CN114618016A - 一种人工角膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于电化学沉积技术组装生物大分子领域，涉及一种具有高透光性，低雾度，结构可定制的胶原膜制备技术，其所获得的胶原膜和应用。所述的人工角膜的制备方法包括设计定制化电极、改进EDP技术组装胶原和化学交联步骤，在电极上获得与角膜形状一致的胶原基人工角膜。胶原基人工角膜材料的特征为：以短程有序取向、且致密排列的胶原微纤维组成，透明度在80％以上，厚度可控，曲率可控。本发明制作过程不需要使用复杂的设备，所获得的胶原基人工角膜材料可以用于替代或者修补天然角膜。
Description
技术领域
本发明属于电化学沉积技术组装生物大分子领域，涉及一种有高透光性，低雾度，结构可定制的胶原膜制备技术，其所获得的胶原膜和应用。
背景技术
全世界每年有1000多万人患有各种角膜疾病，由此导致的失明是一项严重的全球健康挑战。角膜移植是临床上角膜盲视力康复的主要治疗选择，但供体角膜组织不能满足全球需求，仅1片角膜可用于70例需要的患者。为了缓解角膜供体移植物的短缺，临床上迫切需要制造人工角膜替代物。
合成聚合物(例如，聚(乙二醇)、聚(ε-己内酯)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)、聚甲基丙烯酸羟乙基酯等)先前用于制造人工角膜，然而，此类合成材料往往与眼组织相容性不好，无法与宿主组织整合，可能导致严重的炎症和血管生成，并最终通过角膜熔化过程从眼组织中排除。
角膜是由上皮层和内皮层组成的透明的多层组织，最厚的区域是角膜基质层。角膜基质的大部分是基于I型胶原的细胞外基质，稀少分布有角膜基质细胞。胶原是天然角膜基质的主要结构成分，因此与合成聚合物相比，胶原具有更好的眼组织相容性，是制造人工角膜最有潜力的材料。当前的挑战是如何制造具有优越光学性能(即高透明度和低雾度)且能缝合，并且结构可定制(与角膜曲率相匹配以满足屈光度要求、具有一定厚度以能填补特定深度的缺损)的胶原材料，这对于角膜移植后的视力重建至关重要。
胶原分子在中性pH环境溶液中的自组装是一个热力学吸热过程，倾向于发生原纤维的聚集而形成更大尺寸的纤维结构，且排列松散无规，因此导致不透明或半透明的胶原材料。已有报道用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)直接在稀盐酸或稀醋酸中交联胶原分子上的羧基与氨基，后将溶液倒出到制定好的模具中，在恒温恒湿箱中通过水分的蒸发、干燥，从而形成透明的胶原基薄膜(A Simple,Cross-linked CollagenTissue Substitute for Corneal Implantation，Investigative Ophthalmology&VisualScience,May 2006,Vol.47,No.5，1869-1875)。但由于材料内部缺乏胶原自组装结构，其力学强度不好。还有报道称，在胶原溶液中加入环糊精可以有效地调节玻璃化过程中I型胶原蛋白的自组装过程，得到具有与天然角膜相似的独特有序排列结构，形成更小的纤维和层状结构以增加透明度，进一步结合化学交联可以得到透明且机械坚固的角膜替代品(CN106456833A)。但通常需要严格控制玻璃化过程的温度和湿度，同时还需要经历一周以上的脱水化和再水化过程，整个过程分为“玻璃化-脱水化-再水化”，三步骤，这会限制其在实际生产中的规模化应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种兼具较好力学性能和光学性能的人工角膜。
本发明要解决的另一个技术问题是提供上述人工角膜的制备方法。
本发明提供了一种人工角膜的制备方法，所述的方法包括设计定制化电极、改进EDP技术组装胶原和化学交联步骤，获得与角膜形状一致的胶原基人工角膜。
可选的，设计定制化电极，是指选取曲率范围为7.8-8.5的阴极作为工作电极。
可选的，改进EDP技术组装胶原包括：
在浓度不高于20mg/ml的胶原醋酸溶液中按照5-200μl/ml的浓度加入过氧化氢作为电解液，
在电解液中平行安置阳极和阴极，阳极和阴极的距离为0.5-3.0cm，进行电沉积反应，时间为10-60分钟，获得在阴极上沉积的胶原凝胶膜。
可选的，阴极与天然角膜曲率匹配。
可选的，改进EDP技术组装胶原过程中加入过氧化氢的浓度为5-17％，体积百分比。
可选的，化学交联选自光化学交联、戊二醛交联或者EDC-NHS交联。
本发明中，所述的改进EDP技术组装胶原是一种外观非常均匀的胶原凝胶膜，在干态和湿态均高度透明，以短程取向的胶原微纤以非共价键连接而成；胶原排列致密；材料外观透明、结构均匀；胶原材料能被溶剂再次溶解，可被循环制备。该胶原凝胶膜能在电极上直接获得，制备完成后能够从电极剥离，其制备过程可以按照如下步骤进行：
S1，胶原溶液的配置：在胶原蛋白溶液中添加醋酸使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为1.5-4，浓缩后获取浓度在1-20mg/ml范围的胶原溶液。
S2，向步骤S1获得的胶原溶液中加入过氧化氢使其在溶液中的终浓度为5-200μl/ml，并搅拌、除去气泡，置于0-10℃备用；可选的，加入过氧化氢的量为5-17％。
S3，以钛片作为工作电极、铂作为对电极，两个电极平行放置在电解池中电极之间的距离控制在0.5-3.0cm，在电解池中缓慢加入步骤S2所制备的胶原溶液。
S4，采用恒电压或者恒电流沉积进行电化学反应，沉积时间10-120分钟，获得在阴极上沉积的胶原凝胶膜。
可选的，所述改进EDP技术组装胶原，包括以下步骤：
(1)胶原溶液的配置：配置10mg/ml的胶原溶液，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5，将其装入透析袋并放入装有体积比为15％冰醋酸的溶液中透析2-5天；
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢100μl/ml，并搅拌均匀，离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存；
(3)选取曲率为8.0的钛板电极作为工作电极，铂丝或铂片作为阳极，将两个电极水平平行放置在电解池中，电极之间的距离控制在1.5cm，缓慢加入胶原溶液；
(4)进行电沉积反应，施加阴极电压，采用恒电流沉积或者恒电压沉积在阴极上获得具一定厚度的胶原凝胶膜。
可选的，所述的光交联，是将胶原凝胶膜浸泡在1mg/ml的核黄素溶液中，以90％v/v乙醇-水为溶剂，在365nm紫外光照射下交联20-30小时；例如，交联24小时，以进一步增强材料的力学性能。
可选的，所述的戊二醛交联，是指将胶原凝胶膜浸泡在0.1-0.6％w/v戊二醛溶液里，90％v/v乙醇-水为溶剂，交联15-50分钟，随后去除胶原膜中残留的戊二醛组分。较好的，戊二醛溶液的浓度为0.2-0.5％w/v。去除残留的戊二醛组分可以使用漂洗的方式，例如，使用超纯水反复清洗，去除胶原膜中残留的戊二醛组分。
可选的，所述的EDC-NHS交联，是指将胶原凝胶膜浸泡在EDC/NHS(n(EDC)∶n(NHS)＝2:1)的90％v/v乙醇-水溶液中，EDC的质量浓度为0.5g/L，用MES缓冲剂调pH值至5.5,4℃下交联24h，取出后用去离子水反复冲洗。
相应的，本发明提供了一种新的人工角膜，所述的人工角膜与天然角膜曲率匹配、高度透光、可缝合、结构可定制。可选的，所述的人工角膜通过上述方法制备。
另一方面，本发明提供了所述的人工角膜的制备方法的应用，使用所述的人工角膜的制备方法制备人工角膜，替代天然角膜或者修补天然角膜。
可选的，所述的人工角膜具备以下特征中的一种或者几种：与角膜曲率匹配，可以按照需要设计厚度，具有优异光学透明度，保留较好的微观形貌，机械强度高，能够耐缝合，具有较好的细胞相容性，有助于提高角膜上皮细胞的黏附、增殖，迁移。
可选的，所述的应用包括以下步骤：
(A)按照需要将权利要求1制备的人工角膜裁剪；
(B)将裁剪后的人工角膜填充并缝合于缺损部位；
(C)修复至少2周。
可选的，人工角膜的直径可根据角膜损伤的面积按需设计，例如不少于6mm，可以是7mm以上。修复时间通常应视损伤情况而确定，例如不少于3-6周，甚至在8周以上。
相对于之前报道的直接针对胶原分子的EDC交联技术(A Simple,Cross-linkedCollagen Tissue Substitute for Corneal Implantation，InvestigativeOphthalmology&Visual Science,May 2006,Vol.47,No.5，1869-1875)，本发明的胶原分子预先经改进EDP技术组装后形成胶原微纤，再经化学交联，则力学性能好、曲率和厚度可控，制备方法也简便高效。
较之之前的环糊精技术(CN106456833A)：本发明制备过程快速简便、宏观结构可定制、厚度可控、材料中不需要掺入环糊精，避免了后续的眼组织相容性的问题。
本发明提供了一种具有高度透明、可缝合、结构可定制(曲率、厚度)的胶原基人工角膜制备技术。该技术分为“设计定制化电极-改进EDP技术组装胶原-化学交联”3步骤。该胶原基人工角膜材料的特征为：以短程有序取向、且致密排列的胶原微纤维组成，透明度在80％以上，宏观结构为可定制弧形结构，厚度依据改进EDP技术中的电化学条件参数进行调控。本发明制作过程，不需要使用复杂的设备，所获得的胶原基人工角膜材料可以用于替代或者修补天然角膜。
附图说明
图1是EDP技术组装胶原材料及其制备方法的示意图。
其中，图1(a)是在固定曲率的电极上制备的胶原凝胶膜，可以用作人工角膜，图1(b)显示随着制备参数的调整，胶原凝胶膜呈现不同的厚度。
图2是EDP胶原材料化学交联后性能测试结果图。
图2(a)和(b)中，与溶液组装的胶原膜S-Col相比，改进电化学技术组装的E-Col胶原凝胶膜材料，在波长380nm到800nm之间呈现出80％-90％的高透光率，且随波长变长透光率增加(正常人角膜在430nm波长处的透光率约为80％，在500nm以上的波长可接近100％)，而采用不同方法交联E-Col凝胶材料，基本不会改变E-Col的光学透明度，明显优于溶液方法组装的S-Col凝胶材料。图2(c)通过控制电流强度及施加时间处理固定曲率的胶原膜E-Col，得到凝胶态厚度约为200、300、400和500μm的E-Col。结果显示，厚度增加基本不影响材料的高透光性和低雾度。
图3是EDP胶原材料化学交联后的微观形貌表征图。
将实施例3制备的S-Col、E-Col-UV、E-Col-GA和E-Col胶原膜进行冷冻干燥，然后通过扫描电子显微镜(SEM,S-4800,Hitachi)对冷冻干燥薄膜的微观形貌进行分析。S-Col膜呈现乳白色的半透明状，表面呈现较粗的纤维状结构，断面呈现纤维疏松堆叠的形貌。E-Col凝胶材料高度透明，表面形貌表明其由更小尺寸的纤维取向的排列而成，断面呈现紧密堆砌的层状结构。在交联后，表面仍能较好的保留取向结构，从断面结构看，交联在一定程度上让结构变得更加致密。对结构上的观察进一步佐证了，E-Col在交联后由于能保留较好的微观形貌，而在宏观上也显示出优异的光学性能。
图4是EDP胶原材料化学交联后的力学性能表征图。
采用同实施例3相同的方法制备E-Col-UV、E-Col-GA和E-Col胶原膜。将其裁剪成长度30mm，宽度10mm的矩形样条，采用Electro-Force3200型生物动力试验仪比较胶原膜在室温下的力学性能。图4(a-b)中，拉伸速率设定在10mm/min，得到胶原膜的应力-应变曲线，交联后的E-Col-UV和E-Col-GA凝胶膜相比于E-Col凝胶膜的强度明显提升，而断裂伸长率有所下降。虽然交联后断裂应变有所下降，但E-Col-UV(1.33±0.19MPa)和E-Col-GA(5.22±0.73MPa)的断裂强度有着明显提升，推测E-Col-GA由于存在更高的交联密度，交联后的力学强度更高，表明E-Col-GA在手术过程中和术后修复期间能够承受较高的外界剪切和拉伸，以保持材料和患处的力学稳定。图4(c)中进行了材料缝合强度的力学测试，结果显示E-Col-GA相比于E-Col-UV具有更高的耐缝合性能。图4(d)定量的描述了材料的耐缝合阻力，E-Col-GA(1.75±0.3N)且显着高于E-Col-UV(0.33±0.13N)，说明E-Col-GA的缝合阻力可能足够坚固，可以使用穿透缝合线进行植入。
图5是人角膜上皮细胞(HCECs)在E-Col-GA膜上的细胞黏附与增殖测试结果图。
结合实施例3和5，选择E-Col-GA凝胶膜用于细胞实验。图5(a)显示，在E-Col-GA膜上的人角膜上皮细胞(HCECs)能够较好的黏附在其表面，且呈现铺展的状态；接种在E-Col-GA膜和组织培养孔板上的HCECs在1、3和5天均表现持续的增殖，且在5天内的考察期间内并没有发现明显的死细胞。图5(b)表明E-Col-GA膜具备较好的细胞相容性。定量的CCK-8的细胞代谢活性也证实了这一观察结果，接种在E-Col-GA膜和组织培养孔板对照上的HCECs细胞在接种后1、3和5天均表现出高活力(>90％)，如图5(c)所示，这些结果证实，E-Col-GA膜具备优异的细胞相容性，可以支持人角膜上皮细胞(HCECs)的黏附和增殖。
图6是细胞划痕结果及其统计图。
图6(a)显示，接种在E-Col-GA凝胶膜表面的上皮细胞可以在不到36小时内完成迁移以填满划痕区域(宽度约500μm)，与之相比，上皮细胞在孔板底部的迁移速率更慢，在36小时时仍然没有迁移填满划痕区域。为了量化向划痕区域的迁移，在不同时间点将细胞迁移到划痕区域的面积占初始的划痕区域面积百分比进行了计算。结果表明，在产生划痕后12、24和36小时，细胞在E-Col-GA凝胶膜上的细胞迁移完成率显着高于对照(组织培养板)的相对细胞迁移完成率，如图6(b)所示，在36小时，E-Col-GA凝胶膜的细胞迁移完成率基本已达到100％，比对照(孔板)高33％。这表明E-Col-GA膜有利于人角膜上皮细胞(HCECs)的细胞迁移。
图7是E-Col-GA膜在体内的角膜板层移植修复结果图。
其中，显示了正常角膜、构建缺损直径(7mm、深度250μm)后角膜以及E-Col-GA移植后角膜的示意图及手术中的实物照片图片。从实物图片可以观察到E-Col-GA可以缝合于缺损部位，同时呈现出高度透明的性状。
图8为术后裂隙灯活组织镜检查结果图。
在术后1周，2周，4周，6周和8周时间点，采用裂隙灯在兔子全身麻醉下进行角膜组织无损观察。如图8显示，无材料植入空白组在术后1周后会出现明显的水肿现象，而导致角膜的一定程度的浊化不透明表现，但随着时间延长会逐步消退，再次恢复透明的形态。但在8周的观察期结束后，仍然能够观察到明显的缺损边界(白色箭头标识)。与之相比，实验组(E-Col-GA)和阳性对照组(商业的猪角膜脱细胞基质膜)，在材料植入后首先会出现一定程度的免疫反应，周围会有部分细微血管出现，同时组织也会有轻微的水肿现象出现，属于材料植入角膜缺损的正常免疫反应。但随时间的延长，周围刺激形成的血管会逐步消退。
其中，图8(a)表明上皮细胞在不同组别上都有明显的迁移发生(荧光素将上皮缺损染成绿色)，但上皮化的速率有所差异，空白对照组由于角膜上皮细胞是沿着缺损的基质层表面生长，因而迁移最快。图8(b)显示实验组(E-Col-GA)表现出与阳性对照组(猪角膜脱细胞基质膜)相当甚至更快的角膜上皮化速率，在术后4周基本已经完全上皮化。图8(c)利用软件Image J定量计算植入后血管化区域的面积占比，可以观察到实验组和阳性对照组在植入后2周内出现明显的血管，但实验组相对于阳性组的血管形成的区域较小，且在植入两周后，两组别初始形成的血管逐步消退。植入6周后，实验组初始形成的血管已完全退去，而阳性对照组仍有部分未退去的血管。此外，在植入8周后，可以观察到实验组的角膜基本上完全透明；而阳性对照组则呈现一定程度的浊化现象，还尚未恢复角膜的正常透明度，推测与植入后显著的免疫反应有关。而相比于空白对照组，两个植入组在8周的修复期完成后都已观察不到明显的缺损边界。
图9是术后光学相干断层扫描检查图。
图9(a)是不同组别在手术后0到8周的缺损处断层图像。无材料植入组，在术后1周出现了明显的水肿情况，在术后2周基本上水肿已经逐步消退，但仍然能观察明显的角膜基质层的缺损。且随着时间的延长，在4周时虽然已经可以观察到完整的上皮形成，但即便到了8周，缺损处的角膜基质层厚度基本无法恢复到正常的水平(如图中白色箭头所示)。而与之相比，实验组和阳性对照组在术后一天植入后，就基本完全恢复了正常角膜的厚度。在术后一天后，可以看到材料与基质层的界面(如图中橙色箭头所示)，而在1周后，材料与基质层的界面已经逐渐模糊(如图中“红色”箭头所示)，表明材料与自体基质组织的融合。此外在材料和自体组织融合的同时，可以看到上皮化的逐步形成，在植入8周后能观察到完整的上皮化组织的形成(图中白色箭头所示)，而红色箭头所示区域也表明，材料和自体基质层的基本融合。
图9(b-c)中可以观察到兔子的正常角膜厚度约在550μm。在构建缺损后，角膜厚度出现明显的下降，厚度测量显示缺损后的角膜厚度约在200μm附近。在术后8周后，无材料植入组的厚度又一定程度的生长。与之相比，实验组和阳性对照组，在植入八周后基本已经恢复到了正常角膜的厚度。
具体实施方式
本发明采用“设计定制化电极-改进EDP技术组装胶原-化学交联(光化学交联、戊二醛交联、EDC-NHS交联)”3步骤，获得高度透光、可缝合、结构可定制(与角膜曲率匹配、按需设计厚度)胶原基人工角膜。改进EDP技术实现对I型胶原蛋白分子的可控组装，形成小尺寸的胶原微纤维(20nm至30nm)，并利用电场使其紧密排列，得到具有优异光学透明度的胶原基质材料(E-Col)；设计与角膜曲率一致的模板电极，利用改进EDP技术沉积制得宏观结构可控的弧形E-Col，以满足角膜替代物对屈光度的要求；进一步化学交联固定其组装结构同时提升力学，构筑了一种高度透明，机械强度可支持缝合的胶原基人工角膜。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：EDP技术组装胶原材料I
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MW cut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白粘稠液体(改变加入胶原蛋白原料的质量，可以调节最终获取的胶原溶液浓度在1-20mg/ml范围变化，当超出20mg/ml后溶液失去流动性，优选方案为10mg/ml)。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢100μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解(加入的过氧化氢浓度可以在5-200μl/ml范围内选择，超出最大值200μl/ml过氧化氢容易在电解液中直接分解而产生气泡)。
(3)选取固定曲率的钛板电极(曲率为8.0，可根据实际需求，曲率可调范围为：7.8-8.5，如图1(a)所示)作为工作电极，铂丝或铂片(阳极)作为对电极。电极的安装方式有两种：一种是将两个电极垂直平行放置在电解池中，另一种是将两个电极水平平行放置在电解池中，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备10mg/ml的胶原溶液，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI 660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为5mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间1500s秒，发生的电极半反应如下所示：
阳极：2H2O-4e-→4H++O2
阴极：4H2O+4e-→4OH-+2H2
控制电流密度和沉积时间均可以在阴极上获得具一定厚度的胶原凝胶膜(如图1(b)所示)。用超纯水多次清洗带胶原水凝胶膜的工作电极，然后从电极上剥离胶原材料E-Col。水平电极和竖直电极均能制备胶原材料，但发现竖直电极制备的材料会因重力原因上薄下厚，采用水平电极可避免此情况。
实施例2：EDP技术组装胶原材料Ⅱ
(1)胶原溶液的配置：准确称取800mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得20mg/ml的胶原蛋白粘稠液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢160μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取固定曲率的钛板电极(曲率为8.0，可根据实际需求，曲率可调范围为：7.8-8.5，如图1(a)所示)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为20mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例3：EDP技术组装胶原材料Ⅲ
(1)胶原溶液的配置：准确称取40mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得1mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢50μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取固定曲率的钛板电极(曲率为8.0，可根据实际需求，曲率可调范围为：7.8-8.5，如图1(a)所示)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为1mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例4：EDP技术组装胶原材料Ⅳ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为2.0。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和200ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢80μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取固定曲率的钛板电极(曲率为8.0，可根据实际需求，曲率可调范围为：7.8-8.5，如图1(a)所示)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例5：EDP技术组装胶原材料Ⅴ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为4.0。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和20μl冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢80μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取固定曲率的钛板电极(曲率为8.0，可根据实际需求，曲率可调范围为：7.8-8.5，如图1(a)所示)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例6：EDP技术组装胶原材料Ⅵ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢50μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取固定曲率的钛板电极(曲率为8.0，可根据实际需求，曲率可调范围为：7.8-8.5，如图1(a)所示)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例7：EDP技术组装胶原材料Ⅶ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取固定曲率的钛板电极(曲率为8.0，可根据实际需求，曲率可调范围为：7.8-8.5，如图1(a)所示)，将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例8：EDP技术组装胶原材料Ⅷ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取固定曲率的钛板电极(曲率为8.0，可根据实际需求，曲率可调范围为：7.8-8.5，如图1(a)所示)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例9：EDP技术组装胶原材料Ⅸ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取固定曲率的钛板电极(曲率为8.0，可根据实际需求，曲率可调范围为：7.8-8.5，如图1(a)所示)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在0.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例10：EDP技术组装胶原材料Ⅹ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取固定曲率的钛板电极(曲率为8.0，可根据实际需求，曲率可调范围为：7.8-8.5，如图1(a)所示)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在3.0cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例11：EDP技术组装胶原材料Ⅺ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取固定曲率的钛板电极(曲率为8.0，可根据实际需求，曲率可调范围为：7.8-8.5，如图1(a)所示)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在3.0cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间500秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例12：EDP技术组装胶原材料Ⅻ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取固定曲率的钛板电极(曲率为8.0，可根据实际需求，曲率可调范围为：7.8-8.5，如图1(a)所示)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在3.0cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间3000秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例13：EDP胶原材料的化学交联
按照实施例1的方法制备固定曲率的胶原膜E-Col。可采用光交联和戊二醛交联等胶原材料常规的化学交联方法。以下简述两种方法的操作步骤。
光交联：将实施例1制备的胶原膜浸泡在1mg/ml的核黄素溶液中(90％v/v乙醇-水)，在365nm紫外光照射下交联24小时，以进一步增强材料的力学性能。
戊二醛交联：配制戊二醛溶液(0.5％w/v，90％v/v乙醇-水)，将实施例1制备的胶原膜浸泡在戊二醛溶液里，交联30min。随后用超纯水反复清洗，去除胶原膜中残留的戊二醛组分。
实施例14：EDP胶原材料化学交联后的光学性能表征
采用同实施例1相同的方法制备固定曲率的胶原膜E-Col，通过控制电流强度及施加时间，得到凝胶态厚度约为400μm的E-Col。为了比较，透析后的胶原蛋白溶液同时使用溶液法制备成胶原膜S-Col，用0.5M NaOH将酸性胶原蛋白溶液(5mg/mL；pH＝3.5)调节到中性pH＝7.2，然后浇铸在圆形薄膜培养皿中(单位面积胶原含量与EDP组装的胶原单位面积质量相同)，在37℃下孵育12小时以完全凝胶化，随后将凝胶在室温下脱水48小时，形成厚度约400μm的乳白色半透明凝胶膜。将胶原膜E-Col分别通过光交联和戊二醛交联，记为E-Col-UV和E-Col-GA，空白组E-Col不做任何处理。
将上述得到的S-Col、E-Col-UV、E-Col-GA和空白组E-Col在超纯水中浸泡1小时，以达到饱和含水量，裁剪成固定大小的尺寸方片置于比色皿内，利用紫外可见光分光光度计(Lambda 950)检测其在可见光波长范围(380nm到800nm)范围内的透光率(％)及雾度(％)(测得数值需扣除比色皿的背景)。
所有组别的胶原凝胶膜材料，在波长380nm到800nm之间都呈现出随波长变长透光率增加，而采用不同方法交联E-Col凝胶材料，基本不会改变E-Col的光学透明度，且明显优于溶液方法组装的S-Col凝胶材料。正常人角膜在430nm波长处的透光率约为80％，在500nm以上的波长可接近100％，而E-Col在交联前后在400nm处波长就已经超过80％，随着波长的增加，500nm波长以上透光率稳定在94％左右，能够接近正常角膜的透光率水平。此外，所有样品的雾度都随着波长增加呈现降低的趋势，不同方法交联后，雾度有一定程度的上升，但也基本保证在较低的水平(低于30％)，如图2(a)和(b)所示。
采用同实施例1相同的方法制备固定曲率的胶原膜E-Col，通过控制电流强度及施加时间，得到凝胶态厚度约为200、300、400和500μm的E-Col。采用同样方法分别评价了其透光度和雾度。结果如图2(c)所示，厚度增加基本不影响材料的高透光性和低雾度。
实施例15：EDP胶原材料化学交联后的微观形貌表征
将实施例14制备的S-Col、E-Col-UV、E-Col-GA和E-Col胶原膜进行冷冻干燥，然后通过扫描电子显微镜(SEM,S-4800,Hitachi)对冷冻干燥薄膜的微观形貌进行分析，如图3所示。
S-Col膜呈现乳白色的半透明状，表面呈现较粗的纤维状结构，断面呈现纤维疏松堆叠的形貌。E-Col凝胶材料高度透明，表面形貌表明其由更小尺寸的纤维取向的排列而成，断面呈现紧密堆砌的层状结构。在交联后，表面仍能较好的保留取向结构，从断面结构看，交联在一定程度上让结构变得更加致密。对结构上的观察进一步佐证了，E-Col在交联后由于能保留较好的微观形貌，而在宏观上也显示出优异的光学性能。
实施例16：EDP胶原材料化学交联后的力学性能表征
采用同实施例14相同的方法，制备了E-Col-UV、E-Col-GA和E-Col胶原膜。将其裁剪成长度30mm，宽度10mm的矩形样条，采用Electro-Force3200型生物动力试验仪，研究了胶原膜在室温下的力学性能。
首先测试并比较了E-Col，E-Col-UV和E-Col-GA凝胶膜材料的拉伸性能。拉伸速率设定在10mm/min，得到胶原膜的应力-应变曲线。如图4(a-b)所示，交联后的E-Col-UV和E-Col-GA凝胶膜相比于E-Col凝胶膜的强度明显提升，而断裂伸长率有所下降。虽然交联后断裂应变有所下降，但E-Col-UV(1.33±0.19MPa)和E-Col-GA(5.22±0.73MPa)的断裂强度有着明显提升，推测E-Col-GA由于存在更高的交联密度，交联后的力学强度更高，表明E-Col-GA在手术过程中和术后修复期间能够承受较高的外界剪切和拉伸，以保持材料和患处的力学稳定。
进一步，进行了材料缝合强度的力学测试，如图4(c)所示，E-Col-GA相比于E-Col-UV具有更高的耐缝合性能。图4(d)定量的描述了材料的耐缝合阻力，E-Col-GA(1.75±0.3N)且显着高于E-Col-UV(0.33±0.13N)，说明E-Col-GA的缝合阻力可能足够坚固，可以使用穿透缝合线进行植入。
实施例17：人角膜上皮细胞(HCECs)在E-Col-GA膜上的细胞黏附与增殖
结合实施例14和16，选择E-Col-GA凝胶膜用于细胞实验。
(1)细胞黏附实验：将制备的E-Col-GA凝胶膜切成直径为10mm的圆形，然后放入48孔板中。浸泡75％酒精后紫外光源辐照过夜以灭菌，随后用PBS多次润洗材料。将人角膜上皮细胞(HCECs)以每孔5×104个细胞的密度播种到膜上并进行培养12hours。随后用2.5％戊二醛固定20min，固定完成后用PBS清洗两次，按照50％、70％、90％、100％的乙醇逐步脱水，每次10min。随后滴加乙酸异戊酯后烘箱干燥后，通过SEM(S-4800,Hitachi)观察细胞12hours的黏附形态。
(2)细胞增殖实验：按照上述同样的步骤进行细胞的接种实验，并在不同时期利用Live/Dead细胞染料对细胞进行染色并通过共聚焦激光显微镜(CLSM，Nikon A1R)观察。在37℃细胞培养箱(5％CO2)中培养1、3和5天后使用CCK8细胞活力检测(DOJINDO)评估细胞的增殖情况，每组设置4个平行样，取平均值。
(3)细胞迁移实验：将上述凝胶膜切成直径为10mm的圆形，然后放入48孔板中。浸泡75％酒精后紫外光源辐照过夜以灭菌，随后用PBS多次润洗材料去除残留的酒精，同时保证材料紧密贴合在孔板底部。将人角膜上皮细胞(HCECs)以每孔10×104个细胞的密度播种到膜表面并进行培养，空白对照组将细胞以同样密度接种在孔板上。通过倒置显微镜观察，当细胞长满材料及孔板表面后进行划痕操作，利用200μL枪头在材料或孔板表面轻柔的划出一条长条形的划痕。在制造出划痕后的0h，12h，24h及36h，用倒置显微镜观察并记录划痕的愈合情况。利用Image J定量不同时间点细胞的迁移情况，定量HCECs迁移到划痕区域的面积A1(初始的划痕面积为A0)，计算细胞迁移密度率ρ(％)，每组设置4个平行样取平均值：
ρ(％)＝(A0/A1)×100％ 公式1。
结果显示：如图5(a)所示，在E-Col-GA膜上的人角膜上皮细胞(HCECs)能够较好的黏附在其表面，且呈现铺展的状态；接种在E-Col-GA膜和组织培养孔板上的HCECs在1、3和5天均表现持续的增殖，且在5天内的考察期间内并没有发现明显的死细胞，如图5(b)所示，表明E-Col-GA膜具备较好的细胞相容性。定量的CCK-8的细胞代谢活性也证实了这一观察结果，接种在E-Col-GA膜和组织培养孔板对照上的HCECs细胞在接种后1、3和5天均表现出高活力(>90％)，如图5(c)所示，这些结果证实，E-Col-GA膜具备优异的细胞相容性，可以支持人角膜上皮细胞(HCECs)的黏附和增殖；如图6(a)所示的体外划痕试验结果表明：接种在E-Col-GA凝胶膜表面的上皮细胞可以在不到36小时内完成迁移以填满划痕区域(宽度约500μm)，与之相比，上皮细胞在孔板底部的迁移速率更慢，在36小时时仍然没有迁移填满划痕区域。为了量化向划痕区域的迁移，在不同时间点将细胞迁移到划痕区域的面积占初始的划痕区域面积百分比进行了计算。结果表明，在产生划痕后12、24和36小时，细胞在E-Col-GA凝胶膜上的细胞迁移完成率显着高于对照(组织培养板)的相对细胞迁移完成率，如图6(b)所示，在36小时，E-Col-GA凝胶膜的细胞迁移完成率基本已达到100％，比对照(孔板)高33％。这表明E-Col-GA膜有利于人角膜上皮细胞(HCECs)的细胞迁移。
实施例18：E-Col-GA膜在体内的角膜板层移植修复实验
(1)角膜板层缺损模型的构建
选择10-12周龄雄性新西兰白兔(由上海复旦大学附属五官科医院提供)在无菌条件下对兔眼进行了层状(250μm厚度)角膜切除术。全身麻醉后,使用肌内注射盐酸塞拉嗪注射液(1-2毫克/千克)及盐酸奥布卡因滴眼液进行局部麻醉。利用直径7mm负压真空环钻在中央角膜处制造出深度约为250μm的缺损。然后，用手术刀在相同深度进行板层角膜切除术。分别将E-Col-GA膜和商业的脱细胞猪角膜基质(标记为Commercial)填充并缝合于不同的兔角膜缺损部位，同时以不在缺损部位植入任何材料作为空白对照。
如图7所示，显示了正常角膜、构建缺损直径(7mm、深度250μm)后角膜以及E-Col-GA移植后角膜的示意图及手术中的实物照片。从实物图片可以观察到E-Col-GA可以缝合于缺损部位，同时呈现出高度透明的性状。
(2)术后裂隙灯活组织镜检查
在术后1周，2周，4周，6周和8周时间点，采用裂隙灯在兔子全身麻醉下进行角膜组织无损观察。采用白光模式，在×16放大倍率下，使用狭缝和宽光束，评估植入后的薄膜材料和周围角膜的透明度。为了评估角膜上皮在植入薄膜上的迁移，将荧光素钠眼科试纸润湿在植入部位对缺损区域进行荧光染色，采用钴蓝裂隙灯荧光染色摄影。
如图8所示，显示了不同组别处理后8周的愈合情况。无材料植入空白组，在术后1周后会出现明显的水肿现象，而导致角膜的一定程度的浊化不透明表现，但随着时间延长会逐步消退，再次恢复透明的形态。但在8周的观察期结束后，仍然能够观察到明显的缺损边界(白色箭头标识)。与之相比，实验组(E-Col-GA)和阳性对照组(商业的猪角膜脱细胞基质Commercial)，在材料植入后首先会出现一定程度的免疫反应，周围会有部分细微血管出现，同时组织也会有轻微的水肿现象出现，属于材料植入角膜缺损的正常免疫反应。但随时间的延长，周围刺激形成的血管会逐步消退，图8(c)利用软件Image J定量计算植入后血管化区域的面积占比，可以观察到实验组和阳性对照组在植入后2周内出现明显的血管，但实验组相对于阳性组的血管形成的区域较小，且在植入两周后，两组别初始形成的血管逐步消退。植入6周后，实验组初始形成的血管已完全退去，而阳性对照组仍有部分未退去的血管。此外，在植入8周后，可以观察到实验组的角膜基本上完全透明；而阳性对照组则呈现一定程度的浊化现象，还尚未恢复角膜的正常透明度，推测与植入后显著的免疫反应有关。而相比于空白对照组，两个植入组在8周的修复期完成后都已观察不到明显的缺损边界。
此外观察了兔角膜上皮细胞在凝胶膜上的迁移情况。用荧光素染色后的钴蓝裂隙灯照片显示不同组别角膜上皮缺损的大小逐渐减小，如图8(a)所示，表明上皮细胞在不同组别上都有明显的迁移发生(荧光素将上皮缺损染成绿色)，但上皮化的速率有所差异，空白对照组由于角膜上皮细胞是沿着缺损的基质层表面生长，因而迁移最快。而实验组(E-Col-GA)表现出与阳性对照组(猪角膜脱细胞基质膜Commercial)相当甚至更快的角膜上皮化速率，在术后4周基本已经完全上皮化，如图8(b)所示。
(3)术后光学相干断层扫描检查
OCT是一种高分辨率的横断面和非接触成像系统，可以用于检测材料和组织的融合情况。在术后1周，2周，4周和8周在全身麻醉下进行前段光学相干断层扫描(OCT)。
首先观察了不同组别在手术后0到8周的缺损处断层图像，如图9(a)所示。无材料植入组，在术后1周出现了明显的水肿情况，在术后2周基本上水肿已经逐步消退，但仍然能观察明显的角膜基质层的缺损。且随着时间的延长，在4周时虽然已经可以观察到完整的上皮形成，但即便到了8周，缺损处的角膜基质层厚度基本无法恢复到正常的水平(如图中白色箭头所示)。而与之相比，实验组和阳性对照组在术后一天植入后，就基本完全恢复了正常角膜的厚度。在术后一天后，可以看到材料与基质层的界面(如图中橙色箭头所示)，而在1周后，材料与基质层的界面已经逐渐模糊(如图中红色箭头所示)，表明材料与自体基质组织的融合。此外在材料和自体组织融合的同时，可以看到上皮化的逐步形成，在植入8周后能观察到完整的上皮化组织的形成(图中白色箭头所示)，而红色箭头所示区域也表明，材料和自体基质层的基本融合。
进一步，利用OCT的全角膜厚度观测模式，观察了术后8周时的全角膜厚度地形图及定量的厚度测定，如图9(b-c)所示。可以观察到兔子的正常角膜厚度约在550μm。在构建缺损后，角膜厚度出现明显的下降，厚度测量显示缺损后的角膜厚度约在200μm附近。在术后8周后，无材料植入组的厚度又一定程度的生长。与之相比，实验组和阳性对照组，在植入八周后基本已经恢复到了正常角膜的厚度。
上述相关说明以及对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些内容做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述相关说明以及对实施例的描述，本领域的技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种人工角膜的制备方法，其特征在于，所述的方法包括设计定制化电极、改进EDP技术组装胶原和化学交联步骤，获得与角膜形状一致的胶原基人工角膜；
其中，
设计定制化电极，是指选取曲率范围为7.8-8.5的阴极作为工作电极；
改进EDP技术组装胶原包括：
在浓度不高于20mg/ml的胶原的醋酸溶液中按照5-200μl/ml的浓度加入过氧化氢作为电解液，
在电解液中平行安置阳极和定制阴极，阳极和阴极的距离为0.5-3.0cm，
进行电沉积反应，时间为10-60分钟，
获得在阴极上沉积的胶原凝胶膜。
2.根据权利要求1所述的人工角膜的制备方法，其特征在于，阴极的形状与天然角膜曲率匹配；或者，
改进EDP技术组装胶原过程中加入过氧化氢的浓度为5-17％，体积百分比；或者，
化学交联选自光化学交联、戊二醛交联或者EDC-NHS交联。
3.根据权利要求1所述的人工角膜的制备方法，其特征在于，所述改进EDP技术组装胶原，包括以下步骤：
(1)胶原溶液的配置：配置10mg/ml的胶原溶液，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5，将其装入透析袋并放入装有体积比为15％冰醋酸的溶液中透析2-5天；
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢100μl/ml，并搅拌均匀，离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存；
(3)选取曲率为8.0的钛板电极作为工作电极，铂丝或铂片作为阳极，将两个电极水平平行放置在电解池中，电极之间的距离控制在1.5cm，缓慢加入胶原溶液；
(4)进行电沉积反应，施加阴极电压，采用恒电流沉积或者恒电压沉积在阴极上获得具一定厚度的胶原凝胶膜。
4.根据权利要求1所述的人工角膜的制备方法，其特征在于，
所述的光交联，是将胶原凝胶膜浸泡在1mg/ml的核黄素溶液中，以90％v/v乙醇-水为溶剂，在365nm紫外光照射下交联20-30小时；或者，
戊二醛交联，是指将胶原凝胶膜浸泡在0.1-0.6％w/v戊二醛溶液里，90％v/v乙醇-水为溶剂，交联15-50分钟，随后去除胶原膜中残留的戊二醛组分。
EDC-NHS交联，是指将胶原凝胶膜浸泡在EDC/NHS的90％v/v乙醇-水溶液中，用MES缓冲剂调pH值至5.5,交联24h，取出后用去离子水反复冲洗。
5.一种人工角膜，其特征在于，所述的人工角膜与天然角膜曲率匹配、高度透光、可缝合、结构可定制。
6.根据权利要求5所述的人工角膜，其特征在于，所述的人工角膜通过权利要求1-4中任意一种方法制备。
7.权利要求1所述的人工角膜的制备方法的应用，其特征在于，使用权利要求1所述的人工角膜的制备方法制备人工角膜，替代天然角膜或者修补天然角膜。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的人工角膜具备以下特征中的一种或者几种：与角膜曲率匹配，可以按照需要设计厚度，具有优异光学透明度，保留较好的微观形貌，机械强度可耐缝合，具有较好的细胞相容性，有助于提高角膜上皮细胞的黏附、迁移和增殖。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用包括以下步骤：
(A)按照需要将权利要求1制备的人工角膜裁剪；
(B)将裁剪后的人工角膜填充并缝合于角膜缺损部位；
(C)修复至少2周。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，人工角膜的直径根据角膜损伤的面积按需设计。
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