CN112494722A - 一种快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料及其制备方法。该方法包括：将胶原蛋白溶液pH值调节至酸性与透明质酸钠溶液混合，搅拌配制成共混溶液，搅拌除去气泡，倒入有曲率的特制模具中，风干成膜，得到有曲率的胶原透明质酸复合膜；脱模，取出胶原膜，放置干燥塔内，与戊二醛溶液挥发出的戊二醛气体进行交联改性，冲洗，风干，得到本产品。本发明的胶原基修复材料具有良好的含水性能、生物相容性、耐缝合性能，促进角膜上皮细胞在材料表面的黏附和增殖，并且植片曲率和人类相同，能够良好的贴合在植床表面，从而达到快速上皮化的效果，同时利用其优异的含水效果保护角膜上皮细胞，可用于生物医药材料领域中受损角膜的修复和替代。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及到一种快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料及其制备方法。
背景技术
角膜疾病是全球第二大致盲元凶，造成的致盲案例占致盲眼病的15％，全球共有大约6000万例，我国现存约500万例，而且由于国家政策法规和国民意识的限制，同种异体角膜捐献量极少，每年共计只有0.5万例。因此角膜修复材料对于广大角膜疾病患者非常重要。
角膜主要由无血管的结缔组织构成，承载整个眼球三分之二的屈光力，角膜还具有透氧进行营养物质代谢，维持眼内压和保护眼球，同时还含有丰富的感觉神经末梢，不洁的环境、机械损伤及遗传因素有可能导致角膜感染或损伤最终导致致盲。这就需要角膜材料具有一定的透光性、含水率及离子透过率，还需要保证能够耐手术缝线缝合，不会出现撕裂的情况。除此之外还需具备良好的生物相容性，不会在术后出现排斥反应及炎症，使材料能够快速上皮化，保护材料帮助患者重见光明。
近年来市面上人工角膜分为两大类：一类是非自制工程学人工角膜，主要以光学棱柱构成，其常用材料有聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸甲酯、硅凝胶、玻璃等；周边支架常用材料有陶瓷、氟碳聚合物、羟基磷灰石、生物材料、聚四氟乙烯等。另一类是组织工程学人工角膜，主要以生物组织为材料，常见有猪、鱼鳞和人体皮肤等。但是目前这些人工角膜仍存在透光性、生物相容性及力学性能等比较差的情况，所以目前亟需一款合格的角膜修复材料。
对于现有的以胶原蛋白为原料制作胶原膜的人工角膜，存在的缺点有：用胶原蛋白和透明质酸混合制备出有曲率的胶原膜材料，其力学强度较弱，不耐手术缝线的缝合以及体内胶原酶的快速降解，这会使人工角膜难以在眼表进行固定，术后恢复较慢，增加手术风险。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料及其制备方法。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将透明质酸钠溶解于水中，得到透明质酸钠溶液；将胶原蛋白溶解于盐酸溶液中，得到胶原蛋白溶液；
(2)将步骤(1)所述胶原蛋白溶液的pH值调节至酸性，静置，然后与透明质酸溶液混合，进行第一次搅拌处理，得到共混溶液，进行第二次搅拌处理，得到去除气泡的溶液；
(3)将步骤(2)所述去除气泡的溶液倒入曲率模具中，风干，取出，得到曲率胶原膜；
(4)将步骤(3)所述曲率胶原膜置于干燥塔内，然后通入戊二醛溶液的气体熏蒸进行交联处理，取出，用生理盐水洗涤多次，放置室温下自然风干，得到所述快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料。
进一步地，步骤(1)所述透明质酸钠溶液的质量体积浓度为0.5-1mg/mL；所述透明质酸钠的分子量为5000-1000000Da。
进一步地，步骤(1)所述胶原蛋白为牛跟腱Ⅰ型胶原。
进一步地，步骤(1)所述盐酸溶液的摩尔浓度为0.01-0.1mol/L，所述胶原蛋白与盐酸溶液的质量体积比为6.5-6.8：1mg/ml。
进一步地，在步骤(2)所述共混溶液中，透明质酸钠与胶原蛋白的质量比为1:5-10。
进一步地，步骤(2)中，胶原蛋白溶液的pH值调节至0.7-0.9；所述静置的时间为10-20min。
进一步地，步骤(2)所述第一次搅拌处理的时间为1-3h，第一次搅拌处理的温度为3-6℃；所述第二次搅拌处理的时间为10-12h，第二次搅拌处理的温度为室温。
进一步地，步骤(3)所述曲率模具的圆弧曲率为6.8-7.8。
优选地，步骤(3)所述曲率模具的圆直径为3-10mm。
本发明的曲率模具按照人类角膜正常曲率设计完成，所以在角膜移植手术过程中，植片能和植床良好贴合，促进上皮细胞能更快迁移至植片表面。
进一步地，步骤(3)所述交联处理的时间为40-50分钟，所述戊二醛溶液的质量分数为25％-50％。
本发明提供一种由上述的制备方法制得的快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明制备的快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料具有良好的含水性能，能正常保证材料的保湿性，保证角膜表面足够光滑从而保护细胞正常生长，不会受到眼睑摩擦带来的损伤和破坏。
(2)本发明制备的快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料具有良好的生物相容性，促进角膜上皮细胞在材料上粘附和增值，使材料快速上皮化。
(3)本发明制备的快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料具有良好的力学性能和离子通透性，耐手术缝合不会造成撕裂。
(4)本发明制备的快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料制备工艺简单、过程容易控制、原材料价格成本低廉，适用于医疗领域角膜损伤的修复和替代。
(5)本发明提供的制备方法中，所使用的曲率模具是按照人类角膜正常曲率设计完成，所以在角膜移植手术过程中，植片能和植床良好贴合，促进上皮细胞能更快迁移至植片表面。
附图说明
图1为实施例1的快速上皮化的胶原基角膜再生材料示意图；
图2为实施例1有曲率的特制模具的剖面图和宏观示意图；
图3为实施例1的快速上皮化的胶原基角膜再生材料覆生理盐水后光学相干断层成像结果图；
图4为实施例1-4的快速上皮化的胶原基角膜再生材料缝线拉伸强度测试图；
图5为实施例1-4快速上皮化的胶原基角膜再生材料兔子角膜移植实验上皮化情况的结果图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
一种快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料的制备方法，包括如下步骤：
1)将牛跟腱提取的Ⅰ型胶原蛋白溶解于0.01mol/L的盐酸溶液中，配制成浓度为6.5mg/ml的胶原溶液，将透明质酸钠溶解于去离子水中，配制成0.6mg/ml的透明质酸钠溶液；
2)将胶原蛋白溶液用0.1N盐酸溶液调节其pH至0.9，静置10分钟；
3)分别取上述透明质酸钠溶液和胶原蛋白溶液配制成共混溶液，在所述共混溶液中，透明质酸钠与胶原蛋白的质量比为1：5；将所述共混溶液在4℃冰箱中搅拌1h，再在室温下搅拌12小时，除去气泡，得到除去气泡的溶液；
4)将步骤3)中的除去气泡的溶液倒入特制曲率模具(该模具可参照图2所示)中，然后在室温条件下自然风干，所述特制曲率模具的圆弧曲率为7.0，所述特制曲率模具的圆直径为7.25mm，得到干态复合曲率胶原膜(Col-NaHA)，从模具中摘取干态复合曲率胶原膜后，将干态复合曲率胶原膜放置在干燥塔中用戊二醛溶液的气体进行交联，所述戊二醛溶液的质量分数为50％，交联时间为40分钟，得到交联后的胶原膜；
5)将所述交联后的胶原膜用生理盐水进行多次冲洗，再放置在室温条件下风干，得到所述快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料。
在实施例1的制备方法中，透明质酸钠和胶原蛋白反应形成一种新的复合物，经过戊二醛气体熏蒸后完成交联反应，随着溶液风干后胶原基角膜再生材料形成均匀排列的层状有序结构。因为交联反应使得胶原蛋白和透明质酸钠的复合物交联成大分子物质，所以具有很好的缝线拉伸强度，力学性能相较于纯胶原蛋白膜有显著改善，可以解决手术不耐缝合的问题。因为透明质酸钠本身具有特殊的保水性，有促进细胞的增殖和迁移，以及保护细胞、润滑表面的效果这也使得本产品在手术移植后快速上皮化从而保护表面角膜上皮细胞不被破坏。
该实施例的胶原基修复材料为有曲率的圆形透明状(参照图1、图3所示)，具有很高的力学强度，将材料在生理盐水中覆水3h后，用缝线固定其两端做动态热机械分析仪测试其湿态撕裂强度为0.46Mpa，可参照图4所示。同时将此材料移植到兔子角膜基质层术后第10天用荧光素钠染色观察已经完成角膜的全部上皮化，可参照图5所示。
实施例2
一种快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料的制备方法，包括如下步骤：
1)将牛跟腱提取的Ⅰ型胶原蛋白溶解于0.01mol/L的盐酸溶液中，配制成浓度为6.5mg/ml的胶原溶液，将透明质酸钠溶解于去离子水中，配制成0.6mg/ml的透明质酸钠溶液；
2)将胶原蛋白溶液用0.1N盐酸溶液调节PH至0.9，静置10分钟；
3)分别取上述透明质酸钠溶液和胶原蛋白溶液配制成共混溶液，在所述共混溶液中，透明质酸钠与胶原蛋白的质量比为1：6，在4℃冰箱中搅拌1h，再在室温下搅拌12小时，除去气泡，得到除去气泡的溶液；
4)将步骤3)中的除去气泡的溶液倒入特制曲率模具(该模具可参照图2所示)中，然后在室温条件下自然风干，所述特制曲率模具的圆弧曲率为6.8，所述特制曲率模具的圆直径为7.5，得到干态复合胶原曲率膜(Col-NaHA)从模具中摘取干态复合曲率胶原膜后，将干态复合曲率胶原膜摘取后再放置在干燥塔中用戊二醛溶液的气体进行交联，所述戊二醛溶液的质量分数为45％，交联时间为40分钟，得到交联后的胶原膜；
5)将所述交联后的胶原膜用生理盐水进行多次冲洗，再放置在室温条件下风干，得到所述快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料。
该实施例的胶原基修复材料为有曲率的圆形透明状(可参照图1、图3所示)，具有很高的力学强度，将材料在生理盐水中覆水3h后，用缝线固定其两端做动态热机械分析仪测试其湿态撕裂强度为0.48Mpa，可参照图4所示。同时将此材料移植到兔子角膜基质层术后第10天用荧光素钠染色观察已经完成角膜的全部上皮化，可参照图5所示。
实施例3
一种快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料的制备方法，包括如下步骤：
1)将牛跟腱提取的Ⅰ型胶原蛋白溶解于0.01mol/L的盐酸溶液，配制成浓度为6.5mg/ml的胶原溶液，将透明质酸钠溶解于去离子水配制成0.6mg/ml的透明质酸钠溶液；
2)将胶原蛋白溶液用0.1N盐酸溶液调节其pH至0.9，静置10分钟；
3)分别取上述透明质酸钠溶液和胶原蛋白溶液配制成共混溶液，在所述共混溶液中，透明质酸钠与胶原蛋白的质量比为1：7，将所述共混溶液在4℃冰箱中搅拌1h，再在室温下搅拌12小时，除去气泡，得到除去气泡的溶液；
4)将步骤2)中的除去气泡的溶液倒入特制曲率模具(该模具可参照图2所示)中，然后在室温条件下自然风干，所述特制曲率模具的圆弧曲率为7.5，所述特制曲率模具的圆直径为3mm，得到干态复合曲率胶原膜(Col-NaHA)，从模具中摘取干态复合曲率胶原膜后，将干态复合曲率胶原膜放置在干燥塔中用戊二醛溶液的气体进行交联，所述戊二醛溶液的质量分数为30％，交联时间为40分钟，得到交联后的胶原膜；
5)将所述交联后的胶原膜用生理盐水进行多次冲洗，再放置在室温条件下风干，得到所述快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料。
该实施例的胶原基修复材料为有曲率的圆形透明状(可参照图1、图3所示)，具有很高的力学强度，将材料在生理盐水中覆水3h后，用缝线固定其两端做动态热机械分析仪测试其湿态撕裂强度为0.5Mpa，可参照图4所示。同时将此材料移植到兔子角膜基质层术后第10天用荧光素钠染色观察已经完成角膜的全部上皮化，可参照图5所示。
实施例4
一种快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料的制备方法，包括如下步骤：
1)将牛跟腱提取的Ⅰ型胶原蛋白溶解于0.01mol/L的盐酸溶液中，配制成浓度为6.5mg/ml的胶原溶液，将透明质酸钠溶解于去离子水，配制成0.6mg/ml的透明质酸钠溶液；
2)将胶原蛋白溶液用0.1N盐酸溶液调节其pH至0.9，静置10分钟。
3)分别取上述透明质酸钠溶液和胶原蛋白溶液配制成共混溶液，在所述共混溶液中，透明质酸钠与胶原蛋白的质量比为1：5；将所述共混溶液在4℃冰箱中搅拌1h，再在室温下搅拌12小时，除去气泡，得到除去气泡的溶液；
4)将步骤3)中的除去气泡的溶液倒入特制曲率模具(该模具可参照图2所示)中在室温条件下自然风干，然后在室温条件下自然风干，所述特制曲率模具的圆弧曲率为7.8，所述特制曲率模具的圆直径为10mm，得到干态复合胶原曲率膜(Col-NaHA)，从模具中摘取干态复合曲率胶原膜后，将干态复合曲率胶原膜放置在干燥塔中用戊二醛溶液的气体进行交联，所述戊二醛溶液的质量分数为25％，交联时间为50分钟，得到交联后的胶原膜；
5)将所述交联后的胶原膜用生理盐水进行多次冲洗，再放置在室温条件下风干，得到胶原基角膜修复材料。
该实施例的胶原基修复材料为有曲率的圆形透明状(参照图1、图3所示)，具有很高的力学强度，将材料在生理盐水中覆水3h后，用缝线固定其两端做动态热机械分析仪测试其湿态撕裂强度为0.55Mpa，可参照图4所示。同时将此材料移植到兔子角膜基质层术后第10天用荧光素钠染色观察已经完成角膜的全部上皮化，可参照图5所示。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将透明质酸钠溶解于水中，得到透明质酸钠溶液；将胶原蛋白溶解于盐酸溶液中，得到胶原蛋白溶液；
(2)将步骤(1)所述胶原蛋白溶液的pH值调节至酸性，静置，然后与透明质酸溶液混合，进行第一次搅拌处理，得到共混溶液，进行第二次搅拌处理，得到去除气泡的溶液；
(3)将步骤(2)所述去除气泡的溶液倒入曲率模具中，风干，取出，得到曲率胶原膜；
(4)将步骤(3)所述曲率胶原膜置于干燥塔内，然后通入戊二醛溶液的气体熏蒸进行交联处理，取出，洗涤，风干，得到所述快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料。
2.根据权利要求1所述的快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述透明质酸钠溶液的浓度为0.5-1mg/mL；所述透明质酸钠的分子量为5000-1000000Da。
3.根据权利要求1所述的快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述胶原蛋白为牛跟腱Ⅰ型胶原。
4.根据权利要求1所述的快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述盐酸溶液的摩尔浓度为0.01-0.1mol/L，所述胶原蛋白与盐酸溶液的质量体积比为6.5-6.8：1mg/ml。
5.根据权利要求1所述的快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料的制备方法，其特征在于，在步骤(2)所述共混溶液中，透明质酸钠与胶原蛋白的质量比为1:5-10。
6.根据权利要求1所述的快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，胶原蛋白溶液的pH值调节至0.7-0.9；所述静置的时间为10-20min。
7.根据权利要求1所述的快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述第一次搅拌处理的时间为1-3h，第一次搅拌处理的温度为3-6℃；所述第二次搅拌处理的时间为10-12h，第二次搅拌处理的温度为室温。
8.根据权利要求1所述的快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述曲率模具的圆弧曲率为6.8-7.8，曲率模具的圆直径为3-10mm。
9.根据权利要求1所述的快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述交联处理的时间为40-50分钟，戊二醛溶液的质量分数为25％-50％。
10.一种由权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的快速上皮化的胶原基角膜再生修复材料。
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