JP5525823B2 - 積層コラーゲンゲルの作製方法及び積層コラーゲンゲル - Google Patents
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Description
前記下層のゲル層を第1の流延方向から0度より大きく180度より小さい角度だけ回転させ、回転させた前記下層のゲル層の上に前記コラーゲン溶液を第1の流延方向に流延しゲル化させて上層のゲル層を形成する、あるいは、
前記下層のゲル層の上に、第1の流延方向に対し0度より大きく180度より小さい角度をなす第2の流延方向に前記コラーゲン溶液を流延しゲル化させて上層のゲル層を形成する、ことを特徴とする。
ここで、本発明者らはコラーゲン分子が流延方向に対して概ね垂直の方向に配向することを確認している。これは、X線回折測定によって分子軸方向(子午線)、線維間(赤道)を示すパターンが再現よく得られ、分子軸方向が流延方向に対して概ね垂直であることに基づくものである。
なお、本発明では、透明性に関しては、上層と下層のコラーゲン線維の配向方向が0度より大きく180度より小さい角度をなすような関係になくても、十分な透明性を有する。この理由については、本発明では、コラーゲン線維径が可視光線を乱反射しないくらい十分に細いためと考えられる。
前記下層のゲル層を第1の流延方向から、0度より大きく180度より小さい角度だけ回転させ、回転させた前記下層のゲル層の上に前記コラーゲン溶液を第1の流延方向に流延しゲル化させて上層のゲル層を形成する、あるいは、
前記下層のゲル層の上に、XY平面内で第1の流延方向に対し0度より大きく180度より小さい角度をなす第2の流延方向に前記コラーゲン溶液を流延しゲル化させて上層のゲル層を形成する、ことを特徴とするものである。
ここで、コラーゲン線維の配向性は、X線回折法から以下の方法により得られる配向度により評価することができる。本発明により得られるコラーゲン線維の配向度は、50〜80%、より好ましくは60%〜80%である。
ここで、無配向の場合、回折はデバイシェラー環としてえられるので、円形である。コラーゲン線維が配向すると回折は円弧になる。同一円周上の最も強い強度を示す部分から、半分の強度を示す部分までの円弧の角度をH°とすると、
(配向度)=[(180°−H°)/180°]×100、
として算出できる。無配向の場合、配向度は0%であり、100%に近いほど配向度が高いことを示す。例えば配向性の高いワラビーの尻尾の腱から切り出したType Iコラーゲンの配向度を上記手法で算出すると70〜80%となる。
ここで、本発明における積層ゲルの光透過率とは波長400〜700nmの光の光透過率であり、具体的には以下のように定義することができる。すなわち、ゲルをUV測定用石英セルの内壁に貼り付け、ゲルのない状態をブランクとして波長400〜700nmの光の光透過率を算出する。100%に近いほど光透過率が高いことを示す。本発明により得られる積層ゲルの光透過率は70%以上、より好ましくは85%以上である。
なお、本発明者らは、ゲルの厚さが500μm程度までであれば、ゲルの厚さに関係なく概ね一定の光透過率が得られることを確認している。
また、UV測定においては、セル内に生理食塩水や純水等の液体媒体を存在させ、その液体媒体中にゲルを漬けた状態で測定することもできる。液体媒体を用いない状態で測定した場合と光透過率の差がないことを確認している。通常、ゲルはその膨潤や乾燥を抑制するため、生理食塩水に浸けて保存している。そのため、液体媒体に生理食塩水を用いて光透過率を測定する方が、ゲルの保存状態に悪影響を与えないので好ましい。
ここで、可溶化コラーゲンは、コラーゲン分子が数分子以下の集合体まで微細化されたものであり、水あるいは塩水溶液に溶解して透明溶液を形成するものをいう。
また、コラーゲン溶液のpHは可溶化コラーゲンが透明となるpHであれば特に限定されない。アテロコラーゲンを用いる場合、pHは2.0〜4.0が好ましい。pHが4.0より高い場合、コラーゲン分子が十分に溶解せず、pHが2.0より低いとコラーゲン分子が加水分解を受け、さらに線維化が促進されないためにゲルの強度が不十分となるからである。
なお、カルボジイミド系の架橋剤を用いる場合、カルボキシル基活性剤としてN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を用いることが好ましい。カルボキシル基を活性エステル化して架橋効率を高めることができる。架橋剤にEDCを用い、カルボキシル基活性剤としてNHSを用いる場合、その濃度比EDC/NHSが0.5〜10、好ましくは2.0〜10である。
また、架橋剤濃度は0.1〜1.0重量%、より好ましくは0.35〜0.70重量%である。0.1重量%より小さいとゲル強度が不足し、1.0重量%より大きいと架橋剤によりコラーゲンの線維化が阻害されるからである。
ブタ皮膚由来TypeIアテロコラーゲンを10wt%の濃度でpH=4.0の水溶液に溶解させ、1mLのコラーゲン溶液を調製した。1N−NaOHを用いてコラーゲン溶液のpHを3.5〜4.0に調整し、5重量%の縮合剤(EDC)とカルボキシル基活性剤(NHS)を2:1の比率で混合した水溶液をコラーゲン溶液に180μL加えた。この溶液をガラス基板に展開し、直立させた別のガラス基板を倒しながら押し当てて第1の流延方向に沿って流延し、一対のガラス基板で挟み込んで加圧状態とし、25℃で12時間インキュベートすることでゲル化させて第1のゲル層(厚さ300μm)を形成した。次いで、一方のガラス基板を外し、第1のゲル層の表面にコラーゲン溶液を展開し、第1の流延方向と直交する第2の流延方向に沿って別のガラス基板を倒しながら流延し、一対のガラス基板で挟み込んで加圧状態とし、25℃で12時間インキュベートすることでゲル化させて第2のゲル層(厚さ300μm)を形成し、2層のゲル層からなる積層コラーゲンゲルを作製した。
第1のゲル層及び第2のゲル層を形成する際に、流延せず、別のガラス基板を真上からそのまま押し当ててガラス基板で挟み込んで加圧状態とした以外は、実施例1と同様の方法により積層コラーゲンゲルを作製した。
1.配向度
得られたゲルのX線回折測定を行い、回折パターンから配向性を定量した。用いたX線回折装置はRigaku Lapid/LSである。比較例1(無配向)の場合、回折パターンはデバイシェラー環として得られるので円形である。回折パターンの円弧の広がりを回折パターンから解析し、配向度を定量した。
ゲルをUV測定用石英セルの内壁に貼り付け、ゲルのない状態をブランクとして波長400〜700nmの光の光透過率を算出した。
FITCとローダミンで蛍光標識したコラーゲンゲルを2層積層した積層コラーゲンゲルの断面を蛍光顕微鏡で観察した。
蛍光観察には、オリンパス FV1000を用いた。
引張試験は、島津製作所製の小型卓上試験機 EZTestを用いて行った。
図1Aと図2Aに流延したコラーゲンゲルの光学顕微鏡写真とX線回折パターンを示し、図1Bと図2Bに流延していないコラーゲンゲルの光学顕微鏡写真とX線回折パターンを示す。コラーゲンゲルはガラス基板から直径8mmの大きさに切り出したものを用いた。また、紙面の横方向の矢印が流延方向である。流延したゲルは水に膨潤させると、流延方向に対して垂直方向にのみ膨潤していた。
Claims (3)
- コラーゲンゲル層を2層以上積層してなる積層コラーゲンゲルの作製方法であって、
架橋剤を含むコラーゲン溶液を第1の流延方向に流延しゲル層の厚み方向に加圧してゲル化させて下層のゲル層を形成し、
前記下層のゲル層を第1の流延方向から0度より大きく180度より小さい角度だけ回転させ、回転させた前記下層のゲル層の上に前記コラーゲン溶液を第1の流延方向に流延しゲル層の厚み方向に加圧してゲル化させて上層のゲル層を形成する、あるいは、
前記下層のゲル層の上に、第1の流延方向に対し0度より大きく180度より小さい角度をなす第2の流延方向に前記コラーゲン溶液を流延しゲル層の厚み方向に加圧してゲル化させて上層のゲル層を形成する、積層コラーゲンゲルの作製方法。 - 支持体上に上記コラーゲン溶液を流延しゲル化させて第1のゲル層を形成する、請求項1記載の作製方法。
- 上記コラーゲン溶液中のコラーゲン濃度が1〜20重量%である請求項1から2のいずれか一つに記載の作製方法。
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