WO2023142599A1 - 一种从电极剥离的胶原材料的制备方法及其该胶原材料的应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种从电极剥离的胶原材料的制备方法及其该胶原材料的应用，属于生物大分子组装领域。一种从电极剥离的胶原材料的制备方法，包括以下步骤：将含有过氧化氢和/或醋酸的胶原溶液，电化学沉积后，在电极上得到胶原材料。该方法可以在电极表面直接得到胶原材料。

Description

一种从电极剥离的胶原材料的制备方法及其该胶原材料的应用 技术领域

本申请涉及一种从电极剥离的胶原材料的制备方法及其该胶原材料的应用，属于生物大分子组装领域。

背景技术

胶原是脊椎动物中最丰富的蛋白质之一。由于它具有低免疫源性，高生物相容性，能促进细胞增殖和伤口愈合等优点，已被广泛用于各类生物医用材料。胶原蛋白是一种三螺旋结构，在体内一些内源性信号的指导下，可以进行分级有序组装，即从三螺旋结构开始，经历胶原微纤、胶原原纤、胶原纤维的分级组装，最终形成组织结构。

在体外，人们多使用溶液浇铸方法将单纯的胶原蛋白加工成胶原生物材料。操作步骤是将胶原蛋白溶液调节至中性后至于模具中，于37℃下孵育一段时间以完成胶原分级组装过程。缺点是：1不易于加工各种异形胶原材料；2要持续几个小时，甚至过夜才能完成；3材料内部胶原纤维无序排列、胶原排列密度低、材料外观不透明。

利用电化学沉积技术(Electro-deposition EDP)制备胶原材料是一种较为先进的加工方法，其原理是对胶原的酸性溶液施加电场，驱动胶原分子向阴极区域电泳迁移；同时由于阴极上发生的电化学反应(通常是电解水反应)可升高电极附近溶液pH值，泳动到胶原等电点区域的胶原就被析出，从而形成胶原材料。与溶液组装方法对比，优点是该过程通常比较快，在30-60分钟左右可完成；二是可对材料塑形；三是材料微观结构有取向特征、胶原排列致密、材料外观透明。缺点也很明显：因为等电点区域通常位于电解液中的某个位置，不能直接在电极上沉积得到胶原材料，不方便取材，也不便利用电极形状对胶原材料进行塑形(比如获得管状、不规则形状胶原材料)；并且两个电极之间间距很小，一般1-2mm，不便于操作(An electrochemical fabrication process for the assembly of anisotropically oriented collagen bundles，Biomaterials 29(2008)3278–3288；Tenogenic Induction of Human MSCs by Anisotropically Aligned Collagen Biotextiles，Adv.Funct.Mater.2014,24,5762–5770)。

此外，也有研究者利用脉冲EDP技术，在电极上获得了胶原材料。主要策略是在电解液中加入50％的有机溶剂乙醇(可能是为了降低胶原溶解度)并使用脉冲电压(减小阴极上产生的氢气气泡，以利于胶原沉积)。该方法的缺点有：有机溶剂可能造成胶原蛋白的结构改变，电极获得的材料结构均匀性不容易控制，操作时间较长，需要1.5小时，获得材料不透明(Fabrication of free standing collagen membranes by pulsedelectrophoretic deposition，Biofabrication 11,2019,045017)。

因此，需要开发新的制备方法克服上述缺点，以便更加快速、有效的获得符合要求的胶原材料。

发明内容

根据本申请的第一个方面，提供了一种从电极剥离的胶原材料的制备方法。该制备方法中由于醋酸是一种弱酸，可提供一定的缓冲能力，使得阴极附近的pH值能够接近胶原的等电点，从而在电极表面直接得到胶原材料；可通过改变阴极电极的形状，很方便地对胶原材料进行各种异形结构塑形；阴极反应为过氧化氢分解，不产生气泡，因此有利于获得外观非常均匀致密的胶原材料，尤其是在使用水平电极的情况下，还可以解决因重力造成的胶原膜上薄下厚的情况；电极之间的距离可以在厘米级别，方便操作；制备时间短。该胶原材料的特征为：以短程取向的非晶态的胶原微纤组成；胶原排列致密；胶原材料外观透明、结构均匀，有利于获得更好的力学性能和光学性能；具有塑性形变能力；胶原微纤维之间由非共价键连接，因此可以被溶剂再次溶解，并能重新利用EDP技术制备，也即可被循环制备。

一种从电极剥离的胶原材料的制备方法，包括以下步骤：

将含有过氧化氢和/或醋酸的胶原溶液，电化学沉积后，在电极上得到胶原材料。

可选地，所述胶原溶液的pH值为1.5～4.0。

可选地，所述胶原溶液的浓度为1mg/mL～20mg/mL。

可选地，所述胶原溶液中，所述过氧化氢的体积百分数为5％～17％。

可选地，电化学沉积的条件如下：

温度为0℃～30℃；时间为8min～60min。

可选地，电流密度为0.5mA/cm ²～10mA/cm ²；电压为0.22V/cm ²～1.67V/cm ²。

可选地，电化学沉积中，电极之间的距离为1.0cm～2.5cm。

可选地，阴极选自不锈钢、碳纸、碳布、Pt电极、金电极、石墨电极、Ti电极中的一种。

可选地，阳极选自不锈钢、碳纸、碳布、Pt电极、金电极、石墨电极中的一种。阳极材料不为Ti。

可选地，包括以下步骤：

S1、将含有胶原蛋白溶液、醋酸的混合物混合，得到胶原溶液Ⅰ；

S2、将含有过氧化氢的混合物加入胶原溶液Ⅰ中，得到胶原溶液Ⅱ；

S3、将胶原溶液Ⅱ置于电解池中，电化学沉积，得到胶原材料。

根据本申请的一种实施方式，所述的制备方法包括以下步骤：

S1、胶原溶液的配置：在胶原蛋白溶液中添加醋酸使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为1.5～4.0，浓缩后获取浓度在1mg/mL～20mg/mL范围的胶原溶液；

S2、向步骤S1获得的胶原溶液中加入过氧化氢标准液体，使其在溶液中的终体积百分比为5％～17％，并搅拌、除去气泡，置于0℃～10℃备用；

S3、以钛片作为阴极、铂作为阳极，两个电极平行放置在电解池中电极之间的距离控制在0.5cm～3.0cm，在电解池中缓慢加入步骤S2所制备的胶原溶液；

S4、采用恒电压或者恒电流沉积进行电化学反应，沉积时间10分钟～60分钟，获得可从阴极上剥离的胶原凝胶膜。

本发明的制备方法中，胶原材料能在电极上直接获得。电极间距可以从毫米增加到厘米级别，显著宽于目前常用的2mm的电极距离，极大的方便电极的搭建和后续的操作。例如，电极之间的距离可以控制在0.5cm～3.0cm，更好的控制在1.0cm～1.5cm。

可选的，电极的安装方式包括：将两个电极垂直平行放置在电解池中，或者将两个电极水平平行放置在电解池中。水平电极和竖直电极均能制备胶原材料，但发现竖直电极制备的材料容易因重力原因上薄下厚，采用水平电极可避免此情况。

可选的，步骤S1中调节加入胶原蛋白原料的质量，使最终获取的胶原溶液浓度在5mg/mL～10mg/mL。本发明通过反复测试，可以在电解液中不使用有机溶剂，而通过制备方法中其他参数的调节实现自支撑的胶原(凝胶膜)的制备(也即能从电极上剥离而成为独立的材料)，同时有效阻止阴极产生气泡。改变加入胶原蛋白原料的质量，可以调节最终获取的胶原溶液浓度。当最终获取的胶原溶液浓度超出20mg/mL后溶液失去流动性，通常在1mg/mL～20mg/mL变化范围内能够获得较好的结果。

本发明中，胶原可以采用各种市售的胶原。例如，本发明实施例中所用的胶原来自上海昊海生物科技有限公司。所述的自支撑即Free-standing，不利用其它的基底作为支撑。

可选的，步骤S1中透析液中加入醋酸的终浓度需要根据胶原电解液的pH来确定。透析液中醋酸太少，会降低透析袋中胶原电解液中的醋酸量，降低后续电化学反应中电泳过程中胶原分子的流动性。透析液中醋酸太多，会增加胶原电解液中的醋酸量，容易导致胶原分子在后续电化学反应中无法在阴极表面沉积。实际操作为：将胶原原料放置于超纯水中搅拌，并滴加醋酸，利用pH计监测过程的pH值，直到达到本发明规定的pH范围即可，此时胶原已经完全溶解。

可选的，步骤S2加入的过氧化氢终浓度为50μL/mL～200μL/mL。理论上，增加过氧化氢有助于胶原凝胶膜的快速形成，但是实验结果表明，过氧化氢浓度高于200μL/mL，过氧化氢在电解液中会直接分解，导致电解液中产生气泡，不利于制备均匀的胶原凝胶膜。为了计算方便，过氧化氢的浓度为5％～17％的体积比。例如可以采用各种市售的过氧化氢标准品，例如本发明实施例中使用的过氧化氢标准液体源自(永华化学股份有限公司，货号210401204)。

可选的，步骤S2中离心速度6000rpm/min～8000rpm/min的速度离心。该离心速度有助于排除溶液中因操作产生的气泡，防止后续制备的胶原凝胶膜不均匀。在电解池中加入步骤S2中所制备的胶原溶液时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。

可选的，步骤S4中电压变化范围在0.22V/cm ²～1.67V/cm ²。沉积时间可以控制在10分钟～45分钟，沉积时间可以根据温度、电压、预期胶原凝胶膜的厚度等参数设定和优化。步骤S4也可以使用恒电压的方式进行。

可选的，步骤S1中胶原溶液的配置为：按照400mg I型胶原蛋白溶于40mL超纯水的比例准确称取胶原蛋白和超纯水，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为1.5～3.0；装入透析袋(不透过胶原蛋白即可，例如M _Wcut off＝7.0kDa)一并放入装有含有冰醋酸的水溶液中，于0℃～5℃下透析3天以去除小分子杂质；透析后获得胶原蛋白粘稠液体。

可选的，步骤S2中，向步骤S1所述的胶原溶液中加入过氧化氢50μL/mL～100μL/mL，并搅拌均匀，在0℃～5℃下以5000rpm/min～10000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。

可选的，步骤S3中，选取钛片作为阴极，铂丝或铂片作为阳极，在电解池中小心加入步骤S2中所制备的胶原溶液，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。

可选的，步骤S4中，然后将电极连接到电化学工作站上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为0.5mA/cm ²～10mA/cm ²，电压变化范围在0.22V/cm ²～1.67V/cm ²，沉积时间500秒～2000秒。本发明的制备时间可以缩短至8min～15min，在该时间窗口内可获得湿态厚度为300μm左右的胶原材料，以便更加快捷的获得所需的胶原。也可以根据所需胶原膜的厚度调整沉积时间。

可选的，电极半反应如下：

阳极：2H ₂O-4e ^-→4H ⁺+O ₂；或者，阴极：4H ₂O+4e ^-→4OH ^-+2H ₂。

根据本申请的第二个方面，提供了一种胶原膜，包括以下制备方法：

将含有胶原材料的混合物再次溶解溶剂，循环制备得到所述胶原膜；

所述胶原材料选自上述所述的制备方法得到的胶原材料。

可选地，所述胶原膜的厚度为180μm～550μm。

可选地，所述胶原膜外观均匀，在干态和湿态均高度透明。

可选地，所述胶原膜以短程取向的胶原微纤以非共价键连接而成。

可选地，所述胶原膜中的胶原排列致密。

相应的，本发明提供了一种胶原凝胶膜，其外观非常均匀，在干态和湿态均高度透明，以短程取向的胶原微纤以非共价键连接而成；胶原排列致密；材料外观透明、结构均匀；胶原材料能被溶剂再次溶解，可被循环制备。如果材料内部不均匀(尤其是因为气泡的产生，导致内部出现缺陷)当受到外力作用时候，材料会产生应力集中现象，在结构缺陷处率先断裂。此外，内部出现的结构缺陷也会使入射光发生散射，使材料的透明度下降。本发明的该胶原凝胶膜制备完成后，能够从电极剥离。

可选的，所述的胶原凝胶膜由本发明从电极剥离的胶原材料的制备方法获得。

本发明提供了所述胶原凝胶膜或者其制备方法的应用，使用该制备方法在电极上制备胶原凝胶膜，并进而获得胶原材料。本发明制备的胶原材料可以被溶剂再次溶解，并能重新利用EDP技术制备，也即可被循环制备，可促进节能环保。

本发明中胶原凝胶膜是在电极上生产并剥离的，可以根据阴极的形状制备同样形状的胶原异形材料。例如，在本发明的优选例中，阴极为钛管时，可以获得中空的胶原管；阴极为类似心脏瓣膜形状时，可以获得类心脏瓣膜的胶原异形材料。

本发明采用改进的EDP技术，以醋酸作为酸性调节剂制备胶原电解液，使用过氧化氢分解作为阴极反应，使用Ti片作为阴极(即工作电极)、Pt片作为阳极(即对电极)，采用水平或垂直放置的方式，制备胶原材料。

本发明中，超纯水又称UP水，电阻率达到18MΩ*cm(25℃)的水，这种水中除了水分子外，几乎没有杂质，没有矿物质微量元素，更没有细菌、病毒、含氯二恶英等有机物。超纯水处理时，既将水中的导电介质几乎完全去除，又将水中不离解的胶体物质、气体及有机物均去除至很低程度的水，通常需要采用预处理、反渗透技术、超纯化处理以及后级处理四大步骤。

本发明中，恒电流沉积是指电流保持不变的电沉积过程，例如本发明的一个优选例中，电沉积反应中电流密度为6.67mA/cm ²。

本发明中，胶原异形材料是指胶原的外形可以按照需要制备成各种不同的形状，例如长方形、圆形、三角形、梯形、空管型。

根据本申请的第三个方面，提供了一种胶原材料在制备高度取向和结晶性胶原纤维的胶原膜中应用。本发明采用改进EDP组装-机械拉伸-离子孵育-化学交联四步骤，获得主要由长程取向的且具有显著D-带特征的胶原纤维组成并且其杨氏模量接近天然肌腱的胶原膜。该胶原膜材料由在电极上制备的短程有序胶原材料进一步改造获得，因而可依据电极形状塑形。也可以根据后续的应用要求使用不同形状的电极，例如在本发明的一个优选例中，所制备的长程有序的胶原膜与天然肌腱性能接近，不仅具有相似的晶型结构，还具有相当的杨氏模量。

一种胶原材料在制备高度取向和结晶性胶原纤维的胶原膜中应用，包括以下步骤：

A1、将胶原材料沿着胶原材料的长度方向拉伸，形成胶原材料Ⅰ；

A2、将含有所述胶原材料Ⅰ、磷酸缓冲液的混合物，孵育后得到大直径胶原纤维；

A3、将所述大直径胶原纤维化学交联后，得到所述高度取向和结晶性胶原纤维的胶原膜；

所述胶原材料选自上述所述的制备方法得到的胶原材料。

可选地，步骤A1中，拉伸的应变程度为Ts，50％≤Ts≤200％。

可选地，步骤A2中，磷酸缓冲液的浓度为0.05M～0.5M。

可选地，步骤A2中，孵育的时间为6h～72h。

可选地，步骤A3中，化学交联包括光交联、戊二醛交联、京尼平交联、多酚交联。

可选地，所述光交联的条件如下：浸泡在0.2mg/mL～3.0mg/mL的核黄素溶液中；紫外光照射下交联1天～3天。

可选地，所述戊二醛交联的条件如下：浸泡在0.1％～1％的戊二醛溶液中，交联10min～2h。

可选地，所述京尼平交联的条件如下：浸泡在质量百分比为0.2％～2.0％的京尼平溶液中，交联8h～14h。

可选地，所述多酚平交联的条件如下：浸泡在质量百分比为0.1％～2.0％的原花青素、单宁酸或者没食子酸的水溶液中，交联8h～14h。

可选地，步骤A1中，将拉伸完毕的胶原膜浸泡在乙醇中，暂时固定取向结构。

可选地，步骤A2中，离子孵育时将胶原膜材料的两端固定，保持胶原膜受到持续的外部作用力而不会收缩。

可选地，所述胶原膜包括长程取向、具有显著D-带特征的胶原纤维。

可选地，所述胶原膜的杨氏模量接近天然肌腱。

根据本申请的第四个方面，提供了一种胶原膜在人工肌腱中的应用。

上述所述的应用得到的胶原膜在人工肌腱中的应用。

根据本申请的一种实施方式，本发明中的胶原膜制备方法，包括以下步骤：

(1)机械拉伸：取短程取向的胶原微纤膜，沿着胶原膜的长度方向拉伸，使胶原膜内部的微纤维沿着受力方向进一步取向，形成高度取向的胶原材料；

(2)离子孵育：将步骤(1)中高度取向的胶原材料置于0.05M～0.5M的PBS缓冲液进行离子孵育，孵育20小时～40小时，诱导内部微纤维结构重排，以形成具有D带特征的结晶态的大直径胶原纤维；

(3)化学交联：通过光交联、戊二醛交联或者京尼平交联。

可选的，步骤(1)中，将拉伸完毕的E-Col胶原膜浸泡在乙醇中，暂时固定取向结构。拉伸的应变程度可以为50％～200％，包括50％与200％。

可选的，步骤(2)中，离子孵育时将胶原膜材料的两端固定，保持胶原膜受到持续的外部作用力而不会收缩，例如，使用胶带将短程有序的胶原膜两端固定在培养皿或者其他可以存放液体的容器中。孵育时间为24小时～36小时。孵育温度使用室温15℃～26℃。

本发明中，PBS是指磷酸缓冲液，可以根据本领域的常规技术获得，例如可以采用以下配方(8g氯化钠，0.2g氯化钾，2.90g十二水磷酸二氢钠和0.2g磷酸二氢钾充分溶解于1000ml水中)。盐溶液浓度太高或者太低都会影响胶原膜纤维直径增加的速度，可选的，盐溶液的浓度为0.05M～1.0M，单位是摩尔/升。也可以根据需要使用浓度为0.1M～0.8M，较好的0.2M～0.5M的盐溶液。

可选的，所述光交联是指，将步骤(2)所得到的高度取向且结晶的胶原膜浸泡在0.2mg/mL～3.0mg/mL的核黄素溶液中，在紫外光照射下交联1天～3天。核黄素溶液以90％v/v乙醇-水为溶剂，浓度为0.5mg/mL～2.0mg/mL，交联时间为20小时～40小时。

可选的，所述戊二醛交联是指，将步骤(2)处理所得到的高度取向且结晶的胶原膜浸泡在0.1％～1％(体积百分比)的戊二醛溶液里，交联10分钟～2小时；随后去除胶原膜中残留的戊二醛组分。戊二醛溶液以0.5％w/v、90％v/v乙醇-水为溶剂，交联时间为30分钟～50分钟。

可选的，所述京尼平交联是指，将步骤(2)处理所得到的高度取向、且结晶的胶原膜浸泡在质量百分比为0.2％～2.0％的京尼平溶液里，交联过夜；随后去除胶原膜中残留的京尼平组分。较好的，京尼平溶液的浓度为0.5％～1.0％，交联时间为8小时～16小时。

可选的，所述多酚交联是指，将步骤(2)处理所得到的高度取向、且结晶的胶原膜浸泡在质量百分比为1.0％～2.0％，pH为8.5的原花青素溶液里，交联过夜；随后去除胶原膜中残留的多酚组分。较好的，原花青素溶液的浓度为1.5％～2.0％，交联时间为12小时。

可选的，去除胶原膜中残留的交联剂组分，例如京尼平或者戊二醛等，可以使用超纯水反复冲洗。例如，使用超纯水冲洗3～5次。

本发明中，超纯水又称UP水，电阻率达到18MΩ*cm(25℃)的水，这种水中除了水分子外，几乎没有杂质，没有矿物质微量元素，更没有细菌、病毒、含氯二恶英等有机物。超纯水处理时，既将水中的导电介质几乎完全去除，又将水中不离解的胶体物质、气体及有机物均去除至很低程度的水，通常需要采用预处理、反渗透技术、超纯化处理以及后级处理四大步骤。

所述的EDP组装(短程有序)是一种外观非常均匀的胶原凝胶膜，在干态和湿态均高度透明，以短程取向的胶原微纤以非共价键连接而成；胶原排列致密；材料外观透明、结构均匀；胶原材料能被溶剂再次溶解，可被循环制备。该胶原凝胶膜能在电极上直接获得，制备完成后能够从电极剥离。

根据本申请的第五个方面，提供了一种胶原溶液在制备人工角膜中的应用。该人工角膜具有高度透明、可缝合、结构可定制(曲率、厚度)的胶原基人工角膜制备技术。该技术分为“设计定制化电极-改进EDP技术组装胶原-化学交联”3步骤。该胶原基人工角膜材料的特征为：以短程有序取向、且致密排列的胶原微纤维组成，透明度在80％以上，宏观结构为可定制弧形结构，厚度依据改进EDP技术中的电化学条件参数进行调控。本发明制作过程，不需要使用复杂的设备，所获得的胶原基人工角膜材料可以用于替代或者修补天然角膜。

一种胶原溶液在制备人工角膜中的应用，包括以下步骤：

B1、获得曲率范围为7.8～8.5的阴极，作为电解池工作电极；

B2、将含有胶原溶液的混合物置于所述电解池中，电化学沉积后，在电极上得到胶原材料；

B3、将所述胶原材料化学交联后，得到人工角膜；

所述胶原溶液选自上述所述的制备方法中的胶原溶液。

可选地，步骤B2中，电化学沉积的条件同上述中的电化学沉积。

可选地，步骤B3中，化学交联的条件同步骤A3中的化学交联。

根据本申请的一种实施方式，所述的方法包括设计定制化电极、改进EDP技术组装胶原和化学交联步骤，获得与角膜形状一致的胶原基人工角膜。

可选的，设计定制化电极，是指选取曲率范围为7.8～8.5的阴极作为工作电极。

可选的，改进EDP技术组装胶原包括：在浓度不高于20mg/mL的胶原醋酸溶液中按照5μL/mL～200μL/mL的浓度加入过氧化氢作为电解液，在电解液中平行安置阳极和阴极，阳极和阴极的距离为0.5cm～3.0cm，进行电沉积反应，时间为10分钟～60分钟，获得在阴极上沉积的胶原凝胶膜。

可选的，阴极与天然角膜曲率匹配。

可选的，改进EDP技术组装胶原过程中加入过氧化氢的浓度为5％～17％(体积百分比)。

可选的，化学交联选自光化学交联、戊二醛交联或者EDC-NHS交联。

可选的，所述的光交联，是将胶原凝胶膜浸泡在1mg/mL的核黄素溶液中，以90％v/v乙醇-水为溶剂，在365nm紫外光照射下交联20小时～30小时；例如，交联24小时，以进一步增强材料的力学性能。

可选的，所述的戊二醛交联，是指将胶原凝胶膜浸泡在0.1％～0.6％w/v戊二醛溶液里，90％v/v乙醇-水为溶剂，交联15分钟～50分钟，随后去除胶原膜中残留的戊二醛组分。较好的，戊二醛溶液的浓度为0.2％w/v～0.5％w/v。去除残留的戊二醛组分可以使用漂洗的方式，例如，使用超纯水反复清洗，去除胶原膜中残留的戊二醛组分。

可选的，所述的EDC-NHS交联，是指将胶原凝胶膜浸泡在EDC/NHS(n(EDC)∶n(NHS)＝2:1)的90％v/v乙醇-水溶液中，EDC的质量浓度为0.5g/L，用MES缓冲剂调pH值至5.5，4℃下交联24h，取出后用去离子水反复冲洗。

相应的，本发明提供了一种新的人工角膜，所述的人工角膜与天然角膜曲率匹配、高度透光、可缝合、结构可定制。可选的，所述的人工角膜通过上述方法制备。

根据本申请的第六个方面，提供了一种人工角膜在角膜修复中的应用。

一种人工角膜在角膜修复中的应用，包括以下步骤：

D1、将人工角膜裁剪；

D2、将裁剪后的人工角膜填充并缝合于角膜缺损部位；

D3、修复至少2周；

所述人工角膜选自上述所述应用得到的人工角膜。

本发明提供了所述的人工角膜的制备方法的应用，使用所述的人工角膜的制备方法制备人工角膜，替代天然角膜或者修补天然角膜。

可选的，所述的人工角膜具备以下特征中的一种或者几种：与角膜曲率匹配，可以按照需要设计厚度，具有优异光学透明度，保留较好的微观形貌，机械强度高，能够耐缝合，具有较好的细胞相容性，有助于提高角膜上皮细胞的黏附、增殖、迁移。

可选的，所述的应用包括以下步骤：

(A)按照需要将权利要求1制备的人工角膜裁剪；

(B)将裁剪后的人工角膜填充并缝合于缺损部位；

(C)修复至少2周。

可选的，人工角膜的直径可根据角膜损伤的面积按需设计，例如不少于6mm，可以是7mm以上。修复时间通常应视损伤情况而确定，例如不少于3～6周，甚至在8周以上。

相对于之前报道的直接针对胶原分子的EDC交联技术(A Simple,Cross-linked Collagen Tissue Substitute for Corneal Implantation，Investigative Ophthalmology&Visual Science,May 2006,Vol.47,No.5，1869-1875)，本发明的胶原分子预先经改进EDP技术组装后形成胶原微纤，再经化学交联，则力学性能好、曲率和厚度可控，制备方法也简便高效。

较之之前的环糊精技术(CN106456833A)：本发明制备过程快速简便、宏观结构可定制、厚度可控、材料中不需要掺入环糊精，避免了后续的眼组织相容性的问题。

根据本申请的第七个方面，提供了一种胶原材料在制备绷带中的应用。该绷带高强度高韧性，在体内能够自行恢复至柔软状态并且动态松弛。

一种胶原材料在制备绷带中的应用，包括以下步骤：

将含有胶原材料的混合物置于盐溶液中，得到绷带；

所述胶原材料选自上述所述的制备方法得到的胶原材料。

可选地，所述盐溶液为含有霍夫曼斯特离子可溶盐的溶液。所述盐溶液为第一盐溶液。

可选地，所述霍夫曼斯特离子选自CO ₃ ^2-、SO ₄ ^2-、S ₂O ₃ ^2-、H ₂PO ₄ ^-、NO ₃ ^-、CH ₃COO ^-、ClO ₄ ^-、F ^-、Cl ^-、Br ^-中的至少一种。

可选地，所述盐溶液的浓度为0.1M～4M。

可选地，混合物置于盐溶液的时间为0.5h～60h。

可选的，该绷带由复合了霍夫曼斯特离子的高强度、高韧性(胶原膜构成，该胶原膜在环境中能从高强度状态逐步恢复柔软状态。高强度高韧性的所述的高强度是指断裂强度不小于2.0MPa或者杨氏模量不小于9.0MPa；所述的高韧性是指韧性值不小于0.5MJ/M ³。

可选的，胶原膜力学状态改变的环境是在溶液中，例如纯水中或者含有盐和(或)酶的体液中，也可以是实施例中的模拟人体体液。在一个优选例中，在含有胶原酶(100U/mL))的37℃的水里，该胶原膜约45h能够完全降解。可选的，所述绷带的厚度为50μm～1000μm；较好的，是300μm～800μm。例如，所述绷带的厚度可以是100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm等。

本发明的胶原绷带的制备方法包括“EDP技术组装和霍夫曼斯特离子浸泡”两个阶段：

配置胶原溶液，通过电化学沉积技术(Electro-deposition EDP)，制备可以从电极剥离的短程取向胶原凝胶膜；

在盐溶液中浸泡8小时～60小时。

盐能够从水溶液中沉淀蛋白质，这种效应被称为霍夫迈斯特(Hofmeister)效应。其原理是盐离子与大分子及其水合壳之间的直接相互作用导致蛋白质的水合水被夺取，从而使蛋白质折叠和沉淀。可以利用Hofmeister系列离子通过增强E-Col网络内的弱相互作用来增强膜的力学性能。

本发明采用“改进EDP技术组装胶原-霍夫曼斯特离子浸泡”两阶段，获得高强高韧胶原膜材料。利用改进EDP技术制备的胶原膜E-Col，主要依赖于一些非共价键作用组装而成，例如氢键以及疏水相互作用。保证了获得的胶原膜E-Col的内部结构具有动态重塑能力(因非共价键作用容易被断裂和重生)。

电化学组装的胶原膜E-Col，当不作任何处理时，其断裂强度为0.13MPa，杨氏模量为0.32MPa，韧性值为0.19MJ/M ³。常规思路是采用化学或者物理交联提高材料的力学性能。当采用0.5％w/v戊二醛化学交联胶原膜时，断裂强度可提高到5.22MPa，杨氏模量提高到11.39MPa，韧性值为1.27MJ/M ³；采用1mg/ml核黄素紫外光交联胶原膜，材料的断裂强度可提高到1.33MPa，杨氏模量提高到1.24MPa，韧性值为0.23MJ/M ³。但与本发明的霍夫曼斯特离子强化技术对比，其力学性能的提高程度有限。更重要的是，因胶原膜内部引入大量的共价键，交联后的胶原E-Col的力学性能不会具有动态恢复能力。使用本发明的制备方法，胶原膜的断裂强度可以达到5.85MPa和以上，最高杨氏模量可以达到16.42MPa和以上，最高韧性值可以达到3.33MJ/M ³和以上。

不同的离子对蛋白质溶解度的影响有显著差异，阴离子比阳离子具有更显著的效果，阴离子自身水合效果(即夺取大分子的水合水)不同。通常可以改变蛋白质溶解度的阴离子有CO ₃ ^2-、SO ₄ ^2-、S ₂O ₃ ^2-、H ₂PO ₄ ^-、NO ₃ ^-、CH ₃COO ^-ClO ₄ ^-、F ^-、Cl ^-、Br ^-、、SCN ^-、I ^-、等。但是并非所有的霍夫曼斯特离子和阴离子都适用于本发明的胶原膜。例如使用NaCl溶液浸泡凝胶膜，凝胶膜保持柔软的状态，无明显的力学增强；用NaI溶液浸泡凝胶膜，凝胶膜则会溶胀；NaSCN溶液则会直接溶解凝胶膜，综合考虑，选择CO ₃ ^2-或者SO ₄ ^2-的效果会更好，效果更明显。

可选的，使用第二盐溶液代替第一盐溶液，第二盐溶液选自含有CO ₃ ^2-或者SO ₄ ^2-的可溶盐的溶液。例如，选自硫酸铵、硫酸钠或者碳酸钠中的一种或者几种。

根据本申请的第八个方面，提供了一种绷带。

一种绷带，所述绷带包括短程取向的胶原膜；

所述绷带选自上述所述应用得到的绷带。

可选地，所述胶原膜能够自行恢复柔软状态并且动态松弛。

可选地，所述胶原膜的断裂强度为2.0MPa～8MPa。

可选地，所述胶原膜的杨氏模量为9.0MPa～18.0MPa。

可选地，所述胶原膜的韧性值为0.5MJ/M ³～5.5MJ/M ³。

可选地，所述绷带的厚度为50μm～1000μm。

根据本申请的第九个方面，提供了一种绷带在动脉环缩绷带中的应用。

上述所述的绷带在动脉环缩绷带中的应用。

可选地，包括以下步骤：

E1、确定动脉进行环收缩的位置；

E2、将绷带绕待动脉进行环收缩的位置绕行，打一个滑动水凝胶结；

E3、调整环收缩程度，去除多余的绷带。

本发明制备的胶原绷带在体内或者模拟体液SBF能够自行溶解并且逐步松弛。在一些干预手术中(例如肺动脉减压手术)，动脉被绑上一条医用绷带以临时限制血流，保护下游脆弱部位免受高血压的侵害。手术后，绷带短期内应能提供持续的收缩血管的能力，但随着时间的推移，心脏功能逐渐恢复，绷带应该逐步松弛，以允许正常的血流流动(时间取决于临床细节)。因此，这种医用带的理想材料应该具有在体内环境中动态松弛的能力。本发明的E-Col膜可以满足这种力学性能的要求，因为当本发明的E-Col膜至于体内，盐可以从胶原纤维的网络中逐步渗出时，E-Col的力学强度将逐渐降低，从而减弱对植入部位的环缩效果。

模拟体液SBF，是模拟人体体液组分和酸碱度的一种液体，在本发明的一个优选例中，使用了广州雅至生物科技有限公司的产品，货号：PH1820。

可选的，所述绷带用作动脉环缩绷带时的方法如下：

确定动脉进行环收缩的位置；将本发明的胶原绷带绕待动脉进行环收缩的位置绕行，打一个滑动水凝胶结；调整环收缩程度，去除多余的绷带。滑动水凝胶结的打结方法可以是：将水凝胶带的一端作为轴线，另一端围绕轴线打一外科结，使轴线穿过外科结的中心形成基本结，然后收紧该结即可。

本发明使用第一盐溶液离子浸泡方法，通过强烈水合作用，剥夺胶原内部的结合水，从而在胶原内部营造出疏水的微环境，能增强胶原微纤维之间的H键和疏水相互作用(水会干扰H键和疏水相互作用)，藉此大幅度提高了胶原膜的机械强度和韧性。实验表明，本发明的强韧胶原材料可以维持固定的形状，提起1公斤的重物并且在打结拉扯状态下不断裂撕破。在体内环境中，伴随着霍夫曼斯特盐的溶出，胶原膜的力学性能会下降，失去对血流的限制作用，并最终在体内被胶原酶降解。因此，可用做体内“动脉环缩”绷带，提供临时的限制血液流速的作用。

本申请能产生的有益效果包括：

(1)由于醋酸是一种弱酸，可提供一定的缓冲能力，使得阴极附近的pH值能够接近胶原的等电点，从而在电极表面直接得到胶原材料。

(2)可通过改变阴极电极的形状，很方便地对胶原材料进行各种异形结构塑形。

(3)阴极反应为过氧化氢分解，不产生气泡，因此有利于获得外观非常均匀致密的胶原材料，尤其是在使用水平电极的情况下，还可以解决因重力造成的胶原膜上薄下厚的情况。

(4)电极之间的距离可以在厘米级别，方便操作。

(5)制备时间短10-15min。

(6)该胶原材料的特征为：以短程取向的非晶态的胶原微纤组成；胶原排列致密；胶原材料外观透明、结构均匀，有利于获得更好的力学性能和光学性能；具有塑性形变能力；胶原微纤维之间由非共价键连接，因此可以被溶剂再次溶解，并能重新利用EDP技术制备，也即可被循环制备。

(7)机械拉伸获得高取向，形成长程取向的胶原微纤。

(8)在拉伸状态下进行离子孵育，获得长程取向且结晶的胶原材料。

(9)改进EDP技术使得胶原材料依据电极形状塑形，而不仅仅限于胶原束。

(10)本发明的胶原材料具有D带特征，外观、微观形貌、杨氏模量和晶型结构等特征均与天然肌腱高度相仿。

(11)本发明的制备方法操作简便，不需要复杂的仪器设备，能够快捷有效的制备与天然肌腱或者韧带高度相似的胶原膜材料。

附图说明

图1是EDP技术组装过程示意图。其中，电极的安装方式有两种：一种是将两个电极垂直平行放置在电解池中如图1(a)，另一种是将两个电极水平平行放置在电解池中如图1(b)。

图2是胶原凝胶膜。其中，阴极上出现的一层胶原凝胶膜如图2(a)所示，图2(b)展示E-Col胶原材料外观非常均匀，在干态和湿态均高度透明。

图3是胶原的光学性能测试结果。其中，E-Col表现出较高的光学透明性，在450nm到780nm范围内(可见光范围)光学透过率接近90％图3(a)，同时胶原凝胶膜的雾度也很低，在可见光范围内仅为10％图3(b)。

图4是胶原的微观形貌表征。可见，E-Col膜具有致密的组织结构，密度为0.88g/cm ³，表面和断面均有取向排列的纳米纤维。相比之下，溶液组装的S-Col膜内部是一个松散的网络，密度为0.45g/cm ³，其中随机聚集了较粗的、直径约几微米纤维图4(a)。图4(b)的TEM图像显示，E-Col由较细的微纤维紧密组织而成，高倍TEM揭示其直径约为10nm，没有明显的胶原纤维特征D带。与之相比，S-Col中存在微米级尺寸的疏松排列的纤维，高倍TEM图像显示S-Col膜中的微米级纤维是由直径为50nm的原纤维组装构成，原纤维呈明显的I型胶原的D带特征，约为64.5nm。

图5是取向性表征结果图。其中，图5(a)的偏振光显微镜图像所示：S-Col薄膜无明显的光学双折射现象，表现为各向同性结构；而E-Col凝胶薄膜中观察到部分区域的光学双折射现象，表明部分区域存在取向排列结构。图5(b)的SAXS数据显示，S-Col的2D SAXS图形显示出一个强度几乎一致的环，说明其为各向同性结构；而E-Col的2D SAXS图形表现出明显的拉长的环，这表明出现了各向异性排列的结构。图5(c)左图的1D-SAXS谱线显示，当q值的范围在0.2-1.2nm ^-1区域内时，1D-SAXS谱线中S-Col出现了明显的D带特征散射峰(布拉格方程计算的D带约为62.7nm)，而与之前相比，E-Col并没有出现明显的D带特征峰，其为非晶态结构。图5(c)右图所示的1D-SAXS图谱中，当q值位于0.05nm ^-1到0.4nm ^-1区域内时，与S-Col相比，E-Col膜向更高的q值偏移，这表明纤维相排列的收紧。

图6是EDP胶原材料的动静态力学性能表征结果图。其中，拉伸实施例1所得胶原膜，会产生明显的塑性变形，卸载后形状不可逆如图6(a)。静态机械测试显示，拉伸速率设定在10mm/min，得到胶原膜的应力-应变曲线；E-Col凝胶膜的杨氏模量为0.32±0.11MPa，变形较大，断裂伸长率在220.41±5.07％，拉伸强度在0.13±0.03MPa。E-Col凝胶膜在很小的区域内就发生了应力屈服，这表明内部仅存在较弱的交联机制如图6(b)。动态力学测试显示，E-Col膜显示出较大的变形，加载和卸载循环之间存在明显的滞后，呈现粘弹性的力学特性如图6(c)。

图7是胶原膜可逆性测试结果。将实施例1制备的胶原膜分别浸泡在pH值为3.5的0.1M的醋酸或0.1M尿素溶液中，在不到10分钟的时间里，E-Col迅速溶解。与之对照的是S-Col持续保持稳定。这表明E-Col膜中分子间结合主要依赖于一些弱分子相互作用，经过醋酸溶解后的溶液能够被再次电沉积以获得E-Col材料。

图8是胶原膜的可控制备。可见，通过改变恒电流密度以及沉积时间来控制胶原膜的厚度。控制时间0秒到3000秒条件下，电流密度为2.5mA/cm ²，胶原膜的厚度范围可从0μm到400μm变化；电流密度为5mA/cm ²，胶原膜的厚度范围可从0μm到450μm变化；电流密度为10mA/cm ²，胶原膜的厚度范围可从0μm到550μm变化。

图9是不同宏观几何形状的胶原材料成型图。可见，改变阴极电极的形状，使用钛管或者一端具有瓣膜形状的不锈钢异形柱作为阴极制备各种异形结构材料。阴极为钛管时，可以获得中空的胶原管如图9(a)；阴极为类似心脏瓣膜形状时，可以获得类心脏瓣膜的胶原异形材料如图9(b)。

图10是本发明具有高度取向和结晶性胶原纤维结构的胶原膜制备过程示意图。其中主要包括对E-Col进行机械拉伸-离子孵育-化学交联的步骤。

图11是不同拉力下及对照的胶原材料外观比较图。a为各组胶原膜的外观。b为偏振光显微镜的观察结果，可以看到：S-Col对照组薄膜无明显的光学双折射现象，表现为各向同性结构；而未拉伸变形的E-Col薄膜中部分区域出现了光学双折射现象，表明部分区域存在有序结构；当E-Col被拉伸到更大的应变程度时，E-Col的整个区域都可以观察到明显的光学双折射现象，且当变形程度进一步增大到200％时，双折射颜色更为鲜艳，表明E-Col内高度取向结构的形成。c的TEM图像表明，S-Col对照组薄膜具有松散的各向同性结构(红色圆圈表示垂直于横断面的原纤维)，而通过力学拉伸可以显著提升E-Col薄膜的致密程度和取向程度，且力学拉伸诱导的形变越大，内部微纤维排列越致密且取向度越高。d的2DSAXS图谱显示，S-Col对照组薄膜的2D SAXS显示出一个强度几乎一致的环，这与其内部各向同性的结构相一致；而E-Col的2DSAXS图形表现出明显的拉长的环，证明各向异性排列的纳米纤维结构的出现。

图12是E-Col薄膜拉伸取向程度测试结果图。a是方位积分强度分布曲线。结果表明，随着应变程度的增加，E-Col薄膜的方位积分强度分布曲线逐渐变窄。赫尔曼取向参数(f _c)是描述取向度的一个定量指标，它可以由方位积分强度分布曲线计算得到。 b显示，S-Col薄膜对照组的取向度几乎为0(f _c＝0.02)，而未拉伸的E-Col薄膜，具有低程度的取向(f _c＝0.15)。随着E-Col薄膜拉伸应变的提升，其赫尔曼取向参数从较低的f _c＝0.15逐渐增加到f _c＝0.93(当应变为200％时)。这些结果表明，对E-Col薄膜的拉伸将诱导沿应变方向的取向结构的产生。

图13是E-Col薄膜与天然肌腱的宏观和微观结构比较图。其中，a和c是E-Col薄膜的宏观和微观图像，b和d是E-Col薄膜的宏观和微观图像。如a所示，最初高度透明的E-Col经过机械拉伸和离子孵育以后，变为乳白色不透明，表面呈现毫米级取向条纹状，与天然肌腱相似(b)，可能是由于高阶层次结构(即大直径纤维)的形成引起了光学透明度的变化。(c-d)显示了低倍和高倍的SEM图像，可以看到PBS孵育后，E-Col呈现出更高阶的层次结构，即直径为5-10μm的致密排列的纤维。

图14是E-Col薄膜取向度和晶型表征图。从a的2D SAXS谱图中可看出，经200％预拉伸并经离子孵育后，E-Col仍具有明显拉伸的环，这表明各向异性排列结构在离子孵育后仍然保持，其f _c经计算约为0.52-0.53。且在2D SAXS谱图中同时出现明显的D带衍射环，说明经过离子孵育，胶原分子进行了有序排列。b所示天然肌腱的2D SAXS图谱也显示了显著的D带衍射环，其f _c经计算约为0.69-0.72。c中的1DSAXS谱图可以看出，E-Col经离子孵育后产生了与天然肌腱相似的晶型结构。

图15是E-Col薄膜的静态力学性能表征图。在干态条件下进行测试，a和b分别展示了材料的断裂应力和弹性模量。E-Col材料的断裂应力约为108±6MPa，略低于天然肌腱的断裂应力(128±14MPa)；而E-Col材料的杨氏模量(0.795±0.060GPa)基本达到了天然肌腱的水平(0.890±0.118GPa)。

图16是EDP技术组装胶原材料及其制备方法的示意图。其中，(a)是在固定曲率的电极上制备的胶原凝胶膜，可以用作人工角膜，(b)显示随着制备参数的调整，胶原凝胶膜呈现不同的厚度。

图17是EDP胶原材料化学交联后性能测试结果图。(a)和(b)中，与溶液组装的胶原膜S-Col相比，改进电化学技术组装的E-Col胶原凝胶膜材料，在波长380nm到800nm之间呈现出80％-90％的高透光率，且随波长变长透光率增加(正常人角膜在430nm波长处的透光率约为80％，在500nm以上的波长可接近100％)，而采用不同方法交联E-Col凝胶材料，基本不会改变E-Col的光学透明度，明显优于溶液方法组装的S-Col凝胶材料。(c)通过控制电流强度及施加时间处理固定曲率的胶原膜E-Col，得到凝胶态厚度约为200、300、400和500μm的E-Col。结果显示，厚度增加基本不影响材料的高透光性和低雾度。

图18是EDP胶原材料化学交联后的微观形貌表征图。将实施例28制备的S-Col、E-Col-UV、E-Col-GA和E-Col胶原膜进行冷冻干燥，然后通过扫描电子显微镜(SEM,S-4800,Hitachi)对冷冻干燥薄膜的微观形貌进行分析。S-Col膜呈现乳白色的半透明状，表面呈现较粗的纤维状结构，断面呈现纤维疏松堆叠的形貌。E-Col凝胶材料高度透明，表面形貌表明其由更小尺寸的纤维取向的排列而成，断面呈现紧密堆砌的层状结构。在交联后，表面仍能较好的保留取向结构，从断面结构看，交联在一定程度上让结构变得更加致密。对结构上的观察进一步佐证了，E-Col在交联后由于能保留较好的微观形貌，而在宏观上也显示出优异的光学性能。

图19是EDP胶原材料化学交联后的力学性能表征图。采用同实施例28相同的方法制备E-Col-UV、E-Col-GA和E-Col胶原膜。将其裁剪成长度30mm，宽度10mm的矩形样条，采用Electro-Force3200型生物动力试验仪比较胶原膜在室温下的力学性能。(a)-(b)中，拉伸速率设定在10mm/min，得到胶原膜的应力-应变曲线，交联后的E-Col-UV和E-Col-GA凝胶膜相比于E-Col凝胶膜的强度明显提升，而断裂伸长率有所下降。虽然交联后断裂应变有所下降，但E-Col-UV(1.33±0.19MPa)和E-Col-GA(5.22±0.73MPa)的断裂强度有着明显提升，推测E-Col-GA由于存在更高的交联密度，交联后的力学强度更高，表明E-Col-GA在手术过程中和术后修复期间能够承受较高的外界剪切和拉伸，以保持材料和患处的力学稳定。(c)中进行了材料缝合强度的力学测试，结果显示E-Col-GA相比于E-Col-UV具有更高的耐缝合性能。(d)定量的描述了材料的耐缝合阻力，E-Col-GA(1.75±0.3N)且显着高于E-Col-UV(0.33±0.13N)，说明E-Col-GA的缝合阻力可能足够坚固，可以使用穿透缝合线进行植入。

图20是人角膜上皮细胞(HCECs)在E-Col-GA膜上的细胞黏附与增殖测试结果图。选择E-Col-GA凝胶膜用于细胞实验。图20(a)显示，在E-Col-GA膜上的人角膜上皮细胞(HCECs)能够较好的黏附在其表面，且呈现铺展的状态；接种在E-Col-GA膜和组织培养孔板上的HCECs在1、3和5天均表现持续的增殖，且在5天内的考察期间内并没有发现明显的死细胞。图20(b)表明E-Col-GA膜具备较好的细胞相容性。定量的CCK-8的细胞代谢活性也证实了这一观察结果，接种在E-Col-GA膜和组织培养孔板对照上的HCECs细胞在接种后1、3和5天均表现出高活力(>90％)，如图20(c)所示，这些结果证实，E-Col-GA膜具备优异的细胞相容性，可以支持人角膜上皮细胞(HCECs)的黏附和增殖。

图21是细胞划痕结果及其统计图。图21(a)显示，接种在E-Col-GA凝胶膜表面的上皮细胞可以在不到36小时内完成迁移以填满划痕区域(宽度约500μm)，与之相比，上皮细胞在孔板底部的迁移速率更慢，在36小时仍然没有迁移填满划痕区域。为了量化向划痕区域的迁移，在不同时间点将细胞迁移到划痕区域的面积占初始的划痕区域面积百分比进行了计算。结果表明，在产生划痕后12、24和36小时，细胞在E-Col-GA凝胶膜上的细胞迁移完成率显着高于对照(组织培养板)的相对细胞迁移完成 率，如图21(b)所示，在36小时，E-Col-GA凝胶膜的细胞迁移完成率基本已达到100％，比对照(孔板)高33％。这表明E-Col-GA膜有利于人角膜上皮细胞(HCECs)的细胞迁移。

图22是E-Col-GA膜在体内的角膜板层移植修复结果图。其中，显示了正常角膜、构建缺损直径(7mm、深度250μm)后角膜以及E-Col-GA移植后角膜的示意图及手术中的实物照片图片。从实物图片可以观察到E-Col-GA可以缝合于缺损部位，同时呈现出高度透明的性状。

图23为术后裂隙灯活组织镜检查结果图。在术后1周，2周，4周，6周和8周时间点，采用裂隙灯在兔子全身麻醉下进行角膜组织无损观察。如图23显示，无材料植入空白组在术后1周后会出现明显的水肿现象，而导致角膜的一定程度的浊化不透明表现，但随着时间延长会逐步消退，再次恢复透明的形态。但在8周的观察期结束后，仍然能够观察到明显的缺损边界(白色箭头标识)。与之相比，实验组(E-Col-GA)和阳性对照组(商业的猪角膜脱细胞基质膜)，在材料植入后首先会出现一定程度的免疫反应，周围会有部分细微血管出现，同时组织也会有轻微的水肿现象出现，属于材料植入角膜缺损的正常免疫反应。但随时间的延长，周围刺激形成的血管会逐步消退。其中，图23(a)表明上皮细胞在不同组别上都有明显的迁移发生(荧光素将上皮缺损染成绿色)，但上皮化的速率有所差异，空白对照组由于角膜上皮细胞是沿着缺损的基质层表面生长，因而迁移最快。图23(b)显示实验组(E-Col-GA)表现出与阳性对照组(猪角膜脱细胞基质膜)相当甚至更快的角膜上皮化速率，在术后4周基本已经完全上皮化。图23(c)利用软件Image J定量计算植入后血管化区域的面积占比，可以观察到实验组和阳性对照组在植入后2周内出现明显的血管，但实验组相对于阳性组的血管形成的区域较小，且在植入两周后，两组别初始形成的血管逐步消退。植入6周后，实验组初始形成的血管已完全退去，而阳性对照组仍有部分未退去的血管。此外，在植入8周后，可以观察到实验组的角膜基本上完全透明；而阳性对照组则呈现一定程度的浊化现象，还尚未恢复角膜的正常透明度，推测与植入后显著的免疫反应有关。而相比于空白对照组，两个植入组在8周的修复期完成后都已观察不到明显的缺损边界。

图24是术后光学相干断层扫描检查图。图24(a)是不同组别在手术后0到8周的缺损处断层图像。无材料植入组，在术后1周出现了明显的水肿情况，在术后2周基本上水肿已经逐步消退，但仍然能观察明显的角膜基质层的缺损。且随着时间的延长，在4周时虽然已经可以观察到完整的上皮形成，但即便到了8周，缺损处的角膜基质层厚度基本无法恢复到正常的水平(如图中白色箭头所示)。而与之相比，实验组和阳性对照组在术后一天植入后，就基本完全恢复了正常角膜的厚度。在术后一天后，可以看到材料与基质层的界面(如图中橙色箭头所示)，而在1周后，材料与基质层的界面已经逐渐模糊(如图中“红色”箭头所示)，表明材料与自体基质组织的融合。此外在材料和自体组织融合的同时，可以看到上皮化的逐步形成，在植入8周后能观察到完整的上皮化组织的形成(图中白色箭头所示)，而红色箭头所示区域也表明，材料和自体基质层的基本融合。图24(b)-(c)中可以观察到兔子的正常角膜厚度约在550μm。在构建缺损后，角膜厚度出现明显的下降，厚度测量显示缺损后的角膜厚度约在200μm附近。在术后8周后，无材料植入组的厚度又一定程度的生长。与之相比，实验组和阳性对照组，在植入八周后基本已经恢复到了正常角膜的厚度。

图25是E-Col膜基于Hofmeister效应的力学增强现象测试图。图25(a)中，将E-Col膜和S-Col膜裁剪成长度30mm，宽度10mm的矩形样条，然后将其浸泡在(NH ₄) ₂SO ₄(2mol/L)溶液里24h。图25(b)中，E-Col胶原膜的网络在能够在经典的霍夫迈斯特盐——硫酸铵的刺激下，出现明显的硬化现象，凝胶膜力学性能得到显著增强。图25(c)-(d)展示，用(NH ₄) ₂SO ₄(2M，24h)处理E-Col网络后，透明E-Col凝胶膜可以承受1千克的负荷，同时保持网络的柔韧性，这种膜可以打结而不发生破裂。相比之下，S-Col经过同样的方法处理后强化效果较小，处理后的膜不能承受500g的负荷，且发生脆性断裂。图25(e)展示，E-Col凝胶膜在不同的霍夫曼斯特盐中浸泡24小时候材料的状态。

图26是E-Col膜基于Hofmeister效应的力学性能定量表征结果图。将胶原凝胶薄膜在不同浓度的硫酸铵溶液(1M、2M、2.5M、4M)中室温浸泡12h，以强化疏水和H键相互作用。采用Electro-Force3200型生物动力试验仪，研究了胶原膜在室温下的力学性能。在10mm/min的应变速率下，使用夹具拉伸样品。利用应力应变曲线初始线性区域的斜率计算了试样的杨氏模量(兆帕；MPa)。采用拉伸应力应变曲线积分面积(兆焦每立方米；MJ/m ³)计算试样的韧性。图26(a)中的定性的应力应变曲线显示，(NH ₄) ₂SO ₄处理后的E-Col凝胶膜的力学性能强化效果显著依赖于(NH ₄) ₂SO ₄浓度。相同的(NH ₄) ₂SO ₄处理对S-Col凝胶膜的强化效果要小得多。图26(b)总结了对杨氏模量的影响：当两种网络都通过4M(NH ₄) ₂SO ₄处理得到加强时，E-Col的模量增加了50倍，而S-Col的模量仅增加了6倍。图26(c)中，4M(NH ₄) ₂SO ₄处理使E-Col膜增韧16倍，但这种处理对S-Col膜的韧性增强基本上没有贡献。上述的结果表明，E-Col网络在经过(NH ₄) ₂SO ₄处理后相比于S-Col网络的韧性出现了明显的提升，表明了两种不同组装结构的胶原凝胶膜对Hofmeister效应的力学响应性差异。

图27是E-Col膜基于Hofmeister效应的力学性能定量表征结果图。将凝胶薄膜在不同浓度的碳酸钠Na ₂CO ₃溶液(1M、2M、 2.5M)中室温浸泡12h。然后采用Electro-Force3200型生物动力试验仪，研究了水凝胶在室温下的拉伸性能。拉伸速率设定在10mm/min，得到胶原膜的应力-应变曲线。如图27(a)所示，在不同浓度Na ₂CO ₃处理后E-Col凝胶膜的应力-应变曲线表明，Na ₂CO ₃作为一种强水合能力的Hofmeister盐也能增强E-Col网络。且效果随着盐浓度的增加而增强。如图27(b)所示，E-Col凝胶膜经过2MNa ₂CO ₃处理24小时后，表现出明显的强化效果，但将强化的E-Col凝胶膜在SBF(模拟体液)处理24小时后，又会逐步软化回到初始的柔软状态，表明Na ₂CO ₃强化E-Col网络是一个可逆的过程，随着Hofmeister盐离子的浸出将恢复到柔软状态。这表明，E-Col膜基于Hofmeister效应的力学增强效应具有可逆性。

图28是力学强化的E-Col膜用作体内动脉环缩的测试图。以2个月大的新西兰白兔为实验对象，其心脏及手术位置如图28(a)所示。使用被Na ₂CO ₃增强的E-Col膜作为手术束带来减少肺动脉的直径，如图28(b)所示。图28(c)的心脏彩色多普勒超声图像显示，手术束带使肺动脉直径从术前的直径Φ＝0.63cm减少到术后直径Φ ₀＝0.43cm，减少约68％，证实了由Na ₂CO ₃强化的E-Col能提供较高的力学强度以显著收缩肺动脉直径。术后第1天肺动脉直径恢复至正常直径的75％(Φ ₁＝0.48cm)，3天后恢复到术前肺动脉的正常直径。此外，对动脉血管进行多普勒超声检查，其血流速度和压力梯度如图29所示。结果显示血流速度从术前的119cm/s降低到术后的93.1cm/s，压力梯度从术前的6mmHg显著降低到术后的3mmHg，表明在动脉周围植入的强化E-Col带可以显著收缩肺动脉以达到短期限制血液流速和降低血流压力的效果。

具体实施方式

实施例1：胶原材料制备例I

(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(M _Wcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白粘稠液体。

(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢80μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。

(3)选取钛片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。

(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm ²，电压变化范围在0.22V/cm ²～1.67V/cm ²，沉积时间800秒，发生的电极半反应如下所示。

阳极：2H ₂O-4e ^-→4H ⁺+O ₂

阴极：4H ₂O+4e ^-→4OH ^-+2H ₂。

实验结束后在阴极上出现一层胶原凝胶膜，如图2(a)所示。用超纯水多次清洗带胶原水凝胶膜的阴极，然后从电极上剥离胶原材料E-Col。水平电极和竖直电极均能制备胶原材料，但发现竖直电极制备的材料会因重力原因上薄下厚，采用水平电极可避免此情况。E-Col胶原材料外观非常均匀，在干态和湿态均高度透明，如图2(b)所示。

实施例2：胶原材料制备例Ⅱ

(1)胶原溶液的配置：准确称取800mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(M _Wcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得20mg/ml的胶原蛋白粘稠液体。

(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢160μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。

(3)选取钛片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为20mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。

(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm ²，电压变化范围在0.22V/cm ²～1.67V/cm ²，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。

实施例3：胶原材料制备例Ⅲ

(1)胶原溶液的配置：准确称取40mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(M _Wcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h 以去除小分子杂质。透析后获得1mg/ml的胶原蛋白液体。

(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢50μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。

(3)选取钛片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为1mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。

(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm ²，电压变化范围在0.22V/cm ²～1.67V/cm ²，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。

实施例4：胶原材料制备例Ⅳ

(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为2.0。将其装入透析袋(M _Wcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和200ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。

(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢80μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。

(3)选取钛片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。

(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm ²，电压变化范围在0.22V/cm ²～1.67V/cm ²，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。

实施例5：胶原材料制备例Ⅴ

(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为4.0。将其装入透析袋(M _Wcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和20μl冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。

(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢80μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。

(3)选取钛片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。

(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm ²，电压变化范围在0.22V/cm ²～1.67V/cm ²，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。

实施例6：胶原材料制备例Ⅵ

(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(M _Wcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。

(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢50μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。

(3)选取钛片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。

(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm ²，电压变化范围在0.22V/cm ²～1.67V/cm ²，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。

实施例7：胶原材料制备例Ⅶ

(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(M _Wcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h 以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。

(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。

(3)选取钛片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。

(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm ²，电压变化范围在0.22V/cm ²～1.67V/cm ²，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。

实施例8：胶原材料制备例Ⅷ

(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(M _Wcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。

(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。

(3)选取铂片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。

(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm ²，电压变化范围在0.22V/cm ²～1.67V/cm ²，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。

实施例9：胶原材料制备例Ⅸ

(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(M _Wcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。

(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。

(3)选取Pt片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在0.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。

(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm ²，电压变化范围在0.22V/cm ²～1.67V/cm ²，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。

实施例10：胶原材料制备例Ⅹ

(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(M _Wcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。

(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。

(3)选取Pt片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在3.0cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。

(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm ²，电压变化范围在0.22V/cm ²～1.67V/cm ²，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。

实施例11：胶原材料制备例Ⅺ

(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(M _Wcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h 以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。

(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。

(3)选取Pt片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在3.0cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。

(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm ²，电压变化范围在0.22V/cm ²～1.67V/cm ²，沉积时间500秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。

实施例12：胶原材料制备例Ⅻ

(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(M _Wcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。

(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。

(3)选取Pt片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在3.0cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。

(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm ²，电压变化范围在0.22V/cm ²～1.67V/cm ²，沉积时间3000秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。

实施例13：EDP胶原材料E-Col的理化性能表征

采用同实施例1相同的方法制备E-Col，通过控制电流强度及施加时间，得到凝胶态厚度约为400μm的E-Col。为了比较，透析后的胶原蛋白溶液同时使用溶液法制备成胶原膜S-Col，用0.5M NaOH将酸性胶原蛋白溶液(5mg/mL；pH＝3.5)调节到中性pH＝7.2，然后浇铸在圆形薄膜培养皿中(单位面积胶原含量与EDP组装的胶原单位面积质量相同)，在37℃下孵育12小时以完全凝胶化，随后将凝胶在室温下脱水48小时，形成厚度约400μm的乳白色半透明凝胶膜。

(1)光学性能测试

将上述得到的S-Col和E-Col凝胶态薄膜在超纯水中浸泡1小时，以达到饱和含水量，裁剪成固定大小的尺寸方片置于比色皿内，利用紫外可见光分光光度计(Lambda 950)检测其在可见光波长范围(380nm到800nm)范围内的透光率(％)及雾度(％)(测得数值需扣除比色皿的背景)。E-Col表现出较高的光学透明性，在450nm到780nm范围内(可见光范围)光学透过率接近90％，同时胶原凝胶膜的雾度也很低，在可见光范围内仅为10％。如图3所示。

(2)微观形貌表征

在扫描电子显微镜(SEM,S-4800,Hitachi)上进行了微观形貌分析。采用透射电镜(TEM,JEM-2100,JEOL)观察其内部超微结构。首先分别先将上述得到的S-Col和E-Col凝胶态薄膜材料使用一系列分级的乙醇脱水，然后嵌入Eponate12树脂(Ted Pella,Redding,CA)。将60-90nm的薄片置于裸露的铜栅格上，然后用醋酸铀酰和铅染色。图像在200kV的加速电压下拍摄。图4为不同方法所得到的胶原膜的SEM的表面和断面图像。图4(a)显示，E-Col膜具有致密的组织结构(密度为0.88g/cm ³)，表面和断面均有取向排列的纳米纤维。相比之下，溶液组装的S-Col膜内部是一个松散的网络(密度为0.45g/cm ³)，其中随机聚集了较粗的纤维(直径约几微米)。

图4(b)的TEM图像显示，E-Col由较细的微纤维紧密组织而成，高倍TEM揭示其直径约为10nm，没有明显的胶原纤维特征D带。与之相比，S-Col中存在微米级尺寸的疏松排列的纤维，高倍TEM图像显示S-Col膜中的微米级纤维是由直径为50nm的原纤维组装构成，原纤维呈明显的I型胶原的D带特征(约为64.5nm)。

(3)取向性表征

分别通过偏振光显微镜和小角x射线散射(SAXS)考察E-Col的取向结构。

小角x射线散射(SAXS)实验在上海同步辐射装置的BL19U2SAXS束线上进行。散射数据是在样品到探测器的距离为1900mm处用x射线束照明获得的。对样品进行60秒的测量，获得散射信号。2D SAXS数据平均成一维散射强度曲线与q，背景设置为一个多项式函数，通过每个SAXS曲线的散射最小值。利用公式(I)和(II)计算Herman取向因子(f)量化胶原网络的对齐 程度：

其中φ为方位角，I(φ)为减去背景强度后随方位角的1D强度分布。平均cos2φ通过沿φ积分特定2θ衍射峰的强度计算，使用上述方程。各向同性材料f _c＝0，和对理想面向单向地材料,f _c＝1。

首先，如图5(a)的偏振光显微镜POM图像所示：S-Col薄膜无明显的光学双折射现象，表现为各向同性结构；而E-Col凝胶薄膜中观察到部分区域的光学双折射现象，表明部分区域存在取向排列结构。图5(b)的SAXS数据显示，S-Col的2D SAXS图形显示出一个强度几乎一致的环，说明其为各向同性结构；而E-Col的2D SAXS图形表现出明显的拉长的环，这表明出现了各向异性排列的结构。图5(c)左图的1D-SAXS谱线显示，当q值的范围在0.2-1.2nm ^-1区域内时，1D-SAXS谱线中S-Col出现了明显的D带特征散射峰(布拉格方程计算的D带约为62.7nm)，而与之前相比，E-Col并没有出现明显的D带特征峰，其为非晶态结构。图5(c)右图所示的1D-SAXS图谱中，当q值位于0.05nm ^-1到0.4nm ^-1区域内时，与S-Col相比，E-Col膜向更高的q值偏移，这表明纤维相排列的收紧。

实施例14：EDP胶原材料的动静态力学性能表征

如实施例1所述的胶原膜，将其裁剪成长度30mm，宽度10mm的矩形样条。将其拉伸，会产生明显的塑性变形，卸载后形状不可逆，如图6(a)所示。采用Electro-Force3200型生物动力试验仪，研究了水凝胶在室温下的静态和动态拉伸性能。

对于静态机械测试，拉伸速率设定在10mm/min，得到胶原膜的应力-应变曲线。E-Col凝胶膜的杨氏模量为0.32±0.11MPa，变形较大，断裂伸长率在220.41±5.07％，拉伸强度在0.13±0.03MPa。E-Col凝胶膜在很小的区域内就发生了应力屈服，这表明内部仅存在较弱的交联机制(即非共价键相互作用)，如图6(b)所示。

对于动态力学测试，E-Col薄膜的加卸载过程设定在0.001N-0.04N之间。设定拉伸速率为0.2N min ^-1，循环10次得到胶原膜的动态循环拉伸曲线。E-Col膜显示出较大的变形，加载和卸载循环之间存在明显的滞后，呈现粘弹性的力学特性，如图6(c)所示。

实施例15：EDP胶原材料的可逆性

采用实施例1制备的胶原膜，将其分别浸泡在pH值为3.5的0.1M的醋酸或0.1M尿素(一种强烈的氢键屏蔽剂)溶液中，在不到10分钟的时间里，E-Col就迅速溶解，如图7所示。与之对照的是S-Col持续保持稳定。这表明E-Col膜中分子间结合主要依赖于一些弱分子相互作用，例如氢键以及疏水相互作用。E-Col经过醋酸溶解后的溶液，能够被再次电沉积以获得E-Col材料。

实施例16：E-Col膜的可控制备

以实施例1的制备方法为基础，阴极钛片尺寸减小为1cm x 1cm，改变恒电流密度(2.5mA/cm ²、5mA/cm ²和10mA/cm ²)以及沉积时间(500，1000，2000，3000s)，其它条件不变，得到不同厚度的胶原膜。

通过测量湿态条件下样品厚度可得到厚度随恒电流密度及沉积时间的关系。如图8所示，可通过改变恒电流密度以及沉积时间来控制胶原膜的厚度。

控制时间0秒到3000秒条件下，电流密度为2.5mA/cm ²，胶原膜的厚度范围可从0μm到400μm变化；

电流密度为5mA/cm ²，胶原膜的厚度范围可从0μm到450μm变化；

电流密度为10mA/cm ²，胶原膜的厚度范围可从0μm到550μm变化。

实施例17：不同宏观几何形状的胶原材料成型

为了证明改进EDP技术的通用性，可以产生各种形状的宏观胶原结构，我们改变阴极电极(阴极)的形状，使用钛管(外径6.0mm，内径5.0mm)或者一端具有瓣膜形状的不锈钢异形柱作为阴极，采用上述实施例1的EDP技术制备各种异形结构材料。阴极为钛管时，可以获得中空的胶原管，如图9(a)所示。阴极为类似心脏瓣膜形状时，可以获得类心脏瓣膜的胶原异形材料，如图9(b)所示。

实施例18：具有长程取向和结晶性胶原纤维结构的胶原膜制备例I

(1)机械拉伸

按照实施例1的方法制备胶原膜E-Col，将其裁剪成长度30mm，宽度10mm的矩形样条。将若干矩形样条状的E-Col浸泡在超纯水里5min，然后采用Electro-Force3200型生物动力试验仪，沿着胶原膜的长度方向拉伸到200％的应变程度，使胶原膜内部 的微纤维沿着受力方向进一步取向，形成长程取向的胶原材料。最后，将拉伸完毕的E-Col浸泡在乙醇中，暂时固定取向结构。

(2)离子孵育

将步骤(1)中长程取向的胶原材料进行离子孵育：将条状胶原膜材料的两端用胶带固定在培养皿中，保持胶原膜受到持续的外部作用力而不会收缩，然后在培养皿中加入0.1M的PBS缓冲液，在室温下孵育24小时，诱导内部微纤维结构重排，以形成具有D带特征的结晶态的大直径胶原纤维。

(3)化学交联

采用光交联方法交联：将步骤2处理所得到的高度取向、且结晶的胶原膜浸泡在1mg/ml的核黄素溶液中(90％v/v乙醇-水)，在365nm紫外光照射下交联24小时，以进一步增强材料的力学性能。

图10为对E-Col进行机械拉伸-离子孵育-化学交联的示意图。

实施例19：具有高度取向和结晶性胶原纤维结构的胶原膜制备例Ⅱ

(1)机械拉伸

按照实施例1的方法制备胶原膜E-Col，将其裁剪成长度20mm，宽度20mm的矩形样条。将若干矩形样条状的E-Col浸泡在超纯水里10min，然后采用Electro-Force3200型生物动力试验仪，沿着胶原膜的长度方向拉伸到50％的应变程度，使胶原膜内部的微纤维沿着受力方向进一步取向，形成长程取向的胶原材料。然后，将拉伸完毕的E-Col浸泡在乙醇中，暂时固定取向结构。

(2)离子孵育

将步骤(1)中高度取向的胶原材料进行离子孵育：将条状胶原膜材料的两端用胶带固定在培养皿中，保持胶原膜受到持续的外部作用力而不会收缩，然后在培养皿中加入0.05M的PBS缓冲液，在室温下孵育30小时，诱导内部微纤维结构重排，以形成具有D带特征的结晶态的大直径胶原纤维。

(3)化学交联

采用戊二醛交联方法交联：配制戊二醛溶液(0.5％w/v，90％v/v乙醇-水)，将步骤(2)处理所得到的高度取向、且结晶的胶原膜浸泡在戊二醛溶液里，交联30min。随后用超纯水反复清洗，去除胶原膜中残留的戊二醛组分，获得具有高度取向和结晶性胶原纤维结构的胶原膜。

实施例20：具有高度取向和结晶性胶原纤维结构的胶原膜制备例Ⅲ

(1)机械拉伸

按照实施例1的方法制备胶原膜E-Col，将其裁剪成长度20mm，宽度10mm的矩形样条。将若干矩形样条状的E-Col浸泡在超纯水里3min，然后采用Electro-Force3200型生物动力试验仪，沿着胶原膜的长度方向拉伸到100％的应变程度，使胶原膜内部的微纤维沿着受力方向进一步取向，形成高度取向的胶原材料。最后，将拉伸完毕的E-Col浸泡在乙醇中，暂时固定取向结构。

(2)离子孵育

将步骤(1)中高度取向的胶原材料进行离子孵育：将条状胶原膜材料的两端用胶带固定在培养皿中，保持胶原膜受到持续的外部作用力而不会收缩，然后在培养皿中加入0.2M的PBS缓冲液，在室温下孵育20小时，诱导内部微纤维结构重排，以形成具有D带特征的结晶态的大直径胶原纤维。

(3)化学交联

采用京尼平交联方法交联：配制1％京尼平溶液，将步骤(2)处理所得到的高度取向、且结晶的胶原膜浸泡在京尼平溶液里，交联10h。随后用超纯水反复清洗，去除胶原膜中残留的京尼平组分，获得长程有序的胶原膜。

实施例21：具有高度取向和结晶性胶原纤维结构的胶原膜制备例Ⅳ

(1)机械拉伸

按照实施例1的方法制备胶原膜E-Col，将其裁剪成长度20mm，宽度20mm的矩形样条。将若干矩形样条状的E-Col浸泡在超纯水里10min，然后采用Electro-Force3200型生物动力试验仪，沿着胶原膜的长度方向拉伸到50％的应变程度，使胶原膜内部的微纤维沿着受力方向进一步取向，形成长程取向的胶原材料。然后，将拉伸完毕的E-Col浸泡在乙醇中，暂时固定取向结构。

(2)离子孵育：将步骤(1)中高度取向的胶原材料(经过50％的拉伸)进行离子孵育：将条状胶原膜材料的两端用胶带固定在培养皿中，保持胶原膜受到持续的外部作用力而不会收缩，然后在培养皿中加入0.05M的PBS缓冲液，在37℃下孵育18小时，诱导内部微纤维结构重排，以形成具有D带特征的结晶态的大直径胶原纤维。

(3)化学交联：采用原花青素交联方法交联：配制1.5％原花青素水溶液，用NaOH调整pH到8.5。将步骤(2)处理所得到的高度取向、且结晶的胶原膜浸泡在原花青素溶液里，交联12h。随后用超纯水反复清洗，去除胶原膜中残留的多酚组分，获得长 程取向的胶原膜。

实施例22：具有高度取向和结晶性胶原纤维结构的胶原膜制备例Ⅴ

机械拉伸和离子孵育与实施例20相同。化学交联采用光交联，具体如下：

将步骤(2)处理所得到的高度取向、且结晶的胶原膜浸泡在0.5mg/ml的核黄素溶液中(90％v/v乙醇-水)，在365nm紫外光照射下交联40小时，以进一步增强材料的力学性能。

实施例23：具有高度取向和结晶性胶原纤维结构的胶原膜制备例Ⅵ

离子孵育和化学交联与实施例18相同。机械拉伸步骤如下：

按照实施例1的方法制备短程有序的胶原膜E-Col，将其裁剪成长度40mm，宽度20mm的矩形样条。将若干矩形样条状的E-Col浸泡在超纯水里8min，然后采用Electro-Force3200型生物动力试验仪，沿着胶原膜的长度方向拉伸到150％的应变程度，使胶原膜内部的微纤维沿着受力方向进一步取向，形成长程取向的胶原材料。最后，将拉伸完毕的E-Col浸泡在乙醇中10分钟以上备用，暂时固定取向结构。

实施例24：E-Col经机械拉伸和光交联后的取向性表征

分别通过偏振光显微镜(POM，NikonEclipseCi-L)、同步2D小角x射线散射(2DSAXS，BL19U2)和透射电子显微镜(TEM，JEM-2100，JEOL)考察实施例18的制备方法所得E-Col经机械拉伸后的内部取向结构。

使用溶液法制备得到胶原膜S-Col，作为对照样品。S-Col的制备方法为：用0.5M NaOH将酸性胶原蛋白溶液(5mg/mL；pH＝3.5)调节到中性pH＝7.2，然后浇铸在圆形薄膜培养皿中(单位面积胶原含量与EDP组装的胶原单位面积质量相同)，在37℃下孵育12小时以完全凝胶化，随后将凝胶在室温下脱水48小时，形成乳白色半透明凝胶膜。

图11(a)为各组膜的外观。图11(b)为偏振光显微镜的观察结果，可以看到：S-Col对照组薄膜无明显的光学双折射现象，表现为各向同性结构；而未拉伸变形的E-Col薄膜中部分区域出现了光学双折射现象，表明部分区域存在有序结构；当E-Col被拉伸到更大的应变程度时，E-Col的整个区域都可以观察到明显的光学双折射现象，且当变形程度进一步增大到200％时，双折射颜色更为鲜艳，表明E-Col内高度取向结构的形成。

图11(c)的TEM图像表明，S-Col对照组薄膜具有松散的各向同性结构(红色圆圈表示垂直于横断面的原纤维)，而通过力学拉伸可以显著提升E-Col薄膜的致密程度和取向程度，且力学拉伸诱导的形变越大，内部微纤维排列越致密且取向度越高。

图11(d)的2DSAXS图谱显示，S-Col对照组薄膜的2D SAXS显示出一个强度几乎一致的环，这与其内部各向同性的结构相一致；而E-Col的2DSAXS图形表现出明显的拉长的环，证明各向异性排列的纳米纤维结构的出现。

为了定量描述胶原膜的取向程度，进一步分析制作方位积分强度分布曲线如图12(a)所示。结果表明，随着应变程度的增加，E-Col薄膜的方位积分强度分布曲线逐渐变窄。赫尔曼取向参数(f _c)是描述取向度的一个定量指标，它可以由方位积分强度分布曲线计算得到。图12(b)显示，S-Col薄膜对照组的取向度几乎为0(f _c＝0.02)，而未拉伸的E-Col薄膜，具有低程度的取向(f _c＝0.15)。随着E-Col薄膜拉伸应变的提升，其赫尔曼取向参数从较低的f _c＝0.15逐渐增加到f _c＝0.93(当应变为200％时)。这些结果表明，对E-Col薄膜的拉伸将诱导沿应变方向的取向结构的产生。

实施例25：E-Col经机械拉伸、离子孵育和光交联后的形貌表征

采用实施例18的方法，将E-Col进行机械拉伸(200％拉伸)和离子孵育，与天然肌腱的宏观和微观结构进行对比。采用微距和SEM进行形貌数据采集。

如图13(a)所示，最初高度透明的E-Col经过机械拉伸和离子孵育以后，变为乳白色不透明，表面呈现毫米级取向条纹状，与天然肌腱相似(图13(b))，可能是由于高阶层次结构(即大直径纤维)的形成引起了光学透明度的变化。图13(c-d)显示了低倍和高倍的SEM图像，可以看到PBS孵育后，E-Col呈现出更高阶的层次结构，即直径为5-10μm的致密排列的纤维。

实施例26：E-Col经机械拉伸和离子孵育后的取向度和晶型表征

采用实施例18的方法，将E-Col进行机械拉伸(200％拉伸)、离子孵育和光交联，与天然肌腱进行取向性和晶型的对比。

从图14(a)2D SAXS谱图中可看出，经200％预拉伸并经离子孵育后，E-Col仍具有明显拉伸的环，这表明各向异性排列结构在离子孵育后仍然保持，其f _c经计算约为0.52-0.53。且在2D SAXS谱图中同时出现明显的D带衍射环，说明经过离子孵育，胶原分子进行了有序排列。图14(b)天然肌腱的2D SAXS图谱也显示了显著的D带衍射环，其f _c经计算约为0.69-0.72。图14(c)中的1DSAXS谱图可以看出，E-Col经离子孵育后产生了与天然肌腱相似的晶型结构。

实施例27：E-Col经机械拉伸、离子孵育、光交联后的静态力学性能表征

如实施例18所述的胶原膜，经过200％机械拉伸、离子孵育、光交联后，与天然肌腱的力学性能进行对比。采用Electro-Force3200 型生物动力试验仪，研究了两者在室温下的静态拉伸性能。

为了考察材料结构对材料力学的贡献，选择在干态条件下进行测试。图15(a)和(b)分别展示了材料的断裂应力和弹性模量。E-Col材料的断裂应力约为108±6MPa，略低于天然肌腱的断裂应力(128±14Mpa)；而E-Col材料的杨氏模量(0.795±0.060Gpa)基本达到了天然肌腱的水平(0.890±0.118Gpa)。据推测，E-Col材料经过机械拉伸和离子孵育以后，由于产生了和天然肌腱高度类似的取向结构和结晶特性，因此表现出类似天然肌腱的优异力学性能，可以为肌腱/韧带修复提供潜在的生物材料。

实施例28：EDP技术组装胶原材料I

(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(M _W cut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白粘稠液体(改变加入胶原蛋白原料的质量，可以调节最终获取的胶原溶液浓度在1-20mg/ml范围变化，当超出20mg/ml后溶液失去流动性，优选方案为10mg/ml)。

(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢100μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解(加入的过氧化氢浓度可以在5-200μl/ml范围内选择，超出最大值200μl/ml过氧化氢容易在电解液中直接分解而产生气泡)。

(3)选取固定曲率的钛板电极(曲率为8.0，可根据实际需求，曲率可调范围为：7.8-8.5，如图16(a)所示)作为工作电极，铂丝或铂片(阳极)作为对电极。电极的安装方式有两种：一种是将两个电极垂直平行放置在电解池中，另一种是将两个电极水平平行放置在电解池中，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备10mg/ml的胶原溶液，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。

(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI 660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为5mA/cm ²，电压变化范围在0.22V/cm ²～1.67V/cm ²，沉积时间1500s秒，发生的电极半反应如下所示：

阳极：2H ₂O-4e ^-→4H ⁺+O ₂

阴极：4H ₂O+4e ^-→4OH ^-+2H ₂

控制电流密度和沉积时间均可以在阴极上获得具一定厚度的胶原凝胶膜(如图16(b)所示)。用超纯水多次清洗带胶原水凝胶膜的工作电极，然后从电极上剥离胶原材料E-Col。水平电极和竖直电极均能制备胶原材料，但发现竖直电极制备的材料会因重力原因上薄下厚，采用水平电极可避免此情况。

实施例29：EDP胶原材料的化学交联

按照实施例28的方法制备固定曲率的胶原膜E-Col。可采用光交联和戊二醛交联等胶原材料常规的化学交联方法。以下简述两种方法的操作步骤。

光交联：将实施例1制备的胶原膜浸泡在1mg/ml的核黄素溶液中(90％v/v乙醇-水)，在365nm紫外光照射下交联24小时，以进一步增强材料的力学性能。

戊二醛交联：配制戊二醛溶液(0.5％ w/v，90％v/v乙醇-水)，将实施例1制备的胶原膜浸泡在戊二醛溶液里，交联30min。随后用超纯水反复清洗，去除胶原膜中残留的戊二醛组分。

实施例30：EDP胶原材料化学交联后的光学性能表征

采用同实施例28相同的方法制备固定曲率的胶原膜E-Col，通过控制电流强度及施加时间，得到凝胶态厚度约为400μm的E-Col。为了比较，透析后的胶原蛋白溶液同时使用溶液法制备成胶原膜S-Col，用0.5M NaOH将酸性胶原蛋白溶液(5mg/mL；pH＝3.5)调节到中性pH＝7.2，然后浇铸在圆形薄膜培养皿中(单位面积胶原含量与EDP组装的胶原单位面积质量相同)，在37℃下孵育12小时以完全凝胶化，随后将凝胶在室温下脱水48小时，形成厚度约400μm的乳白色半透明凝胶膜。将胶原膜E-Col分别通过光交联和戊二醛交联，记为E-Col-UV和E-Col-GA，空白组E-Col不做任何处理。

将上述得到的S-Col、E-Col-UV、E-Col-GA和空白组E-Col在超纯水中浸泡1小时，以达到饱和含水量，裁剪成固定大小的尺寸方片置于比色皿内，利用紫外可见光分光光度计(Lambda 950)检测其在可见光波长范围(380nm到800nm)范围内的透光率(％)及雾度(％)(测得数值需扣除比色皿的背景)。

所有组别的胶原凝胶膜材料，在波长380nm到800nm之间都呈现出随波长变长透光率增加，而采用不同方法交联E-Col凝胶材料，基本不会改变E-Col的光学透明度，且明显优于溶液方法组装的S-Col凝胶材料。正常人角膜在430nm波长处的透光率约为80％，在500nm以上的波长可接近100％，而E-Col在交联前后在400nm处波长就已经超过80％，随着波长的增加，500nm波长以上透光率稳定在94％左右，能够接近正常角膜的透光率水平。此外，所有样品的雾度都随着波长增加呈现降低的趋势， 不同方法交联后，雾度有一定程度的上升，但也基本保证在较低的水平(低于30％)，如图17(a)和(b)所示。

采用同实施例28相同的方法制备固定曲率的胶原膜E-Col，通过控制电流强度及施加时间，得到凝胶态厚度约为200、300、400和500μm的E-Col。采用同样方法分别评价了其透光度和雾度。结果如图17(c)所示，厚度增加基本不影响材料的高透光性和低雾度。

实施例31：EDP胶原材料化学交联后的微观形貌表征

将实施例30制备的S-Col、E-Col-UV、E-Col-GA和E-Col胶原膜进行冷冻干燥，然后通过扫描电子显微镜(SEM,S-4800,Hitachi)对冷冻干燥薄膜的微观形貌进行分析，如图18所示。

S-Col膜呈现乳白色的半透明状，表面呈现较粗的纤维状结构，断面呈现纤维疏松堆叠的形貌。E-Col凝胶材料高度透明，表面形貌表明其由更小尺寸的纤维取向的排列而成，断面呈现紧密堆砌的层状结构。在交联后，表面仍能较好的保留取向结构，从断面结构看，交联在一定程度上让结构变得更加致密。对结构上的观察进一步佐证了，E-Col在交联后由于能保留较好的微观形貌，而在宏观上也显示出优异的光学性能。

实施例32：EDP胶原材料化学交联后的力学性能表征

采用同实施例30相同的方法，制备了E-Col-UV、E-Col-GA和E-Col胶原膜。将其裁剪成长度30mm，宽度10mm的矩形样条，采用Electro-Force3200型生物动力试验仪，研究了胶原膜在室温下的力学性能。

首先测试并比较了E-Col，E-Col-UV和E-Col-GA凝胶膜材料的拉伸性能。拉伸速率设定在10mm/min，得到胶原膜的应力-应变曲线。如图19(a-b)所示，交联后的E-Col-UV和E-Col-GA凝胶膜相比于E-Col凝胶膜的强度明显提升，而断裂伸长率有所下降。虽然交联后断裂应变有所下降，但E-Col-UV(1.33±0.19MPa)和E-Col-GA(5.22±0.73MPa)的断裂强度有着明显提升，推测E-Col-GA由于存在更高的交联密度，交联后的力学强度更高，表明E-Col-GA在手术过程中和术后修复期间能够承受较高的外界剪切和拉伸，以保持材料和患处的力学稳定。

进一步，进行了材料缝合强度的力学测试，如图19(c)所示，E-Col-GA相比于E-Col-UV具有更高的耐缝合性能。图19(d)定量的描述了材料的耐缝合阻力，E-Col-GA(1.75±0.3N)且显着高于E-Col-UV(0.33±0.13N)，说明E-Col-GA的缝合阻力可能足够坚固，可以使用穿透缝合线进行植入。

实施例33：人角膜上皮细胞(HCECs)在E-Col-GA膜上的细胞黏附与增殖

结合实施例30和32，选择E-Col-GA凝胶膜用于细胞实验。

(1)细胞黏附实验：将制备的E-Col-GA凝胶膜切成直径为10mm的圆形，然后放入48孔板中。浸泡75％酒精后紫外光源辐照过夜以灭菌，随后用PBS多次润洗材料。将人角膜上皮细胞(HCECs)以每孔5×10 ⁴个细胞的密度播种到膜上并进行培养12hours。随后用2.5％戊二醛固定20min，固定完成后用PBS清洗两次，按照50％、70％、90％、100％的乙醇逐步脱水，每次10min。随后滴加乙酸异戊酯后烘箱干燥后，通过SEM(S-4800,Hitachi)观察细胞12hours的黏附形态。

(2)细胞增殖实验：按照上述同样的步骤进行细胞的接种实验，并在不同时期利用Live/Dead细胞染料对细胞进行染色并通过共聚焦激光显微镜(CLSM，Nikon A1R)观察。在37℃细胞培养箱(5％CO ₂)中培养1、3和5天后使用CCK8细胞活力检测(DOJINDO)评估细胞的增殖情况，每组设置4个平行样，取平均值。

(3)细胞迁移实验：将上述凝胶膜切成直径为10mm的圆形，然后放入48孔板中。浸泡75％酒精后紫外光源辐照过夜以灭菌，随后用PBS多次润洗材料去除残留的酒精，同时保证材料紧密贴合在孔板底部。将人角膜上皮细胞(HCECs)以每孔10×10 ⁴个细胞的密度播种到膜表面并进行培养，空白对照组将细胞以同样密度接种在孔板上。通过倒置显微镜观察，当细胞长满材料及孔板表面后进行划痕操作，利用200μL枪头在材料或孔板表面轻柔的划出一条长条形的划痕。在制造出划痕后的0h，12h，24h及36h，用倒置显微镜观察并记录划痕的愈合情况。利用Image J定量不同时间点细胞的迁移情况，定量HCECs迁移到划痕区域的面积A ₁(初始的划痕面积为A ₀)，计算细胞迁移密度率ρ(％)，每组设置4个平行样取平均值：

ρ(％)＝(A ₀/A ₁)×100％    公式1。

结果显示：如图20(a)所示，在E-Col-GA膜上的人角膜上皮细胞(HCECs)能够较好的黏附在其表面，且呈现铺展的状态；接种在E-Col-GA膜和组织培养孔板上的HCECs在1、3和5天均表现持续的增殖，且在5天内的考察期间内并没有发现明显的死细胞，如图20(b)所示，表明E-Col-GA膜具备较好的细胞相容性。定量的CCK-8的细胞代谢活性也证实了这一观察结果，接种在E-Col-GA膜和组织培养孔板对照上的HCECs细胞在接种后1、3和5天均表现出高活力(>90％)，如图20(c)所示，这些结果证实，E-Col-GA膜具备优异的细胞相容性，可以支持人角膜上皮细胞(HCECs)的黏附和增殖；如图21(a)所示的体外划痕试验结果表明：接种在E-Col-GA凝胶膜表面的上皮细胞可以在不到36小时内完成迁移以填满划痕区域(宽度约500 μm)，与之相比，上皮细胞在孔板底部的迁移速率更慢，在36小时时仍然没有迁移填满划痕区域。为了量化向划痕区域的迁移，在不同时间点将细胞迁移到划痕区域的面积占初始的划痕区域面积百分比进行了计算。结果表明，在产生划痕后12、24和36小时，细胞在E-Col-GA凝胶膜上的细胞迁移完成率显着高于对照(组织培养板)的相对细胞迁移完成率，如图21(b)所示，在36小时，E-Col-GA凝胶膜的细胞迁移完成率基本已达到100％，比对照(孔板)高33％。这表明E-Col-GA膜有利于人角膜上皮细胞(HCECs)的细胞迁移。

实施例34：E-Col-GA膜在体内的角膜板层移植修复实验

(1)角膜板层缺损模型的构建

选择10-12周龄雄性新西兰白兔(由上海复旦大学附属五官科医院提供)在无菌条件下对兔眼进行了层状(250μm厚度)角膜切除术。全身麻醉后,使用肌内注射盐酸塞拉嗪注射液(1-2毫克/千克)及盐酸奥布卡因滴眼液进行局部麻醉。利用直径7mm负压真空环钻在中央角膜处制造出深度约为250μm的缺损。然后，用手术刀在相同深度进行板层角膜切除术。分别将E-Col-GA膜和商业的脱细胞猪角膜基质(标记为Commercial)填充并缝合于不同的兔角膜缺损部位，同时以不在缺损部位植入任何材料作为空白对照。

如图22所示，显示了正常角膜、构建缺损直径(7mm、深度250μm)后角膜以及E-Col-GA移植后角膜的示意图及手术中的实物照片。从实物图片可以观察到E-Col-GA可以缝合于缺损部位，同时呈现出高度透明的性状。

(2)术后裂隙灯活组织镜检查

在术后1周，2周，4周，6周和8周时间点，采用裂隙灯在兔子全身麻醉下进行角膜组织无损观察。采用白光模式，在×16放大倍率下，使用狭缝和宽光束，评估植入后的薄膜材料和周围角膜的透明度。为了评估角膜上皮在植入薄膜上的迁移，将荧光素钠眼科试纸润湿在植入部位对缺损区域进行荧光染色，采用钴蓝裂隙灯荧光染色摄影。

如图23所示，显示了不同组别处理后8周的愈合情况。无材料植入空白组，在术后1周后会出现明显的水肿现象，而导致角膜的一定程度的浊化不透明表现，但随着时间延长会逐步消退，再次恢复透明的形态。但在8周的观察期结束后，仍然能够观察到明显的缺损边界(白色箭头标识)。与之相比，实验组(E-Col-GA)和阳性对照组(商业的猪角膜脱细胞基质Commercial)，在材料植入后首先会出现一定程度的免疫反应，周围会有部分细微血管出现，同时组织也会有轻微的水肿现象出现，属于材料植入角膜缺损的正常免疫反应。但随时间的延长，周围刺激形成的血管会逐步消退，图23(c)利用软件Image J定量计算植入后血管化区域的面积占比，可以观察到实验组和阳性对照组在植入后2周内出现明显的血管，但实验组相对于阳性组的血管形成的区域较小，且在植入两周后，两组别初始形成的血管逐步消退。植入6周后，实验组初始形成的血管已完全退去，而阳性对照组仍有部分未退去的血管。此外，在植入8周后，可以观察到实验组的角膜基本上完全透明；而阳性对照组则呈现一定程度的浊化现象，还尚未恢复角膜的正常透明度，推测与植入后显著的免疫反应有关。而相比于空白对照组，两个植入组在8周的修复期完成后都已观察不到明显的缺损边界。

此外观察了兔角膜上皮细胞在凝胶膜上的迁移情况。用荧光素染色后的钴蓝裂隙灯照片显示不同组别角膜上皮缺损的大小逐渐减小，如图23(a)所示，表明上皮细胞在不同组别上都有明显的迁移发生(荧光素将上皮缺损染成绿色)，但上皮化的速率有所差异，空白对照组由于角膜上皮细胞是沿着缺损的基质层表面生长，因而迁移最快。而实验组(E-Col-GA)表现出与阳性对照组(猪角膜脱细胞基质膜Commercial)相当甚至更快的角膜上皮化速率，在术后4周基本已经完全上皮化，如图23(b)所示。

(3)术后光学相干断层扫描检查

OCT是一种高分辨率的横断面和非接触成像系统，可以用于检测材料和组织的融合情况。在术后1周，2周，4周和8周在全身麻醉下进行前段光学相干断层扫描(OCT)。

首先观察了不同组别在手术后0到8周的缺损处断层图像，如图24(a)所示。无材料植入组，在术后1周出现了明显的水肿情况，在术后2周基本上水肿已经逐步消退，但仍然能观察明显的角膜基质层的缺损。且随着时间的延长，在4周时虽然已经可以观察到完整的上皮形成，但即便到了8周，缺损处的角膜基质层厚度基本无法恢复到正常的水平(如图中白色箭头所示)。而与之相比，实验组和阳性对照组在术后一天植入后，就基本完全恢复了正常角膜的厚度。在术后一天后，可以看到材料与基质层的界面(如图中橙色箭头所示)，而在1周后，材料与基质层的界面已经逐渐模糊(如图中红色箭头所示)，表明材料与自体基质组织的融合。此外在材料和自体组织融合的同时，可以看到上皮化的逐步形成，在植入8周后能观察到完整的上皮化组织的形成(图中白色箭头所示)，而红色箭头所示区域也表明，材料和自体基质层的基本融合。

进一步，利用OCT的全角膜厚度观测模式，观察了术后8周时的全角膜厚度地形图及定量的厚度测定，如图24(b-c)所示。可以观察到兔子的正常角膜厚度约在550μm。在构建缺损后，角膜厚度出现明显的下降，厚度测量显示缺损后的角膜厚度约在200 μm附近。在术后8周后，无材料植入组的厚度又一定程度的生长。与之相比，实验组和阳性对照组，在植入八周后基本已经恢复到了正常角膜的厚度。

实施例35：E-Col膜基于Hofmeister效应的力学增强现象

采用同实施例1相同的方法制备E-Col，通过控制电流强度及施加时间，得到凝胶态厚度约为500μm的E-Col。为了比较，透析后的胶原蛋白溶液同时使用溶液法制备成胶原膜S-Col，用0.5M NaOH将酸性胶原蛋白溶液(5mg/mL；pH＝3.5)调节到中性pH＝7.2，然后浇铸在圆形薄膜培养皿中(单位面积胶原含量与EDP组装的胶原单位面积质量相同)，在37℃下孵育12小时以完全凝胶化，随后将凝胶在室温下脱水48小时，形成厚度约500μm的乳白色半透明凝胶膜S-Col。

将上述得到的E-Col膜和S-Col膜裁剪成长度30mm，宽度10mm的矩形样条，然后将其浸泡在(NH ₄) ₂SO ₄(2mol/L)溶液里24h(如图25(a)所示)，来观察凝胶膜力学性能的变化。如图25(b)所示，E-Col胶原膜的网络在能够在经典的霍夫迈斯特盐——硫酸铵的刺激下，出现明显的硬化现象，凝胶膜力学性能得到显著增强。

研究了(NH ₄) ₂SO ₄对E-Col凝胶膜的力学强化效果之后，选择溶液组装的S-Col凝胶膜作为对照，探究不同组装结构对(NH ₄) ₂SO ₄诱导的Hofmeister力学强化的差异。如图25(c-d)所示，用(NH ₄) ₂SO ₄(2M，24h)处理E-Col网络后，透明E-Col凝胶膜可以承受1千克的负荷，同时保持网络的柔韧性，这种膜可以打结而不发生破裂。相比之下，S-Col经过同样的方法处理后强化效果较小，处理后的膜不能承受500g的负荷，且发生脆性断裂。

为了研究不同霍夫曼斯特离子对E-Col的力学性能的影响，选取5种不同的盐来浸泡E-Col：CO ₃ ^2-、SO ₄ ^2-、Cl ^-、SCN ^-、I ^-。如图25(e)所示，浸泡在CO ₃ ^2-或者SO ₄ ^2-中的膜的力学强度显著增强，而用NaI溶液浸泡凝胶膜，凝胶膜则会溶胀；NaSCN溶液则会直接溶解凝胶膜。

实施例36：不同Hofmeister盐浓度处理E-Col膜后含水量的变化(脱水效果)

采用实施例35制备的胶原膜(E-Col膜和S-Col膜)，然后将其在一系列不同浓度的(NH ₄) ₂SO ₄溶液(浓度梯度：0M、1M、2M、2.5M、4M)中室温浸泡24h，随后测试浸泡后凝胶的含水量。

如下表所示，在浸泡后两类凝胶的含水量都有一定程度的下降，且随着(NH ₄) ₂SO ₄浓度的上升而显著下降。两类胶原膜经过处理后的含水量并没有出现明显的差异。

不同(NH ₄) ₂SO ₄浓度下凝胶膜的含水量对比

实施例37：E-Col膜基于Hofmeister效应的力学性能定量表征

采用同实施例35相同的方法，制备了E-Col和S-Col胶原膜，将胶原凝胶薄膜(10mm×0.5mm×30mm)在不同浓度的硫酸铵溶液(1M、2M、2.5M、4M)中室温浸泡12h，以强化疏水和H键相互作用。采用Electro-Force3200型生物动力试验仪，研究了胶原膜在室温下的力学性能。在10mm/min的应变速率下，使用夹具拉伸样品。利用应力应变曲线初始线性区域的斜率计算了试样的杨氏模量(兆帕；MPa)。采用拉伸应力应变曲线积分面积(兆焦每立方米；MJ/m ³)计算试样的韧性。

图26(a)中的定性的应力应变曲线显示，(NH ₄) ₂SO ₄处理后的E-Col凝胶膜的力学性能强化效果显著依赖于(NH ₄) ₂SO ₄浓度。相同的(NH ₄) ₂SO ₄处理对S-Col凝胶膜的强化效果要小得多。图26(b)总结了对杨氏模量的影响：当两种网络都通过4M(NH ₄) ₂SO ₄处理得到加强时，E-Col的模量增加了50倍，而S-Col的模量仅增加了6倍。图26(c)总结了对韧性的影响：4M(NH ₄) ₂SO ₄处理使E-Col膜增韧16倍，但这种处理对S-Col膜的韧性增强基本上没有贡献。上述的结果表明，E-Col网络在经过(NH ₄) ₂SO ₄处理后相比于S-Col网络的韧性出现了明显的提升，表明了两种不同组装结构的胶原凝胶膜对Hofmeister效应的力学响应性差异。

实施例38：E-Col膜基于Hofmeister效应的力学性能定量表征

采用同实施例35相同的方法，制备了E-Col膜，将凝胶薄膜(10mm×0.5mm×30mm)在不同浓度的碳酸钠Na ₂CO ₃溶液(1M、2M、2.5M)中室温浸泡12h。然后采用Electro-Force3200型生物动力试验仪，研究了水凝胶在室温下的拉伸性能。

拉伸速率设定在10mm/min，得到胶原膜的应力-应变曲线。如图27(a)所示，在不同浓度Na ₂CO ₃处理后E-Col凝胶膜的应力-应变曲线表明，Na ₂CO ₃作为一种强水合能力的Hofmeister盐也能增强E-Col网络。且效果随着盐浓度的增加而增强。

采用同实施例2相同的方法，制备了E-Col膜，将凝胶薄膜(10mm×0.5mm×30mm)在2MNa ₂CO ₃溶液中室温浸泡12h。如图27(b)所示，E-Col凝胶膜经过2MNa ₂CO ₃处理24小时后，表现出明显的强化效果，但将强化的E-Col凝胶膜在SBF(广州雅至生物科技有限公司，PH1820)处理24小时后，又会逐步软化回到初始的柔软状态，表明Na2CO3强化E-Col网络是一个可逆的过程，随着Hofmeister盐离子的浸出将恢复到柔软状态。这表明，E-Col膜基于Hofmeister效应的力学增强效应具有可逆性。

实施例39：力学强化的E-Col膜的体内动脉环缩应用

(1)肺动脉环缩实验模型的构建

采用2个月大的新西兰白兔，采用戊巴比妥40～50mg kg ^-1耳静脉注射麻醉。肺动脉减压手术前先用彩色多普勒超声观察肺动脉并记录肺动脉直径，然后检测每只家兔的血流速度(VEL)和压力梯度(PG)。接下来，准备工作提前完成，如气管插管，呼吸支持，吸入麻醉，营养液供应。通过开胸后暴露左室(LV)。首先暴露肺动脉，确定环收缩位置，将电组装胶原微纤水凝胶带(2M Na ₂CO ₃强化处理)绕肺动脉绕行，打一个滑动水凝胶结，然后调整环收缩程度，收紧凝胶结，最后去除多余的凝胶材料。手术结束后，按临床常规步骤关闭兔胸。观察术后肺动脉缩窄直径、VEL、PG值，以确定减压效果。术后1d、3d用彩色多普勒超声观察肺动脉直径恢复情况，如图28所示。

(2)术后彩色多普勒超声图像结果

实验使用新西兰兔作为动物模型，使用被Na ₂CO ₃增强的E-Col膜作为手术束带来减少肺动脉的直径，如图28(b)所示。图28(c)的心脏彩色多普勒超声图像显示，手术束带使肺动脉直径从术前的直径Φ＝0.63cm减少到术后直径Φ ₀＝0.43cm，减少约68％，证实了由Na ₂CO ₃强化的E-Col能提供较高的力学强度以显著收缩肺动脉直径。术后第1天肺动脉直径恢复至正常直径的75％(Φ ₁＝0.48cm)，3天后恢复到术前肺动脉的正常直径。此外，对动脉血管进行多普勒超声检查，其血流速度和压力梯度如图29所示。结果显示血流速度从术前的119cm/s降低到术后的93.1cm/s，压力梯度从术前的6mmHg显著降低到术后的3mmHg，表明在动脉周围植入的强化E-Col带可以显著收缩肺动脉以达到短期限制血液流速和降低血流压力的效果。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (48)

1. 一种从电极剥离的胶原材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

   将含有过氧化氢和/或醋酸的胶原溶液，电化学沉积后，在电极上得到胶原材料。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胶原溶液的pH值为1.5～4.0。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胶原溶液的浓度为1mg/mL～20mg/mL。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胶原溶液中，所述过氧化氢的体积百分数为5％～17％。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，电化学沉积的条件如下：

   温度为0℃～30℃；时间为8min～60min。
6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，电化学沉积中，电流密度为0.5mA/cm ²～10mA/cm ²；电压为0.22V/cm ²～1.67V/cm ²。
7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，电化学沉积中，电极之间的距离为1.0cm～2.5cm。
8. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，阴极选自不锈钢、碳纸、碳布、Pt电极、金电极、石墨电极、Ti电极中的一种。
9. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，阳极选自不锈钢、碳纸、碳布、Pt电极、金电极、石墨电极中的一种。
10. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

    S1、将含有胶原蛋白溶液、醋酸的混合物混合，得到胶原溶液Ⅰ；

    S2、将含有过氧化氢的混合物加入胶原溶液Ⅰ中，得到胶原溶液Ⅱ；

    S3、将胶原溶液Ⅱ置于电解池中，电化学沉积，得到胶原材料。
11. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，电极的安装方式包括：将两个电极垂直平行放置在电解池中，或者将两个电极水平平行放置在电解池中。
12. 一种胶原膜，其特征在于，包括以下制备方法：

    将含有胶原材料的混合物再次溶解溶剂，循环制备得到所述胶原膜；

    所述胶原材料选自权利要求1～11中任一项所述的制备方法得到的胶原材料。
13. 根据权利要求12所述的胶原膜，其特征在于，所述胶原膜的厚度为180μm～550μm。
14. 根据权利要求12所述的胶原膜，其特征在于，所述胶原膜外观均匀，在干态和湿态均高度透明。
15. 根据权利要求12所述的胶原膜，其特征在于，所述胶原膜以短程取向的胶原微纤以非共价键连接而成。
16. 根据权利要求12所述的胶原膜，其特征在于，所述胶原膜中的胶原排列致密。
17. 一种胶原材料在制备高度取向和结晶性胶原纤维的胶原膜中应用，其特征在于，包括以下步骤：

    A1、将胶原材料沿着胶原材料的长度方向拉伸，形成胶原材料Ⅰ；

    A2、将含有所述胶原材料Ⅰ、磷酸缓冲液的混合物，孵育后得到大直径胶原纤维；

    A3、将所述大直径胶原纤维化学交联后，得到所述高度取向和结晶性胶原纤维的胶原膜；

    所述胶原材料选自权利要求1～11任一项所述的制备方法得到的胶原材料。
18. 根据权利要求17所述的应用，其特征在于，步骤A1中，拉伸的应变程度为Ts，50％≤Ts≤200％。
19. 根据权利要求17所述的应用，其特征在于，步骤A2中，磷酸缓冲液的浓度为0.05M～0.5M。
20. 根据权利要求17所述的应用，其特征在于，步骤A2中，孵育的时间为6h～72h。
21. 根据权利要求17所述的应用，其特征在于，步骤A3中，化学交联包括光交联、戊二醛交联、京尼平交联、多酚交联。
22. 根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述光交联的条件如下：

    浸泡在0.2mg/mL～3.0mg/mL的核黄素溶液中；紫外光照射下交联1天～3天。
23. 根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述戊二醛交联的条件如下：

    浸泡在0.1％～1％的戊二醛溶液中，交联10min～2h。
24. 根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述京尼平交联的条件如下：

    浸泡在质量百分比为0.2％～2.0％的京尼平溶液中，交联8h～14h。
25. 根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述多酚交联的条件如下：

    浸泡在质量百分比为0.1％～2.0％的原花青素、单宁酸或者没食子酸的水溶液中，交联8h～14h。
26. 根据权利要求17所述的应用，其特征在于，步骤A1中，将拉伸完毕的胶原膜浸泡在乙醇中，暂时固定取向结构。
27. 根据权利要求17所述的应用，其特征在于，步骤A2中，离子孵育时将胶原膜材料的两端固定，保持胶原膜受到持续的外部作用力而不会收缩。
28. 根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述胶原膜包括长程取向、具有显著D-带特征的胶原纤维。
29. 根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述胶原膜的杨氏模量接近天然肌腱。
30. 权利要求17～29任一项所述的应用得到的胶原膜在人工肌腱中的应用。
31. 一种胶原溶液在制备人工角膜中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

    B1、获得曲率范围为7.8～8.5的阴极，作为电解池工作电极；

    B2、将含有胶原溶液的混合物置于所述电解池中，电化学沉积后，在电极上得到胶原材料；

    B3、将所述胶原材料化学交联后，得到人工角膜；

    所述胶原溶液选自权利要求1～11任一项所述的制备方法中的胶原溶液。
32. 根据权利要求31所述的应用，其特征在于，步骤B2中，电化学沉积的条件同权利要求1中的电化学沉积。
33. 根据权利要求31所述的应用，其特征在于，步骤B3中，化学交联的条件同步骤A3中的化学交联。
34. 一种人工角膜，其特征在于，所述人工角膜具与角膜曲率匹配；

    所述人工角膜选自权利要求31～33任一项所述应用得到的人工角膜。
35. 一种人工角膜在角膜修复中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

    D1、将人工角膜裁剪；

    D2、将裁剪后的人工角膜填充并缝合于角膜缺损部位；

    D3、修复至少2周；

    所述人工角膜选自权利要求31～33任一项所述应用得到的人工角膜。
36. 一种胶原材料在制备绷带中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

    将含有胶原材料的混合物置于盐溶液中，得到绷带；

    所述胶原材料选自权利要求1～11任一项所述的制备方法得到的胶原材料。
37. 根据权利要求36所述的应用，其特征在于，所述盐溶液为含有霍夫曼斯特离子可溶盐的溶液。
38. 根据权利要求37所述的应用，其特征在于，所述霍夫曼斯特离子选自CO ₃ ^2-、SO ₄ ^2-、S ₂O ₃ ^2-、H ₂PO ₄ ^-、NO ₃ ^-、CH ₃COO ^-、ClO ₄ ^-、F ^-、Cl ^-、Br ^-中的至少一种。
39. 根据权利要求36所述的应用，其特征在于，所述盐溶液的浓度为0.1M～4M。
40. 根据权利要求36所述的应用，其特征在于，混合物置于盐溶液的时间为0.5h～60h。
41. 一种绷带，其特征在于，所述绷带包括短程取向的胶原膜；

    所述绷带选自权利要求36～40任一项所述应用得到的绷带。
42. 根据权利要求41所述的绷带，其特征在于，所述胶原膜能够自行恢复柔软状态并且动态松弛。
43. 根据权利要求41所述的绷带，其特征在于，所述胶原膜的断裂强度为2.0MPa～8.0MPa。
44. 根据权利要求41所述的绷带，其特征在于，所述胶原膜的杨氏模量为9.0MPa～18.0MPa。
45. 根据权利要求41所述的绷带，其特征在于，所述胶原膜的韧性值为0.5MJ/M ³～5.5MJ/M ³。
46. 根据权利要求41所述的绷带，其特征在于，所述绷带的厚度为50μm～1000μm。
47. 权利要求41～46任一项所述的绷带在动脉环缩绷带中的应用。
48. 根据权利要求47所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

    E1、确定动脉进行环收缩的位置；

    E2、将绷带绕待动脉进行环收缩的位置绕行，打一个滑动水凝胶结；

    E3、调整环收缩程度，去除多余的绷带。

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