WO2009084507A1 - 積層コラーゲンゲルの作製方法及び積層コラーゲンゲル - Google Patents

積層コラーゲンゲルの作製方法及び積層コラーゲンゲル Download PDF

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WO2009084507A1
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gel
gel layer
laminated
layer
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Mitsuru Akashi
Kohji Nishida
Michiya Matsusaki
Chizuru Hongou
Yuji Tanaka
Akira Kubota
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Osaka University
Tohoku University
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a laminated collagen gel and a laminated collagen gel, and more particularly to a method for producing a laminated collagen gel obtained by laminating two or more collagen gel layers and a laminated collagen gel produced by the method.
  • Collagen is the most protein (30% or more) among the proteins that make up our body, and is a structural protein of various organs such as skin, bones, tendons, blood vessel walls, and cornea. It is not only a structure-supporting function but also serves as a scaffold for cells as an extracellular matrix and promotes cell proliferation and differentiation. For this reason, collagen is applied as a culture gel for animal cells in the field of cell engineering, and as a matrix for constructing artificial organs such as artificial skin, blood vessels, corneas, and bone materials in the field of regenerative medicine.
  • Collagen consists of a repeating sequence of glycine (Gly) that appears every 3 residues (Gly-XY). Proline (Pro) and hydroxyproline (Hyp) appear in the X and Y positions, respectively. It has a characteristic structure called triple helix, which has three sequences of left-handed peptide chains ( ⁇ chains) that rotate once in three residues and are combined in a right-handed triple (this triple unless otherwise specified) A molecule having a helix structure is called collagen). It is classified as Type I, II, III ... in the order of discovery based on the difference in the amino acid sequence constituting the three chains, and about 30 types have been found now. Different types and distributions exist for each organization.
  • Type I collagen which is most abundant in living organisms, consists of about 1000 residues in one chain and 3000 residues in the entire chain, has a molecular weight of about 300 kDa, a diameter of about 1.5 nm, and a length of 300 nm. .
  • the triple helix is regularly displaced by 67nm to form collagen fibrils, and crosslinks are made between ⁇ chains (intermolecular).
  • These collagen fibrils associate to form bundles to form collagen fibers.
  • the hierarchical structure is enhanced to form a unique higher-order structure for each organ. Details of the molecular structure and the association mechanism of fine fibers have not been clarified yet.
  • solubilized collagen eg, atelocollagen
  • telopeptide highly antigenic site
  • the corneal stroma mainly composed of collagen
  • the corneal stroma is formed by laminating a large number of layers in which collagen fibers are regularly aligned and closely associated, and the upper and lower layers have a structure whose orientation differs by 90 degrees. It is said that it maintains transparency and physical strength due to its lamellar structure.
  • Non-patent Document 1 a method for preparing a highly transparent (10 to 20 wt%) collagen gel with high transparency has been proposed (Non-patent Document 1).
  • this method since the collagen solution is stirred using two syringes connected by a three-way cock, it is possible to prepare a high-concentration and transparent gel while preventing air bubbles from being mixed.
  • Application studies to the corneal stroma are being conducted using this gel.
  • Patent Document 1 a method of stretching and orientation in a uniaxial direction has been proposed.
  • a hydrogel containing collagen fibers is inserted into both ends of the gel during the gelation process, and after gelation, the hydrogel is stretched uniaxially by stretching both ends of the gel gripping material. is doing.
  • Non-patent Document 2 a method for orienting collagen fibers using a magnetic field.
  • the gel layer is rotated and a collagen gel layer is further laminated on the gel layer in a magnetic field.
  • an object of the present invention is to provide a method capable of producing a collagen gel close to the higher-order structure of an actual organ by controlling the orientation and the laminated structure of collagen fibers.
  • a method for producing a laminated collagen gel is a method for producing a laminated collagen gel comprising two or more collagen gel layers laminated, wherein a collagen solution containing a cross-linking agent is fed into the first flow. Cast and gel in the direction of stretching to form a lower gel layer, The lower gel layer is rotated from the first casting direction by an angle larger than 0 degree and smaller than 180 degrees, and the collagen solution is cast in the first casting direction on the rotated lower gel layer. And gel to form an upper gel layer, or On the lower gel layer, the collagen solution is cast and gelled in a second casting direction that forms an angle greater than 0 degrees and smaller than 180 degrees with respect to the first casting direction. Is formed.
  • the laminated collagen gel produced using the method for producing a laminated collagen gel of the present invention is a laminated collagen gel in which two or more collagen gel layers comprising crosslinked collagen fibers are laminated, each gel layer The collagen fibers are oriented, and the orientation direction of the collagen fibers in the lower gel layer and the orientation direction of the collagen fibers in the upper gel layer overlapping the lower layer form an angle greater than 0 degree and less than 180 degrees. It is characterized by that.
  • a collagen solution containing a cross-linking agent is cast in a predetermined direction so that collagen molecules that are rod-like molecules are pressurized and flowed in the casting direction while maintaining the triple helix structure of the collagen molecules.
  • the orientation of the collagen gel fiber formed by the association of collagen molecules is improved, and the physical strength of the gel layer can be increased.
  • the present inventors have confirmed that collagen molecules are oriented in a direction substantially perpendicular to the casting direction.
  • the transparency is sufficient even if the orientation direction of the upper and lower collagen fibers does not have an angle greater than 0 degree and less than 180 degrees. The reason for this is considered to be that the collagen fiber diameter is sufficiently thin in the present invention not to diffusely reflect visible light.
  • FIG. 2 is an optical micrograph of the collagen gel of Example 1.
  • 2 is an optical micrograph of a collagen gel of Comparative Example 1.
  • 2 is an X-ray diffraction pattern of the collagen gel of Example 1.
  • FIG. 2 is an X-ray diffraction pattern of a collagen gel of Comparative Example 1.
  • 2 is a fluorescence micrograph of the collagen gel of Example 1.
  • FIG. It is a graph which shows the result of the tensile test of the lamination
  • the method for producing a laminated collagen gel of the present invention is a method for producing a laminated collagen gel obtained by laminating two or more collagen gel layers, wherein a collagen solution containing a cross-linking agent is placed in the first casting direction in the XY plane. Cast and gel to form a lower gel layer, The lower gel layer is rotated from the first casting direction by an angle larger than 0 degree and smaller than 180 degrees, and the collagen solution is flowed in the first casting direction on the rotated lower gel layer. Stretch and gel to form an upper gel layer, or On the lower gel layer, the collagen solution is cast and gelled in a second casting direction that forms an angle larger than 0 degree and smaller than 180 degrees with respect to the first casting direction in the XY plane. An upper gel layer is formed.
  • a collagen solution containing a cross-linking agent is cast on a support in the first casting direction and gelled to form a first gel layer.
  • the first gel layer is rotated from the first casting direction by an angle larger than 0 degree and smaller than 180 degrees, and the collagen solution is allowed to flow in the first casting direction on the rotated first gel layer. It is made to gel and form a second gel layer.
  • the lower gel layer is rotated by a predetermined angle from the first casting direction, and the collagen solution is cast on the rotated lower gel layer in the first casting direction, so that the upper gel layer
  • the collagen solution is cast on the first gel layer in the second casting direction that forms an angle larger than 0 degree and smaller than 180 degrees with respect to the first casting direction in the XY plane to be gelled.
  • a second gel layer can also be formed. In this operation, that is, the gel solution is cast on the lower gel layer in the second casting direction that forms an angle of greater than 0 degrees and smaller than 180 degrees with respect to the first casting direction in the XY plane. It is also possible to produce a laminated collagen gel comprising two or more layers by repeating the operation of forming an upper gel layer.
  • the collagen solution is cast on the support or the lower gel layer.
  • the casting method is not particularly limited as long as the collagen solution can be flowed and spread in a predetermined direction.
  • a collagen solution is spread on a support and the support is tilted along one axial direction to spread the collagen solution, or the support is tilted along one axial direction to Examples thereof include a method of repeating forward and backward movements, and a method of spreading a collagen solution using a pressing member.
  • a method using a pressing member is preferable.
  • a flat plate member, a rotating roll, or the like can be used as the pressing member.
  • a method of spreading a collagen solution on one support and spreading the collagen solution while tilting another support in a predetermined direction can be mentioned. Furthermore, it is preferable that the gel layer is sandwiched between one and another support as it is and the gel layer is pressurized in the thickness direction of the gel layer.
  • the collagen solution which is a rod-like molecule
  • the collagen solution is pressed and flowed in the casting direction by casting the collagen solution on the support or the lower gel layer by the above-described method, and oriented in a predetermined direction.
  • the present inventors have confirmed that collagen molecules are oriented in a direction substantially perpendicular to the casting direction. This is based on the fact that a pattern showing the molecular axis direction (meridian) and between fibers (equator) is reproducibly obtained by X-ray diffraction measurement, and the molecular axis direction is substantially perpendicular to the casting direction.
  • the orientation of the collagen fibers can be evaluated by the degree of orientation obtained by the following method from the X-ray diffraction method.
  • the degree of orientation of the collagen fibers obtained by the present invention is 50 to 80%, more preferably 60% to 80%.
  • diffraction is obtained as a Debye-Scherrer ring, it is circular.
  • the collagen fibers are oriented, the diffraction becomes an arc.
  • the lower gel layer is rotated by an angle greater than 0 degree and smaller than 180 degrees with respect to the first casting direction, or the first casting is performed on the lower gel layer in the XY plane.
  • a collagen solution is cast and gelled in a second casting direction that forms an angle greater than 0 degrees and smaller than 180 degrees with respect to the direction to form an upper gel layer.
  • it is preferably 70 to 110 degrees, more preferably 80 to 100 degrees, and still more preferably 90 degrees.
  • the light transmittance of the laminated gel in the present invention is the light transmittance of light having a wavelength of 400 to 700 nm, and can be specifically defined as follows.
  • the gel is affixed to the inner wall of the quartz cell for UV measurement, and the light transmittance of light having a wavelength of 400 to 700 nm is calculated with the gel-free state as a blank.
  • the light transmittance of the laminated gel obtained by the present invention is 70% or more, more preferably 85% or more.
  • the present inventors have confirmed that a substantially constant light transmittance can be obtained regardless of the gel thickness if the gel thickness is up to about 500 ⁇ m.
  • a liquid medium such as physiological saline or pure water is present in the cell, and the gel can be immersed in the liquid medium.
  • the support used in the present invention is not particularly limited as long as it does not specifically adsorb collagen.
  • glass, plastic, silicon sheet, etc. can be used.
  • a glass substrate having a hydrophilic surface is preferred.
  • the collagen used in the present invention is not particularly limited as long as it is soluble in water and used for medical purposes.
  • Specific examples include acid-treated collagen, enzyme-treated collagen (atelocollagen), alkali-treated collagen, and chemically modified collagen thereof.
  • atelocollagen and its chemically modified collagen are preferred.
  • the chemically modified collagen activates a cross-linked site of collagen molecules, and examples thereof include succinylated collagen, acylated collagen, and esterified collagen.
  • the solubilized collagen is one in which collagen molecules are refined to an aggregate of several molecules or less and dissolves in water or a salt solution to form a transparent solution.
  • the collagen solution used in the present invention contains at least the solubilized collagen and the crosslinking agent, and the concentration of the solubilized collagen is 1 to 20% by weight, more preferably 5 to 20% by weight. If it is less than 1% by weight, the gel strength is insufficient, and if it is more than 20% by weight, the viscosity of the collagen solution is too high to make it difficult to produce a gel.
  • the pH of the collagen solution is not particularly limited as long as the solubilized collagen is transparent. When atelocollagen is used, the pH is preferably 2.0 to 4.0. When the pH is higher than 4.0, the collagen molecules are not sufficiently dissolved. When the pH is lower than 2.0, the collagen molecules are hydrolyzed, and further, the fibrosis is not promoted, so that the gel has insufficient strength. Because.
  • the cross-linking agent used for producing the collagen gel of the present invention is not particularly limited as long as it cross-links between collagen molecules and between collagen fibers, and is used for protein cross-linking and is water-soluble.
  • aldehyde-based, carbodiimide-based, epoxy-based and imidazole-based water-soluble crosslinking agents can be used.
  • EDC soluble in water is preferable.
  • a carbodiimide-based crosslinking agent it is preferable to use N-hydroxysuccinimide (NHS) as the carboxyl group activator.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the carboxyl group can be activated to increase the crosslinking efficiency.
  • EDC is used as the crosslinking agent and NHS is used as the carboxyl group activator
  • the concentration ratio EDC / NHS is 0.5 to 10, preferably 2.0 to 10.
  • the concentration of the crosslinking agent is 0.1 to 1.0% by weight, more preferably 0.35 to 0.70% by weight. This is because if it is less than 0.1% by weight, the gel strength is insufficient, and if it is more than 1.0% by weight, the fibrosis of the collagen is inhibited by the crosslinking agent.
  • a crosslinking agent after adjusting the pH of the solution.
  • a cross-linking agent By adding a cross-linking agent in a state where fiber formation is promoted by pH adjustment, cross-linking between fibers is promoted. Thereby, a fiber diameter becomes large and it becomes possible to enlarge the intensity
  • the temperature is 4 to 30 ° C., more preferably 20 to 25 ° C.
  • the laminated gel is allowed to stand in a state where it is pressurized in the thickness direction.
  • the pressurizing method is not particularly limited as long as the method can press the laminated gel in the thickness direction of the gel layer.
  • the collagen solution can be continuously pressurized after casting.
  • a collagen solution is spread on one support, the collagen solution is spread while another support is tilted in a predetermined direction, and a gel layer is formed with the one and another support.
  • a method of sandwiching and pressurizing the gel layer in the thickness direction of the gel layer can be used.
  • a laminated collagen gel in which two or more collagen gel layers comprising crosslinked collagen fibers are laminated can be produced.
  • collagen fibers in each gel layer are oriented, and the orientation direction of collagen fibers in the lower gel layer and the orientation direction of collagen fibers in the upper gel layer overlapping the lower layer are from 0 degrees.
  • the angle is larger than 180 degrees.
  • the laminated collagen gel of the present invention has a water content of 1 to 90% by weight, more preferably 5 to 50% by weight.
  • the water content can be calculated from the weight of the collagen gel before and after lyophilization, for example.
  • the laminated collagen gel of the present invention can be laminated to any thickness depending on the purpose.
  • the thickness of each gel layer can be 10 to 10,000 ⁇ m, more preferably 50 to 300 ⁇ m.
  • the thickness of the collagen gel can be controlled by the thickness of the spacer sandwiched between the supports. For example, when 50 ⁇ m silicon rubber is used as the spacer, a collagen gel having a thickness of 50 ⁇ m can be produced.
  • the laminated collagen gel of the present invention has high mechanical strength because the oriented collagen fibers are laminated in the vertical direction so as to form an angle larger than 0 degree and smaller than 180 degrees.
  • the gel strength specified by the JIS K-7128 Tear Strength Test and the tensile strength specified by the JIS K-7127 Tensile Strength Test increase with the number of gel layers laminated.
  • the laminated collagen gel of the present invention has a tensile strength of 0.1 N or more, more preferably 0.2 N or more.
  • EDC condensing agent
  • NHS carboxyl group activator
  • the gel was gelled by incubating for 12 hours to form a first gel layer (thickness 300 ⁇ m).
  • first gel layer thickness 300 ⁇ m
  • one glass substrate is removed, the collagen solution is spread on the surface of the first gel layer, and the other glass substrate is cast while being tilted along the second casting direction perpendicular to the first casting direction. Then, it is sandwiched between a pair of glass substrates to be in a pressurized state, and incubated at 25 ° C. for 12 hours to form a gel to form a second gel layer (thickness 300 ⁇ m).
  • a gel was made.
  • Comparative Example 1 Example 1 except that when the first gel layer and the second gel layer are formed, another glass substrate is not directly cast from above but directly pressed between the glass substrates to be in a pressurized state.
  • a laminated collagen gel was prepared in the same manner as described above.
  • Transmittance Gel was affixed to the inner wall of a quartz cell for UV measurement, and the light transmittance of light having a wavelength of 400 to 700 nm was calculated using a gel-free state as a blank.
  • FIGS. 1A and 2A show an optical micrograph and an X-ray diffraction pattern of the collagen gel cast
  • FIGS. 1B and 2B show an optical micrograph and an X-ray diffraction pattern of the collagen gel not cast.
  • the collagen gel was cut from a glass substrate into a diameter of 8 mm.
  • the arrow of the horizontal direction of a paper surface is a casting direction. When the cast gel was swollen in water, it was swollen only in the direction perpendicular to the casting direction.
  • FIG. 3 shows the result of observing a cross section of a laminated collagen gel obtained by laminating two layers of collagen gel fluorescently labeled with FITC and rhodamine with a fluorescence microscope. It was confirmed that the red collagen layer labeled with rhodamine was laminated on the green collagen layer labeled with FITC.
  • FIG. 4 shows the results of a tensile test of the laminated collagen gel IV having a thickness of 600 ⁇ m. Tensile strength increased with increasing number of layers.
  • the light transmittance was 85% in the case of Example 1 and 85% in Comparative Example 1. From this, it was confirmed that the method of the present invention can increase the tensile strength without affecting the light transmittance of the gel.
  • the orientation and the laminated structure of collagen fibers can be easily controlled.
  • the laminated collagen gel of the present invention can produce a laminated collagen gel having a structure similar to that of the corneal stroma, which has not been possible in the past, it is useful as a regenerative medical technique in the ophthalmic field in place of corneal transplantation.

Abstract

　コラーゲン線維の配向や積層構造を制御して、実際の器官の高次構造に近いコラーゲンゲルを作製できる方法を提供する。架橋剤を含むコラーゲン溶液を第１の流延方向に流延しゲル化させて下層のゲル層を形成し、下層のゲル層を第１の流延方向から０度より大きく１８０度より小さい角度だけ回転させ、回転させた下層のゲル層の上にコラーゲン溶液を第１の流延方向に流延しゲル化させて上層のゲル層を形成する。本発明によれば、従来なし得なかった角膜実質に類似した構造を有する積層コラーゲンゲルを作製することができるので、角膜移植に代わる眼科領域の再生医療技術として有用である。

Description

積層コラーゲンゲルの作製方法及び積層コラーゲンゲル
　本発明は、積層コラーゲンゲルの作製方法及び積層コラーゲンゲルに関し、さらに詳しくはコラーゲンゲル層を２層以上積層してなる積層コラーゲンゲルの作製方法及びその方法で作製した積層コラーゲンゲルに関する。
　コラーゲンは我々の体を構成するタンパク質の中で最も多く（３０％以上）、皮膚、骨、腱、血管壁、角膜など様々な臓器の構造タンパク質である。単なる構造支持的機能にとどまらず、細胞外マトリックスとして細胞の足場となり、細胞の増殖や分化を促進する。このため、細胞工学の分野では動物細胞の培養ゲルとして、再生医療の分野では人工皮膚や血管、角膜、骨材料など、人工臓器を構築するマトリックスとしてコラーゲンが応用されている。
　コラーゲンは３残基ごとに必ずグリシン（Gly）が現れる（Gly-X-Y）の繰り返し配列からなり、Ｘ位やＹ位にはそれぞれプロリン（Pro）やヒドロキシプロリン（Hyp）が多く現れるという特殊なアミノ酸配列を持ち、３残基で１回転する左巻きのペプチド鎖（α鎖）３本が右巻きに３重により合わさったトリプルへリックスという特徴的な構造をとる（以下、特に断らない限り、このトリプルへリックス構造を有する分子をコラーゲンという）。３本鎖を構成するアミノ酸配列の違いから発見順にType I, II, III…と分類されており、現在では約３０種類も見つかっている。組織ごとに存在するTypeや分布が異なる。生体内に最も多く存在するType Iコラーゲンは１本の鎖が約１０００残基、３本鎖全体では３０００残基からなり、分子量が約３００ｋＤａ、直径が約１．５ｎｍ、長さが３００ｎｍである。生体内ではトリプルへリックスが６７ｎｍずつ規則正しくずれて会合しコラーゲン細線維を形成し、さらにα鎖間（分子間）で架橋が行われてそれらコラーゲン細線維が会合して束になりコラーゲン線維を形成して階層構造を高め各器官毎に独特の高次構造を形成している。分子構造や細線維の会合メカニズムの詳細は未だに明らかにされていない。
　コラーゲンの細胞マトリックスとして医療分野に用いる場合には高品質と高い安全性が要求される。そのため、医療分野に用いる場合、原料となる皮膚や骨などのコラーゲンから抗原性の高い部位（テロペプチド）を酵素処理などにより除去して可溶化した可溶化コラーゲン（例えばアテロコラーゲン）を架橋剤で架橋してゲル化させたものが用いられている。しかし、コラーゲンの細胞マトリックスとしての機能を高めるためには、実際の器官の高次構造に近いコラーゲンゲルを作製する必要があり、コラーゲン線維の配向や積層構造を制御できる技術が望まれている。
　例えば、コラーゲンを主成分とする角膜実質の場合、角膜実質はコラーゲン線維が規則正しく配向して密に会合した層が多数積層されて形成されており、上下の層ではその配向が９０度異なった構造をしている（ラメラ構造）ために、透明度と物理的強度を維持していると言われている。
　これに対し、透明度の高い高濃度（１０～２０ｗｔ％）のコラーゲンゲル調製法が提案されている（非特許文献１）。この方法は、三方活栓によりつないだ２本のシリンジを用いてコラーゲン溶液を撹拌するため、気泡の混入を防いで高濃度かつ透明なゲルを調製できる。このゲルを用いて角膜実質への応用研究が行われている。
　また、コラーゲン線維の配向については、一軸方向に延伸配向する方法が提案されている（特許文献１）。この方法は、コラーゲン線維を含むハイドロゲルに、そのゲル化過程でゲル把持用物質をゲル両端に挿入し、ゲル化後、ゲル把持用物質の両端を延伸することでハイドロゲルを一軸方向に延伸している。
　また、磁場を利用してコラーゲン線維を配向させる方法が提案されている（非特許文献２）。この方法では、磁場中でコラーゲンゲル層を作製後、そのゲル層を回転させそのゲル層の上にさらに磁場中でコラーゲンゲル層を積層している。
国際公開第２００７／０６６７１５号パンフレット Griffth, M., et al., IOVS 47, 1869, 2006; Biomacromolecules 7, 1819, 2006 Torbet, J., et al. Biomaterials, 29, 4268, 2007
　しかしながら、非特許文献１の方法ではゲルの物理的強度は低く、移植の際の縫合に適した物性は達成できていない。また、特許文献１や非特許文献２では、十分な透明度が得られていないのが現状である。
　そこで、本発明は、コラーゲン線維の配向や積層構造を制御して、実際の器官の高次構造に近いコラーゲンゲルを作製できる方法を提供することを目的とした。
　上記課題を解決するため、本発明の積層コラーゲンゲルの作製方法は、コラーゲンゲル層を２層以上積層してなる積層コラーゲンゲルの作製方法であって、架橋剤を含むコラーゲン溶液を第１の流延方向に流延しゲル化させて下層のゲル層を形成し、
　前記下層のゲル層を第１の流延方向から０度より大きく１８０度より小さい角度だけ回転させ、回転させた前記下層のゲル層の上に前記コラーゲン溶液を第１の流延方向に流延しゲル化させて上層のゲル層を形成する、あるいは、
　前記下層のゲル層の上に、第１の流延方向に対し０度より大きく１８０度より小さい角度をなす第２の流延方向に前記コラーゲン溶液を流延しゲル化させて上層のゲル層を形成する、ことを特徴とする。
　また、本発明の積層コラーゲンゲルの作製方法を用いて作製される積層コラーゲンゲルは、架橋されたコラーゲン線維からなるコラーゲンゲル層が２層以上積層されてなる積層コラーゲンゲルであって、各ゲル層のコラーゲン線維が配向しており、下層のゲル層のコラーゲン線維の配向方向と、その下層に重なる上層のゲル層のコラーゲン線維の配向方向とが、０度より大きく１８０度より小さい角度をなす、ことを特徴とする。
　本発明は、架橋剤を含むコラーゲン溶液を所定の方向に流延することにより、コラーゲン分子のトリプルへリックス構造を保持したままで、棒状分子であるコラーゲン分子をその流延方向に加圧流動させ、所定方向に配向させることができる。これにより、コラーゲン分子が会合して形成されるコラーゲンゲル線維の配向性が向上し、ゲル層の物理的強度を高めることができる。
　ここで、本発明者らはコラーゲン分子が流延方向に対して概ね垂直の方向に配向することを確認している。これは、Ｘ線回折測定によって分子軸方向（子午線）、線維間（赤道）を示すパターンが再現よく得られ、分子軸方向が流延方向に対して概ね垂直であることに基づくものである。
　なお、本発明では、透明性に関しては、上層と下層のコラーゲン線維の配向方向が０度より大きく１８０度より小さい角度をなすような関係になくても、十分な透明性を有する。この理由については、本発明では、コラーゲン線維径が可視光線を乱反射しないくらい十分に細いためと考えられる。
実施例１のコラーゲンゲルの光学顕微鏡写真である。 比較例１のコラーゲンゲルの光学顕微鏡写真である。 実施例１のコラーゲンゲルのＸ線回折パターンである。 比較例１のコラーゲンゲルのＸ線回折パターンである。 実施例１のコラーゲンゲルの蛍光顕微鏡写真である。 本発明の積層コラーゲンゲルの引張試験の結果を示すグラフである。
　本発明の積層コラーゲンゲルの作製方法は、コラーゲンゲル層を２層以上積層してなる積層コラーゲンゲルの作製方法であって、架橋剤を含むコラーゲン溶液をＸＹ平面内の第１の流延方向に流延しゲル化させて下層のゲル層を形成し、
　前記下層のゲル層を第１の流延方向から、０度より大きく１８０度より小さい角度だけ回転させ、回転させた前記下層のゲル層の上に前記コラーゲン溶液を第１の流延方向に流延しゲル化させて上層のゲル層を形成する、あるいは、
　前記下層のゲル層の上に、ＸＹ平面内で第１の流延方向に対し０度より大きく１８０度より小さい角度をなす第２の流延方向に前記コラーゲン溶液を流延しゲル化させて上層のゲル層を形成する、ことを特徴とするものである。
　本発明では、まず支持体上に架橋剤を含むコラーゲン溶液を第１の流延方向に流延しゲル化させて第１のゲル層を形成する。次いで、第１のゲル層を第１の流延方向から０度より大きく１８０度より小さい角度だけ回転させ、回転させた第１のゲル層の上にコラーゲン溶液を第１の流延方向に流延しゲル化させて第２のゲル層を形成する。この操作、すなわち下層のゲル層を第１の流延方向から所定角度回転させ、その回転させた下層のゲル層の上に第１の流延方向にコラーゲン溶液を流延して上層のゲル層を形成する操作を繰り返すことにより２層以上からなる積層コラーゲンゲルを作製することができる。
　あるいは、第１のゲル層の上にＸＹ平面内で第１の流延方向に対し０度より大きく１８０度より小さい角度をなす第２の流延方向にコラーゲン溶液を流延しゲル化させて第２のゲル層を形成することもできる。この操作、すなわち、下層のゲル層の上に、ＸＹ平面内で第１の流延方向に対し０度より大きく１８０度より小さい角度をなす第２の流延方向にコラーゲン溶液を流延しゲル化させて上層のゲル層を形成する操作を繰り返すことにより２層以上からなる積層コラーゲンゲルを作製することもできる。
　本発明では、コラーゲン溶液を支持体上あるいは下層のゲル層上に流延するが、流延する方法は、所定方向にコラーゲン溶液を流動させて展延できる方法であれば特に限定されない。例えば、支持体上にコラーゲン溶液を展開させ、支持体を一の軸方向に沿って傾斜させてコラーゲン溶液を展延する方法や、支持体を一の軸方向に沿って傾斜させてコラーゲン溶液の前進及び後進を繰り返す方法や、押圧部材を用いてコラーゲン溶液を展延する方法を挙げることができる。好ましくは押圧部材を用いる方法である。押圧部材には、平板状部材や回転ロール等を用いることができる。具体例としては、一の支持体上にコラーゲン溶液を展開し、別の支持体を所定方向に倒しながらコラーゲン溶液を展延させる方法を挙げることができる。さらに、そのまま一及び別の支持体とでゲル層を挟み、ゲル層の厚み方向にゲル層を加圧することが好ましい。
　発明では、上記の方法によりコラーゲン溶液を支持体上あるいは下層のゲル層上に流延することにより、棒状分子であるコラーゲン分子をその流延方向に加圧流動させ、所定方向に配向させる。これにより、コラーゲン分子が会合して形成されるコラーゲン線維の配向性を向上させることができる。なお、本発明者らはコラーゲン分子が流延方向に対して概ね垂直の方向に配向することを確認している。これは、Ｘ線回折測定によって分子軸方向（子午線）、線維間（赤道）を示すパターンが再現よく得られ、分子軸方向が流延方向に対して概ね垂直であることに基づくものである。
　ここで、コラーゲン線維の配向性は、Ｘ線回折法から以下の方法により得られる配向度により評価することができる。本発明により得られるコラーゲン線維の配向度は、５０～８０％、より好ましくは６０％～８０％である。
　ここで、無配向の場合、回折はデバイシェラー環としてえられるので、円形である。コラーゲン線維が配向すると回折は円弧になる。同一円周上の最も強い強度を示す部分から、半分の強度を示す部分までの円弧の角度をＨ°とすると、
　　　　　　（配向度）＝［(１８０°－Ｈ°)／１８０°］×１００、
として算出できる。無配向の場合、配向度は０％であり、１００％に近いほど配向度が高いことを示す。例えば配向性の高いワラビーの尻尾の腱から切り出したType Iコラーゲンの配向度を上記手法で算出すると７０～８０％となる。
　また、本発明では、下層のゲル層を第１の流延方向に対し０度より大きく１８０度より小さい角度だけ回転させる、あるいは下層のゲル層の上に、ＸＹ平面内で第１の流延方向に対し０度より大きく１８０度より小さい角度をなす第２の流延方向にコラーゲン溶液を流延しゲル化させて上層のゲル層を形成する。上層と下層のゲル層中のコラーゲン線維の重なりを増加させて十分な引張強度を確保するためには、好ましくは７０～１１０度、より好ましくは８０～１００度、さらに好ましくは９０度である。
　ここで、本発明における積層ゲルの光透過率とは波長４００～７００ｎｍの光の光透過率であり、具体的には以下のように定義することができる。すなわち、ゲルをＵＶ測定用石英セルの内壁に貼り付け、ゲルのない状態をブランクとして波長４００～７００ｎｍの光の光透過率を算出する。１００％に近いほど光透過率が高いことを示す。本発明により得られる積層ゲルの光透過率は７０％以上、より好ましくは８５％以上である。
　なお、本発明者らは、ゲルの厚さが５００μｍ程度までであれば、ゲルの厚さに関係なく概ね一定の光透過率が得られることを確認している。
　また、ＵＶ測定においては、セル内に生理食塩水や純水等の液体媒体を存在させ、その液体媒体中にゲルを漬けた状態で測定することもできる。液体媒体を用いない状態で測定した場合と光透過率の差がないことを確認している。通常、ゲルはその膨潤や乾燥を抑制するため、生理食塩水に浸けて保存している。そのため、液体媒体に生理食塩水を用いて光透過率を測定する方が、ゲルの保存状態に悪影響を与えないので好ましい。
　本発明に用いる支持体は、コラーゲンが特異的に吸着するものでなければ特に限定されない。例えば、ガラス、プラスチック、シリコンシートなどを用いることができる。親水性表面を持つガラス基板が好ましい。
　本発明に用いるコラーゲンとしては、水に可溶なコラーゲンであって医療用に用いられるものであれば特に限定されない。具体的には酸処理コラーゲン、酵素処理コラーゲン（アテロコラーゲン）、アルカリ処理コラーゲン及びそれらの化学修飾コラーゲンである。さらに、好ましくはアテロコラーゲン及びその化学修飾コラーゲンである。ここで、化学修飾コラーゲンとは、コラーゲン分子の架橋部位を活性化するものであって、スクニシル化コラーゲン、アシル化コラーゲン又はエステル化コラーゲン等を挙げることができる。
　ここで、可溶化コラーゲンは、コラーゲン分子が数分子以下の集合体まで微細化されたものであり、水あるいは塩水溶液に溶解して透明溶液を形成するものをいう。
　本発明で用いるコラーゲン溶液とは、少なくとも、上記の可溶化コラーゲンと架橋剤とを含むものであり、可溶化コラーゲンの濃度は、１から２０重量％、より好ましくは５～２０重量％である。１重量％より小さいとゲル強度が不足し、２０重量％より大きいとコラーゲン溶液の粘度が高すぎでゲルを作製させるのが困難になるからである。
　また、コラーゲン溶液のｐＨは可溶化コラーゲンが透明となるｐＨであれば特に限定されない。アテロコラーゲンを用いる場合、ｐＨは２．０～４．０が好ましい。ｐＨが４．０より高い場合、コラーゲン分子が十分に溶解せず、ｐＨが２．０より低いとコラーゲン分子が加水分解を受け、さらに線維化が促進されないためにゲルの強度が不十分となるからである。
　本発明のコラーゲンゲルの作製に用いる架橋剤は、コラーゲン分子間及びコラーゲン線維間の架橋を行うものであり、蛋白質の架橋に用いられ水溶性であれば特に限定されない。例えば、アルデヒド系、カルボジミド系、エポキシ系及びイミダゾール系の水溶性架橋剤を用いることができる。好ましくはカルボジイミド系であり、具体的には、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリニル－４－エチル）カルボジミド等を挙げることができる。また、紫外線やγ線による光架橋等を挙げることができるが、水に可溶なＥＤＣが好ましい。
　なお、カルボジイミド系の架橋剤を用いる場合、カルボキシル基活性剤としてＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いることが好ましい。カルボキシル基を活性エステル化して架橋効率を高めることができる。架橋剤にＥＤＣを用い、カルボキシル基活性剤としてＮＨＳを用いる場合、その濃度比ＥＤＣ／ＮＨＳが０．５～１０、好ましくは２．０～１０である。
　また、架橋剤濃度は０．１～１．０重量％、より好ましくは０．３５～０．７０重量％である。０．１重量％より小さいとゲル強度が不足し、１．０重量％より大きいと架橋剤によりコラーゲンの線維化が阻害されるからである。
　なお、本発明では、溶液のｐＨ調整の後に架橋剤を加えることが好ましい。ｐＨ調整により線維形成が促進させた状態で架橋剤を加えることにより線維間の架橋が促進される。これにより、線維径が大きくなり、ゲルの強度を大きくすることが可能となる。
　本発明ではコラーゲン溶液を流延した後、ゲル化、すなわち、コラーゲンの線維化と架橋反応を促進させるが、そのゲル化条件としては、温度が４～３０℃、より好ましくは２０～２５℃で、１２～７２時間、より好ましくは２４～４８時間静置することが好ましい。さらに、好ましくは、積層ゲルをその厚み方向に加圧した状態で静置することが好ましい。その加圧方法としては、積層ゲルをそのゲル層の厚み方向に加圧できる方法であれば特に限定されない。好ましくは、コラーゲン溶液を流延後、引き続き加圧できる方法である。例えば、上述のように、一の支持体上にコラーゲン溶液を展開し、別の支持体を所定方向に倒しながらコラーゲン溶液を展延し、さらに、そのまま一及び別の支持体とでゲル層を挟み、ゲル層の厚み方向にゲル層を加圧する方法を用いることができる。
　本発明の作製方法を用いることにより、架橋されたコラーゲン線維からなるコラーゲンゲル層が２層以上積層されてなる積層コラーゲンゲルを作製することができる。その積層コラーゲンゲルは、各ゲル層のコラーゲン線維が配向しており、下層のゲル層のコラーゲン線維の配向方向と、その下層に重なる上層のゲル層のコラーゲン線維の配向方向とが、０度より大きく１８０度より小さい角度をなす。
　ここで、本発明の積層コラーゲンゲルは、含水率が１～９０重量％、より好ましくは５～５０重量％である。含水率は、例えば凍結乾燥前後のコラーゲンゲルの重量から算出することができる。
　また、本発明の積層コラーゲンゲルは、目的に応じて任意の厚みに積層することができる。また、各ゲル層の厚さは、１０～１００００μｍ、より好ましくは５０～３００μｍとすることができる。コラーゲンゲルの厚さは支持体間に挟むスペーサーの厚さにより制御できる。例えばスペーサーとして５０μｍのシリコンラバーを用いると５０μｍの厚さのコラーゲンゲルが作製できる。
　また、本発明の積層コラーゲンゲルは、配向したコラーゲン線維が互いに０度より大きく１８０度より小さい角度をなすように上下方向に積層されているため、高い機械的強度を有する。例えば、JIS K 7128 引裂強度試験で規定されるゲル強度や、JIS K 7127 引張強度試験で規定される引張強度は、ゲル層の積層数とともに増加する。例えば、本発明の積層コラーゲンゲルは、その引張強度は、０．１Ｎ以上、より好ましくは０．２Ｎ以上である。
実施例１．
　ブタ皮膚由来TypeIアテロコラーゲンを１０ｗｔ％の濃度でｐＨ＝４．０の水溶液に溶解させ、１ｍＬのコラーゲン溶液を調製した。１Ｎ－ＮａＯＨを用いてコラーゲン溶液のｐＨを３．５～４．０に調整し、５重量％の縮合剤（ＥＤＣ）とカルボキシル基活性剤（ＮＨＳ）を２：１の比率で混合した水溶液をコラーゲン溶液に１８０μＬ加えた。この溶液をガラス基板に展開し、直立させた別のガラス基板を倒しながら押し当てて第１の流延方向に沿って流延し、一対のガラス基板で挟み込んで加圧状態とし、２５℃で１２時間インキュベートすることでゲル化させて第１のゲル層（厚さ３００μｍ）を形成した。次いで、一方のガラス基板を外し、第１のゲル層の表面にコラーゲン溶液を展開し、第１の流延方向と直交する第２の流延方向に沿って別のガラス基板を倒しながら流延し、一対のガラス基板で挟み込んで加圧状態とし、２５℃で１２時間インキュベートすることでゲル化させて第２のゲル層（厚さ３００μｍ）を形成し、２層のゲル層からなる積層コラーゲンゲルを作製した。
比較例１．
　第１のゲル層及び第２のゲル層を形成する際に、流延せず、別のガラス基板を真上からそのまま押し当ててガラス基板で挟み込んで加圧状態とした以外は、実施例１と同様の方法により積層コラーゲンゲルを作製した。
（評価方法）
１．配向度
　得られたゲルのＸ線回折測定を行い、回折パターンから配向性を定量した。用いたＸ線回折装置はRigaku Lapid/LSである。比較例１（無配向）の場合、回折パターンはデバイシェラー環として得られるので円形である。回折パターンの円弧の広がりを回折パターンから解析し、配向度を定量した。
２．透過率
　ゲルをＵＶ測定用石英セルの内壁に貼り付け、ゲルのない状態をブランクとして波長４００～７００ｎｍの光の光透過率を算出した。
３．蛍光標識
　ＦＩＴＣとローダミンで蛍光標識したコラーゲンゲルを２層積層した積層コラーゲンゲルの断面を蛍光顕微鏡で観察した。
蛍光観察には、オリンパス FV1000を用いた。
４．引張試験
　引張試験は、島津製作所製の小型卓上試験機 EZTestを用いて行った。
（結果）
　図１Ａと図２Ａに流延したコラーゲンゲルの光学顕微鏡写真とＸ線回折パターンを示し、図１Ｂと図２Ｂに流延していないコラーゲンゲルの光学顕微鏡写真とＸ線回折パターンを示す。コラーゲンゲルはガラス基板から直径８ｍｍの大きさに切り出したものを用いた。また、紙面の横方向の矢印が流延方向である。流延したゲルは水に膨潤させると、流延方向に対して垂直方向にのみ膨潤していた。
　また、Ｘ線回折パターンは、回折像中の内側の強度の回折（赤道の反射）に注目すると、流延していないゲルの回折はほぼ円形であるのに対し、流延したゲルの回折は円弧の広がりが少なくより配向性が良いことが明瞭に分かる。円弧の広がりは約６０度であり、実施例１のコラーゲン線維の配向度は、（１８０－６０）／１８０×１００＝６７％であった。
　また、ＦＩＴＣとローダミンで蛍光標識したコラーゲンゲルを２層積層した積層コラーゲンゲルの断面を蛍光顕微鏡で観察した結果を図３に示す。ＦＩＴＣで標識した緑のコラーゲン層の上にローダミンで標識した赤のコラーゲン層が積層されていることを確認することができた。
　また、厚さが６００μｍの一層のコラーゲンゲル Iと、厚さ３００μｍのコラーゲンゲルを２層積層して厚さを６００μｍとした積層コラーゲンゲル IIと、厚さ２００μｍのコラーゲンゲルを３層積層した厚さを６００μｍとした積層コラーゲンゲル IIIの引張試験の結果を図４に示す。積層数の増加とともに引張強度が増加した。
　また、光透過率は、実施例１の場合で８５％であり、比較例１では８５％であった。これより、本発明の方法が、ゲルの光透過率に影響を与えることなく、引張強度を増加させることが可能なことを確認した。
　本発明によれば、コラーゲン線維の配向性や積層構造を容易に制御することができる。また、本発明の積層コラーゲンゲルは従来なし得なかった角膜実質に類似した構造を有する積層コラーゲンゲルを作製することができるので、角膜移植に代わる眼科領域の再生医療技術として有用である。

Claims (6)

  1. 　コラーゲンゲル層を２層以上積層してなる積層コラーゲンゲルの作製方法であって、
    　架橋剤を含むコラーゲン溶液を第１の流延方向に流延しゲル化させて下層のゲル層を形成し、
    　前記下層のゲル層を第１の流延方向から０度より大きく１８０度より小さい角度だけ回転させ、回転させた前記下層のゲル層の上に前記コラーゲン溶液を第１の流延方向に流延しゲル化させて上層のゲル層を形成する、あるいは、
    　前記下層のゲル層の上に、第１の流延方向に対し０度より大きく１８０度より小さい角度をなす第２の流延方向に前記コラーゲン溶液を流延しゲル化させて上層のゲル層を形成する、積層コラーゲンゲルの作製方法。
  2. 　支持体上に上記コラーゲン溶液を流延しゲル化させて第１のゲル層を形成する、請求項１記載の作製方法。
  3. 　各ゲル層をゲル化させるに際し、ゲル層の厚み方向に加圧してゲル化させる請求項１又は２に記載の作製方法。
  4. 　上記コラーゲン溶液中のコラーゲン濃度が１～２０重量％である請求項１から３のいずれか一つに記載の作製方法。
  5. 　架橋されたコラーゲン線維からなるコラーゲンゲル層が２層以上積層されてなる積層コラーゲンゲルであって、
    　各ゲル層のコラーゲン線維が配向しており、
    　下層のゲル層のコラーゲン線維の配向方向と、その下層に重なる上層のゲル層のコラーゲン線維の配向方向とが、０度より大きく１８０度より小さい角度をなす、積層コラーゲンゲル。
  6. 　波長４００～７００ｎｍにおける光透過率が７０％以上である請求項５記載の積層コラーゲンゲル。
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