CN115233246A - 一种强韧胶原绷带材料、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于电化学沉积技术和生物大分子组装领域，涉及一种可用作临时性绷带的强韧胶原材料、其制备方法和应用。本发明的胶原绷带由具有高强度和高韧性的复合霍夫曼斯特离子的胶原膜构成，该胶原绷带能够自行恢复至原有的柔软状态并且动态松弛。本发明的强韧胶原材料通过改进EDP技术组装和霍夫曼斯特离子浸泡两个阶段制备，可以维持固定的形状，提起1公斤的重物并且在打结拉扯状态下不断裂撕破。置于动物体内能够逐步变成柔软且能逐步降解，可以用做动脉环缩等需要临时力学支撑场合的绷带。
Description
技术领域
本发明属于电化学沉积技术和生物大分子组装领域，涉及一种可用作临时性绷带的强韧胶原材料、其制备方法和应用。
背景技术
胶原是脊椎动物中最丰富的蛋白质之一。胶原蛋白作为细胞外基质的重要组成成分，是动物体内分布最广的结构蛋白，也是生物质资源综合利用的重要对象。由于它具有低免疫源性，高生物相容性，能促进细胞增殖和伤口愈合等优点，已被广泛用于各类生物医用材料。胶原蛋白是一种三螺旋结构，在体内一些内源性信号的指导下，可以进行分级有序组装，即从三螺旋结构开始，经历胶原微纤、胶原原纤、胶原纤维的分级组装，最终形成组织结构。
在体外，人们多使用溶液浇铸方法将单纯的胶原蛋白加工成胶原生物材料。操作步骤是将胶原蛋白溶液调节至中性后置于模具中，于37℃下孵育一段时间以完成胶原分级组装过程。缺点是：一是不易于加工各种异形胶原材料；二是要持续几个小时，甚至过夜才能完成；三是材料内部胶原纤维无序排列、胶原排列密度低、材料外观不透明(Anelectrochemical fabrication process for the assembly of anisotropicallyoriented collagen bundles，Biomaterials 29(2008)3278–3288；Tenogenic Inductionof Human MSCs by Anisotropically Aligned Collagen Biotextiles，Adv.Funct.Mater. 2014,24,5762–5770)。
胶原最常使用的加工方式是通过溶剂先将其分解为胶原分子，利用胶原分子的溶液进而制备材料。这种方式虽然可使胶原材料形式多样化，但天然胶原的聚集态结构很难再完美重现，导致胶原原本优异的力学性能损失。因此，以提高胶原材料力学性能为目的，探寻胶原新加工途径，是实现胶原高值化综合利用所面临的挑战。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种绷带，该绷带高强度高韧性，在体内能够自行恢复至柔软状态并且动态松弛。
本发明要解决的另一个技术问题是提供上述绷带的制备方法及其在作为动脉环缩绷带中的应用。
一方面，本发明提供了一种绷带，所述绷带由短程取向胶原凝胶膜构成，该胶原膜能够自行恢复柔软状态并且动态松弛。
可选的，该绷带由复合了霍夫曼斯特离子的高强度、高韧性(胶原膜构成，该胶原膜在环境中能从高强度状态逐步恢复柔软状态。高强度高韧性的所述的高强度是指断裂强度不小于2.0MPa或者杨氏模量不小于9.0MPa；所述的高韧性是指韧性值不小于0.5MJ/M3。
可选的，胶原膜力学状态改变的环境是在溶液中，例如纯水中或者含有盐和(或)酶的体液中，也可以是实施例中的模拟人体体液。在一个优选例中，在含有胶原酶(100 U/mL))的37℃的水里，该胶原膜约45h能够完全降解。可选的，所述绷带的厚度为50- 1000μm；较好的，是300-800μm。例如，所述绷带的厚度可以是100、200、300、400、 500、600、700、800、900μm等。
另一方面，本发明的胶原绷带的制备方法包括“EDP技术组装和霍夫曼斯特离子浸泡”两个阶段：
配置胶原溶液，通过电化学沉积技术(Electro-deposition EDP)，制备可以从电极剥离的短程取向胶原凝胶膜；
在盐溶液中浸泡8-60小时。
盐能够从水溶液中沉淀蛋白质，这种效应被称为霍夫迈斯特(Hofmeister)效应。其原理是盐离子与大分子及其水合壳之间的直接相互作用导致蛋白质的水合水被夺取，从而使蛋白质折叠和沉淀。可以利用Hofmeister系列离子通过增强E-Col网络内的弱相互作用来增强膜的力学性能。
可选的，所述的制备方法包括以下步骤：
S1，胶原溶液的配置：在胶原蛋白溶液中添加醋酸使胶原完全溶解，调节最终溶液的 pH值为1.5-4.0，去杂、浓缩后获取浓度在1-20mg/ml范围的胶原溶液；
S2，向步骤S1获得的胶原溶液中加入过氧化氢标准液体，使其在溶液中的终体积百分比为5％-17％，并搅拌、除去气泡，置于0-10℃备用；
S3，将阳极和阴极平行放置在电解池中电极之间的距离控制在0.5-3.0cm，在电解池中缓慢加入步骤S2所制备的胶原溶液；
S4，进行电化学沉积，沉积时间8-60分钟，获得能从阴极上直接剥离的胶原凝胶膜；
S5，将步骤S4所制备的胶原凝胶膜浸泡在第一盐溶液中8-60小时。
可选的，所述第一盐溶液选自含有霍夫曼斯特离子的可溶盐的溶液。
本发明采用“改进EDP技术组装胶原-霍夫曼斯特离子浸泡”2阶段，获得高强高韧胶原膜材料。利用改进EDP技术制备的胶原膜E-Col，主要依赖于一些非共价键作用组装而成，例如氢键以及疏水相互作用。保证了获得的胶原膜E-Col的内部结构具有动态重塑能力(因非共价键作用容易被断裂和重生)。
电化学组装的胶原膜E-Col，当不作任何处理时，其断裂强度为0.13MPa，杨氏模量为 0.32MPa，韧性值为0.19MJ/M3。常规思路是采用化学或者物理交联提高材料的力学性能。当采用0.5％w/v戊二醛化学交联胶原膜时，断裂强度可提高到5.22MPa，杨氏模量提高到11.39MPa，韧性值为1.27MJ/M3；采用1mg/ml核黄素紫外光交联胶原膜，材料的断裂强度可提高到1.33MPa，杨氏模量提高到1.24MPa，韧性值为0.23MJ/M3。但与本发明的霍夫曼斯特离子强化技术对比，其力学性能的提高程度有限。更重要的是，因胶原膜内部引入大量的共价键，交联后的胶原E-Col的力学性能不会具有动态恢复能力。使用本发明的制备方法，胶原膜的断裂强度可以达到5.85MPa和以上，最高杨氏模量可以达到16.42MPa和以上，最高韧性值可以达到3.33MJ/M3和以上。
可选的，步骤S1中调节加入胶原蛋白原料的质量，使最终获取的胶原溶液浓度在5- 10mg/ml。
可选的，步骤S2加入的过氧化氢浓度为20-150μl/ml。
可选的，步骤S3电极距离为1.0-2.0cm。
可选的，步骤S4中，以恒电流方式或者恒电压方式进行电化学沉积。
可选的，步骤S5中，盐溶液的浓度为0.1-4M。
可选的，步骤S1中，在胶原溶液中滴加冰醋酸以促使胶原完全溶解。
可选的，步骤S2中，离心速度6000-8000rpm/min的速度离心。
可选的，步骤S3中，两个电极均垂直或者平行于电解槽底部。
可选的，步骤S4中，沉积时间500-2000秒。
可选的，步骤S5中，盐溶液的浓度为0.5-2M；或者浸泡的时间为10-40小时。
不同的离子对蛋白质溶解度的影响有显著差异，阴离子比阳离子具有更显著的效果，阴离子自身水合效果(即夺取大分子的水合水)不同。通常可以改变蛋白质溶解度的阴离子有 CO3 2-、SO4 2-、S2O3 2-、H2PO4 -、NO3 -、CH3COO-ClO4 -、F-、Cl-、Br-、、SCN-、I-、等。但是并非所有的霍夫曼斯特离子和阴离子都适用于本发明的胶原膜。例如使用NaCl溶液浸泡凝胶膜，凝胶膜保持柔软的状态，无明显的力学增强；用NaI溶液浸泡凝胶膜，凝胶膜则会溶胀；NaSCN溶液则会直接溶解凝胶膜，综合考虑，选择CO3 2-或者SO4 2-的效果会更好，效果更明显。
可选的，使用第二盐溶液代替第一盐溶液，第二盐溶液选自含有CO3 2-或者SO4 2-的可溶盐的溶液。例如，选自硫酸铵、硫酸钠或者碳酸钠中的一种或者几种。
可选的，步骤S1中胶原溶液的配置为：按照400mg I型胶原蛋白溶于40mL超纯水的比例准确称取胶原蛋白和超纯水，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.0-4.0；装入MWcut off＝7.0kDa的透析袋一并放入装有冰醋酸的水溶液中，于0-5℃下透析3天以去除小分子杂质；透析后获得胶原蛋白粘稠液体。
可选的，步骤S2中，向步骤S1所述的胶原溶液中加入过氧化氢50-100μl/ml，并搅拌均匀，在0-5℃下以5000-10000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
可选的，步骤S3中，选取钛片作为阴极，铂丝或铂片作为阳极，在电解池中小心加入步骤S2中所制备的胶原溶液，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
可选的，步骤S4中，然后将电极连接到电化学工作站上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为5-10mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间1000-2000秒。
可选的，步骤S5中，将从电极剥离的胶原凝胶膜置于1-2M的Na2CO3中处理12-24小时。
再一方面，本发明提供了所述的绷带的应用，所述绷带可以用作动脉环缩绷带。
本发明制备的胶原绷带在体内或者模拟体液SBF能够自行溶解并且逐步松弛。在一些干预手术中(例如肺动脉减压手术)，动脉被绑上一条医用绷带以临时限制血流，保护下游脆弱部位免受高血压的侵害。手术后，绷带短期内应能提供持续的收缩血管的能力，但随着时间的推移，心脏功能逐渐恢复，绷带应该逐步松弛，以允许正常的血流流动(时间取决于临床细节)。因此，这种医用带的理想材料应该具有在体内环境中动态松弛的能力。本发明的E-Col膜可以满足这种力学性能的要求，因为当本发明的E-Col膜至于体内，盐可以从胶原纤维的网络中逐步渗出时，E-Col的力学强度将逐渐降低，从而减弱对植入部位的环缩效果。
模拟体液SBF，是模拟人体体液组分和酸碱度的一种液体，在本发明的一个优选例中，使用了广州雅至生物科技有限公司的产品，货号：PH1820。
可选的，所述绷带用作动脉环缩绷带时的方法如下：
确定动脉进行环收缩的位置；
将本发明的胶原绷带绕待动脉进行环收缩的位置绕行，打一个滑动水凝胶结；
调整环收缩程度，去除多余的绷带。
滑动水凝胶结的打结方法可以是：将水凝胶带的一端作为轴线，另一端围绕轴线打一外科结，使轴线穿过外科结的中心形成基本结，然后收紧该结即可。
本发明使用第一盐溶液离子浸泡方法，通过强烈水合作用，剥夺胶原内部的结合水，从而在胶原内部营造出疏水的微环境，能增强胶原微纤维之间的H键和疏水相互作用(水会干扰H键和疏水相互作用)，藉此大幅度提高了胶原膜的机械强度和韧性。实验表明，本发明的强韧胶原材料可以维持固定的形状，提起1公斤的重物并且在打结拉扯状态下不断裂撕破。在体内环境中，伴随着霍夫曼斯特盐的溶出，胶原膜的力学性能会下降，失去对血流的限制作用，并最终在体内被胶原酶降解。因此，可用做体内“动脉环缩”绷带，提供临时的限制血液流速的作用。
附图说明
图1是胶原凝胶膜。
其中，阴极上出现的一层胶原凝胶膜如图1(a)所示，图1(b)展示E-Col胶原材料外观非常均匀，在干态和湿态均高度透明。
图2是E-Col膜基于Hofmeister效应的力学增强现象测试图。
图2(a)中，将E-Col膜和S-Col膜裁剪成长度30mm，宽度10mm的矩形样条，然后将其浸泡在(NH4)2SO4(2mol/L)溶液里24h。图2(b)中，E-Col胶原膜的网络在能够在经典的霍夫迈斯特盐——硫酸铵的刺激下，出现明显的硬化现象，凝胶膜力学性能得到显著增强。图2(c-d)展示，用(NH4)2SO4(2M，24h)处理E-Col网络后，透明E-Col凝胶膜可以承受1千克的负荷，同时保持网络的柔韧性，这种膜可以打结而不发生破裂。相比之下，S- Col经过同样的方法处理后强化效果较小，处理后的膜不能承受500g的负荷，且发生脆性断裂。图2(e)展示，E-Col凝胶膜在不同的霍夫曼斯特盐中浸泡24小时候材料的状态。
图3是不同Hofmeister盐浓度处理E-Col膜后含水量的变化测试图。
将E-Col膜和S-Col膜在一系列不同浓度的(NH4)2SO4溶液中室温浸泡24h，随后测试浸泡后凝胶的含水量。浸泡后两类凝胶的含水量都有一定程度的下降，且随着(NH4)2SO4浓度的上升而显著下降。两类胶原膜经过处理后的含水量并没有出现明显的差异。
图4是E-Col膜基于Hofmeister效应的力学性能定量表征结果图。
将胶原凝胶薄膜在不同浓度的硫酸铵溶液(1M、2M、2.5M、4M)中室温浸泡12h，以强化疏水和H键相互作用。采用Electro-Force3200型生物动力试验仪，研究了胶原膜在室温下的力学性能。在10mm/min的应变速率下，使用夹具拉伸样品。利用应力应变曲线初始线性区域的斜率计算了试样的杨氏模量(兆帕；MPa)。采用拉伸应力应变曲线积分面积 (兆焦每立方米；MJ/m3)计算试样的韧性。
图4(a)中的定性的应力应变曲线显示，(NH4)2SO4处理后的E-Col凝胶膜的力学性能强化效果显著依赖于(NH4)2SO4浓度。相同的(NH4)2SO4处理对S-Col凝胶膜的强化效果要小得多。图4(b)总结了对杨氏模量的影响：当两种网络都通过4M(NH4)2SO4处理得到加强时，E-Col的模量增加了50倍，而S-Col的模量仅增加了6倍。图4(c)中，4M(NH4)2SO4处理使E-Col膜增韧16倍，但这种处理对S-Col膜的韧性增强基本上没有贡献。上述的结果表明，E-Col网络在经过(NH4)2SO4处理后相比于S-Col网络的韧性出现了明显的提升，表明了两种不同组装结构的胶原凝胶膜对Hofmeister效应的力学响应性差异。
图5是E-Col膜基于Hofmeister效应的力学性能定量表征结果图。
将凝胶薄膜在不同浓度的碳酸钠Na2CO3溶液(1M、2M、2.5M)中室温浸泡12h。然后采用Electro-Force3200型生物动力试验仪，研究了水凝胶在室温下的拉伸性能。拉伸速率设定在10mm/min，得到胶原膜的应力-应变曲线。如图5(a)所示，在不同浓度Na2CO3处理后E-Col凝胶膜的应力-应变曲线表明，Na2CO3作为一种强水合能力的Hofmeister盐也能增强E-Col网络。且效果随着盐浓度的增加而增强。如图5(b)所示，E-Col凝胶膜经过 2MNa2CO3处理24小时后，表现出明显的强化效果，但将强化的E-Col凝胶膜在SBF(模拟体液)处理24小时后，又会逐步软化回到初始的柔软状态，表明Na2CO3强化E-Col网络是一个可逆的过程，随着Hofmeister盐离子的浸出将恢复到柔软状态。这表明，E-Col膜基于 Hofmeister效应的力学增强效应具有可逆性。
图6是力学强化的E-Col膜用作体内动脉环缩的测试图。
以2个月大的新西兰白兔为实验对象，其心脏及手术位置如图6(a)所示。使用被Na2CO3增强的E-Col膜作为手术束带来减少肺动脉的直径，如图6(b)所示。图6(c)的心脏彩色多普勒超声图像显示，手术束带使肺动脉直径从术前的直径φ＝0.63cm减少到术后直径φ0＝0.43cm，减少约68％，证实了由Na2CO3强化的E-Col能提供较高的力学强度以显著收缩肺动脉直径。术后第1天肺动脉直径恢复至正常直径的75％(φ1＝0.48cm)，3天后恢复到术前肺动脉的正常直径。
图7是对图6所涉及的新西兰实验白兔的动脉血管进行多普勒超声检查的血流速度和压力梯度图。
结果显示血流速度从术前的119cm/s降低到术后的93.1cm/s，压力梯度从术前的6mmHg显著降低到术后的3mmHg，表明在动脉周围植入的强化E-Col带可以显著收缩肺动脉以达到短期限制血液流速和降低血流压力的效果。
具体实施方式
本发明提供了一种具有高强、高韧力学特性的胶原膜制备技术，其获得的胶原膜和应用。该技术分为“改进EDP技术组装胶原-霍夫曼斯特离子浸泡”2个阶段。该胶原膜材料的特征为：以短程有序取向、且致密排列的胶原微纤维复合霍夫曼斯特盐组成；胶原微纤维之间以增强的非共价键连接；胶原膜的强度和韧性表现出随着霍夫曼斯特盐浓度增加而不断增强的特性；伴随着霍夫曼斯特盐的溶出，胶原膜的力学性能会下降，并最终在体内分解，因此可用做体内“动脉环缩”绷带，提供临时的限制血液流速的作用。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：胶原材料制备例I
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白粘稠液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢80μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取钛片(阴极)作为工作电极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为对电极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，发生的电极半反应如下所示。
阳极：2H2O-4e-→4H++O2
阴极：4H2O+4e-→4OH-+2H2。
实验结束后在阴极上出现一层胶原凝胶膜，如图1(a)所示。。用超纯水多次清洗带胶原水凝胶膜的工作电极，然后从电极上剥离胶原材料E-Col。水平电极和竖直电极均能制备胶原材料，但发现竖直电极制备的材料会因重力原因上薄下厚，采用水平电极可避免此情况。E-Col胶原材料外观非常均匀，在干态和湿态均高度透明，如图1(b)所示。
实施例2：胶原材料制备例Ⅱ
(1)胶原溶液的配置：准确称取800mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得20mg/ml的胶原蛋白粘稠液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢160μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取钛片(阴极)作为阴极，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤 (2)中所制备的胶原溶液(浓度为20mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例3：胶原材料制备例Ⅲ
(1)胶原溶液的配置：准确称取40mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得1mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢50μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取钛片(阴极)作为阴极，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤 (2)中所制备的胶原溶液(浓度为1mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例4：胶原材料制备例Ⅳ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为2.0。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和200ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢80μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取钛片(阴极)作为阴极，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤 (2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例5：胶原材料制备例Ⅴ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为4.0。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和20μl冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢80μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取钛片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例6：胶原材料制备例Ⅵ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢50μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取钛片(阴极)作为阴极，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤 (2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例7：胶原材料制备例Ⅶ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取Pt片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在3.0cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间500秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例8：胶原材料制备例Ⅷ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取Pt片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在3.0cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间3000秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例9：E-Col膜基于Hofmeister效应的力学增强现象
采用同实施例1相同的方法制备E-Col，通过控制电流强度及施加时间，得到凝胶态厚度约为500μm的E-Col。为了比较，透析后的胶原蛋白溶液同时使用溶液法制备成胶原膜 S-Col，用0.5M NaOH将酸性胶原蛋白溶液(5mg/mL；pH＝3.5)调节到中性pH＝7.2，然后浇铸在圆形薄膜培养皿中(单位面积胶原含量与EDP组装的胶原单位面积质量相同)，在37℃下孵育12小时以完全凝胶化，随后将凝胶在室温下脱水48小时，形成厚度约500 μm的乳白色半透明凝胶膜S-Col。
将上述得到的E-Col膜和S-Col膜裁剪成长度30mm，宽度10mm的矩形样条，然后将其浸泡在(NH4)2SO4(2mol/L)溶液里24h(如图2(a)所示)，来观察凝胶膜力学性能的变化。如图2(b)所示，E-Col胶原膜的网络在能够在经典的霍夫迈斯特盐——硫酸铵的刺激下，出现明显的硬化现象，凝胶膜力学性能得到显著增强。
研究了(NH4)2SO4对E-Col凝胶膜的力学强化效果之后，选择溶液组装的S-Col凝胶膜作为对照，探究不同组装结构对(NH4)2SO4诱导的Hofmeister力学强化的差异。如图2(c-d)所示，用(NH4)2SO4(2M，24h)处理E-Col网络后，透明E-Col凝胶膜可以承受1千克的负荷，同时保持网络的柔韧性，这种膜可以打结而不发生破裂。相比之下，S-Col经过同样的方法处理后强化效果较小，处理后的膜不能承受500g的负荷，且发生脆性断裂。
为了研究不同霍夫曼斯特离子对E-Col的力学性能的影响，选取5种不同的盐来浸泡 E-Col：CO3 2-、SO4 2-、Cl-、SCN-、I-。如图2(e)所示，浸泡在CO3 2-或者SO4 2-中的膜的力学强度显著增强，而用NaI溶液浸泡凝胶膜，凝胶膜则会溶胀；NaSCN溶液则会直接溶解凝胶膜。
实施例10：不同Hofmeister盐浓度处理E-Col膜后含水量的变化(脱水效果)
采用实施例9制备的胶原膜(E-Col膜和S-Col膜)，然后将其在一系列不同浓度的(NH4)2SO4溶液(浓度梯度：0M、1M、2M、2.5M、4M)中室温浸泡24h，随后测试浸泡后凝胶的含水量。
如图3所示，在浸泡后两类凝胶的含水量都有一定程度的下降，且随着(NH4)2SO4浓度的上升而显著下降。两类胶原膜经过处理后的含水量并没有出现明显的差异。
实施例11：E-Col膜基于Hofmeister效应的力学性能定量表征
采用同实施例9相同的方法，制备了E-Col和S-Col胶原膜，将胶原凝胶薄膜(10mm×0.5mm×30mm)在不同浓度的硫酸铵溶液(1M、2M、2.5M、4M)中室温浸泡12h，以强化疏水和H键相互作用。采用Electro-Force3200型生物动力试验仪，研究了胶原膜在室温下的力学性能。在10mm/min的应变速率下，使用夹具拉伸样品。利用应力应变曲线初始线性区域的斜率计算了试样的杨氏模量(兆帕；MPa)。采用拉伸应力应变曲线积分面积 (兆焦每立方米；MJ/m3)计算试样的韧性。
图4(a)中的定性的应力应变曲线显示，(NH4)2SO4处理后的E-Col凝胶膜的力学性能强化效果显著依赖于(NH4)2SO4浓度。相同的(NH4)2SO4处理对S-Col凝胶膜的强化效果要小得多。图4(b)总结了对杨氏模量的影响：当两种网络都通过4M(NH4)2SO4处理得到加强时，E-Col的模量增加了50倍，而S-Col的模量仅增加了6倍。图4(c)总结了对韧性的影响：4M(NH4)2SO4处理使E-Col膜增韧16倍，但这种处理对S-Col膜的韧性增强基本上没有贡献。上述的结果表明，E-Col网络在经过(NH4)2SO4处理后相比于S-Col网络的韧性出现了明显的提升，表明了两种不同组装结构的胶原凝胶膜对Hofmeister效应的力学响应性差异。
实施例12：E-Col膜基于Hofmeister效应的力学性能定量表征
采用同实施例9相同的方法，制备了E-Col膜，将凝胶薄膜(10mm×0.5mm×30 mm)在不同浓度的碳酸钠Na2CO3溶液(1M、2M、2.5M)中室温浸泡12h。然后采用 Electro-Force3200型生物动力试验仪，研究了水凝胶在室温下的拉伸性能。
拉伸速率设定在10mm/min，得到胶原膜的应力-应变曲线。如图5(a)所示，在不同浓度Na2CO3处理后E-Col凝胶膜的应力-应变曲线表明，Na2CO3作为一种强水合能力的Hofmeister盐也能增强E-Col网络。且效果随着盐浓度的增加而增强。
采用同实施例2相同的方法，制备了E-Col膜，将凝胶薄膜(10mm×0.5mm×30 mm)在2MNa2CO3溶液中室温浸泡12h。如图5(b)所示，E-Col凝胶膜经过2MNa2CO3处理 24小时后，表现出明显的强化效果，但将强化的E-Col凝胶膜在SBF(广州雅至生物科技有限公司，PH1820)处理24小时后，又会逐步软化回到初始的柔软状态，表明Na2CO3强化 E-Col网络是一个可逆的过程，随着Hofmeister盐离子的浸出将恢复到柔软状态。
这表明，E-Col膜基于Hofmeister效应的力学增强效应具有可逆性。
实施例13：力学强化的E-Col膜的体内动脉环缩应用
(1)肺动脉环缩实验模型的构建
采用2个月大的新西兰白兔，采用戊巴比妥40～50mg kg-1耳静脉注射麻醉。肺动脉减压手术前先用彩色多普勒超声观察肺动脉并记录肺动脉直径，然后检测每只家兔的血流速度(VEL)和压力梯度(PG)。接下来，准备工作提前完成，如气管插管，呼吸支持，吸入麻醉，营养液供应。通过开胸后暴露左室(LV)。首先暴露肺动脉，确定环收缩位置，将电组装胶原微纤水凝胶带(2M Na2CO3强化处理)绕肺动脉绕行，打一个滑动水凝胶结，然后调整环收缩程度，收紧凝胶结，最后去除多余的凝胶材料。手术结束后，按临床常规步骤关闭兔胸。观察术后肺动脉缩窄直径、VEL、PG值，以确定减压效果。术后1d、3d用彩色多普勒超声观察肺动脉直径恢复情况，如图6所示。
(2)术后彩色多普勒超声图像结果
实验使用新西兰兔作为动物模型，使用被Na2CO3增强的E-Col膜作为手术束带来减少肺动脉的直径，如图6(b)所示。图6(c)的心脏彩色多普勒超声图像显示，手术束带使肺动脉直径从术前的直径φ＝0.63cm减少到术后直径φ0＝0.43cm，减少约68％，证实了由Na2CO3强化的E-Col能提供较高的力学强度以显著收缩肺动脉直径。术后第1天肺动脉直径恢复至正常直径的75％(φ1＝0.48cm)，3天后恢复到术前肺动脉的正常直径。此外，对动脉血管进行多普勒超声检查，其血流速度和压力梯度如图7所示。结果显示血流速度从术前的119cm/s降低到术后的93.1cm/s，压力梯度从术前的6mmHg显著降低到术后的3 mmHg，表明在动脉周围植入的强化E-Col带可以显著收缩肺动脉以达到短期限制血液流速和降低血流压力的效果。
上述相关说明以及对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些内容做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述相关说明以及对实施例的描述，本领域的技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种绷带，其特征在于，所述绷带由高强度高韧性的短程取向胶原凝胶膜构成，该胶原膜能够自行恢复柔软状态并且动态松弛；
所述的高强度是指断裂强度不小于2.0MPa或者杨氏模量不小于9.0MPa；
所述的高韧性是指韧性值不小于0.5MJ/M3。根据权利要求1所述的绷带，其特征在于，所述绷带的厚度为50-1000μm；或者，所述绷带由复合霍夫曼斯特离子的短程取向胶原凝胶膜构成。
2.根据权利要求1所述的绷带的制备方法，其特征在于，该绷带的制备方法包括以下两个阶段：
配置胶原溶液，通过电沉积反应，制备可以从电极剥离的短程取向胶原凝胶膜；
在盐溶液中浸泡8-60小时。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，胶原溶液的配置：在胶原蛋白溶液中添加醋酸使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为1.5-4.0，去杂、浓缩后获取浓度在1-20mg/ml范围的胶原溶液；
S2，向步骤S1获得的胶原溶液中加入过氧化氢标准液体，使其在溶液中的终体积百分比为5％-17％，并搅拌、除去气泡，置于0-10℃备用；
S3，将阳极和阴极平行放置在电解池中电极之间的距离控制在0.5-3.0cm，在电解池中缓慢加入步骤S2所制备的胶原溶液；
S4，进行电化学沉积，沉积时间8-60分钟，获得能从阴极上直接剥离的胶原凝胶膜；
S5，将步骤S4所制备的胶原凝胶膜浸泡在第一盐溶液中8-60小时；
所述第一盐溶液选自含有霍夫曼斯特离子的可溶盐的溶液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中调节加入胶原蛋白原料的质量，使最终获取的胶原溶液浓度在5-10mg/ml；
或者，步骤S2加入的过氧化氢浓度为20-150μl/ml；
或者，步骤S3电极距离为1.0-2.0cm；
或者，步骤S4中，以恒电流方式或者恒电压方式进行电化学沉积；
或者，步骤S5中，第一盐溶液的浓度为0.1-4M，第一盐溶液选自含有CO3 2-、SO4 2-、S2O3 2-、H2PO4 -、NO3 -、CH3COO-、ClO4 -、F-、Cl-、Br-的可溶盐的溶液。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，
步骤S1中，在胶原溶液中滴加冰醋酸以促使胶原完全溶解；或者，
步骤S2中，离心速度6000-8000rpm/min的速度离心；或者，
步骤S3中，两个电极均垂直或者平行于电解槽底部；或者，
步骤S4中，沉积时间500-2000秒；
步骤S5中，第一盐溶液的浓度为0.5-2M；或者浸泡的时间为10-40小时。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的盐溶液是第二盐溶液，第二盐溶液选自含有CO3 2-或者SO4 2-的可溶盐的溶液。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，
步骤S1中胶原溶液的配置为：按照400mg I型胶原蛋白溶于40mL超纯水的比例准确称取胶原蛋白和超纯水，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.0-4.0；装入MWcutoff＝7.0kDa的透析袋一并放入装有冰醋酸的水溶液中，于0-5℃下透析3天以去除小分子杂质；透析后获得胶原蛋白粘稠液体；
或者，步骤S2中，向步骤S1所述的胶原溶液中加入过氧化氢50-100μl/ml，并搅拌均匀，在0-5℃下以5000-10000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解；
或者，步骤S3中，选取钛片作为阴极，铂丝或铂片作为阳极，在电解池中小心加入步骤S2中所制备的胶原溶液，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡；
或者，步骤S4中，然后将电极连接到电化学工作站上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为5-10mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间1000-2000秒；
或者，步骤S5中，将从电极剥离的胶原凝胶膜置于1-2M的Na2CO3中处理12-24小时。
8.根据权利要求1所述的绷带的应用，其特征在于，所述绷带用作动脉环缩绷带。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述绷带用作动脉环缩绷带时的方法如下：
确定动脉进行环收缩的位置；
将权利要求1所述的绷带绕待动脉进行环收缩的位置绕行，打一个滑动水凝胶结；
调整环收缩程度，去除多余的绷带。
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