与常见人造角膜修复材料超微结构对比
将仿生角膜基质与甲基丙烯酰化明胶基角膜和胶原基角膜进行戊二醛固定、超微切片和透射电子显微镜观察。结果显示，除仿生角膜基质具有与天然角膜类似的精密超微结构外，胶原基角膜和甲基丙烯酰化明胶基角膜超微结构均一，不具有角膜基质的组织学结构特点（图2）。
对比例3 仿生角膜基质与天然角膜和胶原基角膜的物理特性对比
将仿生角膜基质与胶原基角膜和天然角膜置于分光光度计的比色皿中，分别测试在300nm-800nm之间的透光率。结果显示，仿生角膜基质具有良好的透光率，透明度优于天然角膜。（图3）
仿生角膜基质与胶原基角膜和天然角膜分别置于10U/ml的胶原酶溶液中，分别在3小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、5天和7天检测样品的质量变化。结果显示，胶原基角膜降解速率最快，在第7天质量剩余5.7%。天然角膜在第7天质量剩余12.6%。仿生角膜基质在胶原酶的作用下降解速率最慢，第7天剩余质量为38.4%。这与仿生角膜基质内含有硫酸软骨素仿生支架有关。（图4）
仿生角膜基质与胶原基角膜和天然角膜分别置于PBS缓冲液，分别在3、6、12、24、36、48小时，检测各个样品的质量。结果显示，胶原基角膜和仿生角膜基质在PBS缓冲液中保持稳定，未发生明显的溶胀，溶胀率分别为100.2%和101.8%。天然角膜溶胀明显，溶胀率达到489.1%。（图5）
实施例5 体外实验-修复角膜缺损
（1）从而实现无缝合修复，先将实施例1制备的仿生生物角膜浸入至少10倍体积量的20%的甲基丙烯酰化明胶溶液中。放置于37℃恒温摇床，120转/分钟，处理24小时。随后去除仿生角膜基质表面的甲基丙烯酰化明胶。
（2）在猪眼球角膜表面用环钻和板层刀制造一个直径为6mm深度为500μm的圆形角膜基质缺损。将同等大小的仿生角膜基质放置于角膜缺损处，升温到37℃，然后用405 nm的可见光照射60秒。
（3）将修复后的猪眼球与术前对比，在裂隙灯下观察发现基质缺损成功封闭。眼前节光学相干断层扫描和厚度扫描证明基质缺损被填补，角膜曲率恢复（图6）。
证明仿生角膜材料可以修复角膜缺损，使角膜厚度和曲率恢复。
实施例6 体外实验-修复角膜基质缺损
在兔角膜表面用环钻和板层刀制造一个直径为3mm深度为200μm的圆形角膜基质缺损。将同等大小和厚度的仿生角膜基质放置于角膜缺损处，然后用405nm可见光照射60秒。未进行仿生角膜基质修复的组作为对照。
术后四周仿生角膜基质移植组角膜透明，上皮完全再生，光学相干断层扫描显示仿生角膜基质植片稳定存在，未发生移位和剥脱，基质厚度恢复，证明具有良好的生物相容性，不刺激炎症反应，并且防止角膜基质的纤维化，达到良好的视力效果。未移植组角膜瘢痕形成，中央角膜透明度丧失，角膜上皮中央缺损，光学相干断层扫描显示角膜基质纤维化，角膜表面粗糙，中央厚度缺失（图7）。
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种仿生生物材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将拟仿生物组织浸泡到单体聚合物溶液中，使单体聚合物充分浸入到拟仿生物组织内部；通过聚合反应在拟仿生物组织内部形成聚合网络；消化并冲洗拟仿生物组织，得到聚合网络构成的聚合物骨架；将生物材料填充并固定到该聚合物骨架中，得到仿生生物材料；
所述仿生生物材料为仿生角膜基质，所述拟仿生物组织为异种或同种角膜基质；或所述仿生生物材料为仿生生物皮肤，所述拟仿生物组织异种或同种皮肤；所述仿生角膜基质或仿生生物皮肤的大小为0.1-5cm2；
所述单体聚合物的浓度为5%-30%（w/v），选自甲基丙基酰化多糖、聚乙二醇二丙烯酸酯或聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯一种或多种；其中甲基丙基酰化多糖选自甲基丙烯酰化透明质酸、甲基丙烯酰化硫酸软骨素、甲基丙烯酰化右旋糖酐中的一种或多种；
所述单体聚合物溶液中含有光引发剂或温度引发剂；所述光引发剂的为浓度0.1%-0.5%；所述温度引发剂的浓度为0.1-0.2 mol/L；所述光引发剂为蓝光或紫外光引发剂,包括2,4,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂盐、光引发剂2959；所述温度引发剂包括偶氮二异丁腈；
所述生物材料选自天然胶原蛋白、重组胶原蛋白及其改性衍生物，包括但不限于I型胶原蛋白，III型胶原蛋白，明胶，重组人源胶原蛋白或去端肽胶原蛋白；所述生物材料为胶原蛋白时，制备浓度为2%-20%的溶液；所述生物材料为明胶时，制备浓度为10%-20%的溶液；
所述固定的方法为交联剂交联；所述交联剂选自EDC/NHS、CMC/NHS、京尼平或原花青素。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于： 所述单体聚合物溶液为含有0.1-0.5%光引发剂的甲基丙基酰化多糖溶液，浓度为5-20%（w/v）；
所述交联剂为0.1%-5%CMC/NHS溶液，配置交联剂的溶液为50mM的MES溶液。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于： 所述单体聚合物溶液为含有0.2-0.3%苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂的甲基丙烯酰化硫酸软骨素溶液，浓度为10-15%（w/v）。
4.如权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于：
所述浸泡为将拟仿生组织完全浸入至少10倍体积量的单体聚合物溶液中，置于120转/分钟摇床，室温震荡12-36小时；
所述填充为将冲洗后的仿生材料浸入至少10倍体积的生物材料溶液中，使其完全浸泡，随后置于摇床120转/分钟室温震荡12-24小时。
5.如权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于：所述聚合反应包括光激活和温度激活；所述光激活的条件为300nm- 600nm波长，激活的时间为2-3分钟；所述温度激活的条件为60-70℃，反应12-24小时。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述聚合反应方法为将拟仿生组织在365 nm紫外光下聚合2分钟。
7.如权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于： 所述消化为酸消化或生物酶消化；酸消化为使用浓度为10%-25%的盐酸溶液；生物酶消化为使用1%-5%的胃蛋白酶或胶原酶溶液；消化时间为18-48小时；
所述冲洗包括将消化处理后的仿生材料浸入至少20倍体积的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，置于摇床120转/分钟室温震荡搅拌10-30分钟；重复直至磷酸盐缓冲液的PH值为6.8-7.6。
8.如权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于：
所述固定采用EDC/NHS交联时，包括如下步骤：将浸有生物材料的仿生材料，取出后，用无尘吸水纸去除表面多余的溶液，随后置于4℃环境中，预固定15-30分钟；随后用PH值为4.7,浓度为50mM的MES溶液，制备0.5%的EDC/NHS溶液，并置于4℃环境预冷；将预固定的仿生材料置于EDC/NHS溶液中浸泡8-12小时；将固定后的仿生材料，置于至少20倍体积的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，置于摇床120转/分钟室温震荡搅拌15分钟，随后换入新的磷酸盐缓冲液，进行冲洗，该步骤至少重复5次；
所述固定采用CMC/NHS时，包括如下步骤：将浸有生物材料的仿生材料，取出后，用无尘吸水纸去除表面多余的溶液，随后置于4℃环境中，预固定15-30分钟；随后用PH值为4.7,浓度为50mM的MES溶液，制备1%的CMC/NHS溶液，并置于4℃环境预冷；将预固定的仿生材料置于CMS/NHS溶液中浸泡12小时；将固定后的仿生材料，置于至少20倍体积的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液中，置于摇床120转/分钟室温震荡搅拌15分钟，随后换入新的磷酸盐缓冲液，进行冲洗，该步骤至少重复5次。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法制备的仿生生物材料。
10.根据权利要求1-7任一所述的方法制备及权利要求9所述的仿生生物材料在制备组织替代物、医用敷料或药物载体的医疗器械中的应用。
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