JP2003055401A - 多官能性架橋剤によって架橋したグリコサミノグリカン−ポリカチオン複合体とその製造法 - Google Patents

多官能性架橋剤によって架橋したグリコサミノグリカン−ポリカチオン複合体とその製造法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 軟骨などの組織再生マトリックス用材料であ
るグリコサミノグリカン−ポリカチオン複合体の従来の
製造法は、アルコール中あるいは水中で架橋反応を行う
ため、注入可能な架橋生体物質組成物は、細胞および組
織への悪影響（細胞死）が考えられる。また、ポリイオ
ンコンプレックス（不均一な沈殿）が形成される。 【構成】 ポリエチレングリコールのカルボキシル末端
に２個以上の求電子性脱離基（例えば、スクシンイミジ
ル基またはその誘導体）を有する多官能性架橋剤を用
い、架橋剤濃度０．３〜３ｍＭでグリコサミノグリカン
とポリカチオンとを生理的条件下で架橋形成を行いグリ
コサミノグリカン−ポリカチオン複合体を合成する。生
理的条件下で合成反応を行うことができるため、細胞を
あらかじめ混合しておき、架橋反応を行うことが可能で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、多官能性架橋剤に
よって架橋形成した軟骨などの組織再生マトリックス用
材料であるグリコサミノグリカン−ポリカチオン複合体
とその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】関節軟骨は、一度損傷を受けると非常に
再生が困難な生体組織であることが知られている。老化
やスポーツ傷害によって引き起こされる変形性関節症の
患者は、世界全体で約１０００万人（国内で約１２０万
人）と言われており、軟骨を再生させるための材料開発
が強く望まれている。従来、軟骨組織の主成分であるグ
リコサミノグリカン（ヒアルロン酸：ＨｙＡまたはコン
ドロイチン硫酸：ＣｈＳ）とポリカチオン（コラーゲ
ン：Ｃｏｌ）からなる複合体の調製は、ポリイオンコン
プレックスを化学架橋する方法が採られていた。
【０００３】このような架橋生成物は、特開平８−３４
７４７号公報、特開平８−５３５４８号公報、特表平８
−５０２０８２公報、特開平９−２４９７５１公報、特
表平１０−５０１７０６公報、特表平１１−５０９２５
６公報、特表２０００−５０１９７５公報、特表２００
０−５０２３８０公報などに開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記の特開平９−２４
９７５１公報、特開平８−３４７４７号公報、特表２０
００−５０１９７５公報などに開示されている方法で
は、アルコール中あるいは水中で架橋反応を行うため、
注入可能な架橋生体物質組成物は、細胞および組織への
悪影響（細胞死）が考えられる。そのためこのような問
題を回避できる架橋方法が求められている。
【０００５】特表平１０−５０１７０６公報には、架橋
形成したゲルに細胞を内包することが可能であると記載
されている。しかしながら、水中では、浸透圧の違いに
より細胞（膜）は破壊されてしまう。また、上述のよう
に、コラーゲンとグリコサミノグリカンを水中で共存さ
せることは不可能なため、細胞を入れることも不可能で
ある。
【０００６】また、特開平９−２４９７５１公報には、
コラーゲンとグリコサミノグリカンを多官能性架橋剤で
架橋可能との内容が記載されているが、コラーゲンとグ
リコサミノグリカンは水溶液中では、コラーゲンのプラ
スチャージとグリコサミノグリカンのマイナスチャージ
によってポリイオンコンプレックス（不均一な沈殿）を
形成するので現実的には不可能である。したがって、ポ
リイオンコンプレックスを形成しない架橋方法が求めら
れている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、関節軟骨の細
胞外マトリックスの主成分であるポリカチオンとグリコ
サミノグリカンとの新規な架橋複合体とその製造法を提
供する。
【０００８】すなわち、本発明は、 ポリエチレングリ
コールのカルボキシル末端に２個以上の求電子性脱離基
を有する多官能性架橋剤によって生理的条件下で均一に
架橋形成した組織再生マトリックス用グリコサミノグリ
カン−ポリカチオン複合体である。
【０００９】また、本発明は、ポリエチレングリコール
のカルボキシル末端に２個以上の求電子性脱離基を有す
る多官能性架橋剤を用い、架橋剤濃度０．３〜３ｍＭで
グリコサミノグリカンとポリカチオンとを生理的条件下
で均一に架橋形成を行いグリコサミノグリカン−ポリカ
チオン複合体を合成することを特徴とする上記のグリコ
サミノグリカン−ポリカチオン複合体の製造法である。
また、本発明は、細胞をあらかじめ混合しておき、均一
に架橋反応を行うことを特徴とする上記のグリコサミノ
グリカン−ポリカチオン複合体の製造法である。
【００１０】本発明の製造法によれば、生理的条件、す
なわち、ｐＨ７．０−８．０、３７℃、０．１−０．２
Ｍ ＮａＣｌの条件下で合成反応を行うことができるた
め、好ましくは、１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１×１
０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度範囲で細胞をあらかじ
め混合しておき、架橋反応を行うことが可能である。生
理的ｐＨおよび塩濃度を含んだ溶液中で架橋反応するこ
とで細胞を生きた状態でゲル内に内包することが可能と
なる。必要に応じて生体中に含まれる他のイオン、例え
ば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、カリウム
イオンを添加することも可能である。細胞を混合する際
のコラーゲンあるいはＧＡＧの濃度は、０．５〜５ｗｔ
％が好ましい。
【００１１】このことは、患部の形状（例えば、欠損し
た軟骨の形）をしたコラーゲン、グリコサミノグリカ
ン、細胞組織体（生体組織様構造を持った人工物）を作
ることが可能であることを意味する。また、本発明の製
造法で用いる架橋剤は、細胞毒性が低いため、得られた
複合体は、注射器で生体内の骨、軟骨、髄核等に注入す
る組織再生マトリックス用材料としても使用できる。
【００１２】本発明の架橋複合体は、架橋密度の制御が
容易であり、含水率：９０〜９９重量％であり、コラゲ
ナーゼで分解し、軟骨、髄核、肝臓、血管の組織再生材
料として優れた物性を有している。特に、グリコサミノ
グリカン／ポリカチオンが５０／５０〜１／９９重量比
の時に軟骨に極めて類似した物性を示す。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の合成法で使用する架橋剤
の求電子性脱離基は、例えば、スクシンイミジル基、ス
ルホスクシンイミジル基またはそれらの誘導体である。
これらの架橋剤としては、ペンタエリトリトールをベー
スとした４官能性架橋剤、エチレングリコールベースの
２官能性架橋剤、グリセリンベースの３官能性架橋剤、
ヘキサグリセリンベースの８官能性架橋剤等が挙げられ
る。ポリエチレングリコールの分子量は、１０００以上
のものが好ましいが、特に限定されない。
【００１４】グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（種類に
よらない）と複合するポリカチオンには、コラーゲン
（数１０種類のタイプによらない）およびその誘導体、
コラーゲンの変性体であるゼラチン（分子量によらな
い）、ポリリジン（分子量によらない）、キトサン（脱
アセチル化度、分子量によらない）等アミノ基を有する
高分子が含まれる。コラーゲンは、アテロ化したもの
（コラーゲン末端のテロペプチド部分を除去したもの）
を用いる方が望ましい。
【００１５】以下、下記の化学式で示されるポリエチレ
ングリコールのカルボキシル末端にスクシンイミジル基
を有する４官能性架橋剤（Pentaerythritol polyethyle
neglyco ether tetrasuccinimidyl glutarate ）につい
てさらに詳しく説明する。スクシンイミジル基は、ｐＨ
７以上においてエステルの加水分解が進行するため、生
理的条件下で架橋反応を行うことができる。
【００１６】
【化１】
【００１７】ポリエチレングリコールのカルボキシル末
端がスクシンイミジル化されたカルボキシル基は、ｐＨ
７以上の雰囲気下においてスクシンイミジル基が脱離す
る。スクシンイミジル基が脱離したカルボキシル基は、
コラーゲンあるいはＧＡＧの水酸基あるいはアミノ基と
反応し、コラーゲンおよびＧＡＧの分子間、分子内の架
橋を行いゲルを形成する。
【００１８】コラーゲンとＧＡＧを含有するゲルの合成
を行う場合、コラーゲンとＧＡＧは、それぞれの水溶液
を混合すると、ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を
形成する。均一なコラーゲン−ＧＡＧを含有するゲルを
合成するには、ＰＩＣを形成しない条件下で架橋を行う
必要がある。コラーゲンの良溶媒であるリン酸イオンを
含む溶液でｐＨ７．４緩衝液を調製し、グリコサミノグ
リカンと混合すると、この条件ではコラーゲンとグリコ
サミノグリカンはポリイオンコンプレックスを形成せ
ず、均一な混合溶液が得られる。
【００１９】図１には、上記の架橋剤でＩＩ型コラーゲ
ンを種々のｐＨで架橋した後の膨潤度（＝（ゲル中の水
の重量）／（ゲルの乾燥重量))を示す。なお、膨潤度＝
含水率／（１００−含水率）で示される。架橋剤の濃度
が増加すると膨潤度が小さくなっていくことから、架橋
が進んでいることが分かる。しかしながら、架橋剤の添
加量が３ｍＭ以上になるとコラーゲンの析出により不均
一なゲルとなり好ましくない。よって、好ましい架橋剤
濃度は０．３〜３ｍＭである。均一なゲルであれば膨潤
度は特に限定されない。
【００２０】ｐＨの影響は、架橋剤が低濃度（０．３ｍ
Ｍ）の際には認められるが、それ以外の条件では認めら
れない。ゲル形成反応は、４℃では３０分程度かかるの
に対し、２５℃、３７℃では、５分以内に終了する。し
たがって、ゲル形成反応温度は２５〜３７℃が好まし
い。
【００２１】図２は、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中に種
々の濃度の塩を添加し、コラーゲンとヒアルロン酸（Ｃ
ｏｌ／ＨｙＡ＝１：１）およびコラーゲンとコンドロイ
チン硫酸（Ｃｏｌ／ＣｈＳ＝１：１）を架橋した場合の
生成物の透過率を調べた結果を示している。ｐＨ７．４
の条件では、どの塩濃度でもＰＩＣ形成は認められない
ことが分かった。すなわち、このことは、生理的条件下
で反応を進めることが可能であること、つまり、細胞を
あらかじめ混合しておき、架橋反応を行うことが可能で
あることを意味する。
【００２２】なお、透過率測定は、分光光度計によって
５００ｎｍの光の透過率を調べることで行った。透過率
１００％ということは、光が完全に透過するすること
で、均一で透明な液体であることを示す。０％では光が
全く透過しないということで、ポリイオンコンプレック
スのような沈殿が形成されていることを意味する。水中
でコラーゲンとグリコサミノグリカンを混合するとポリ
イオンコンプレックスが形成されて透過率が０％になる
が、リン酸イオンを含んだ緩衝溶液中で混合すると混合
溶液の透過率がほぼ１００％であることから均一に混合
していることが分かる。透過率のデータは、生理的ｐＨ
に加え、生理的塩濃度でも均一な混合溶液が得られるこ
とを示している。
【００２３】コラ一ゲン単独の場合と同様に、ＧＡＧを
添加した系でも０．３〜１０ｍＭの範囲でゲルが得られ
（ＨｙＡは０．１〜１０ｍＭ）、添加する架橋剤の濃度
の増加に伴い、膨潤度は減少する。しかしながら、コラ
ーゲン単独の場合と同様、架橋剤の添加量が３ｍＭ以上
になるとコラーゲンの析出により不均一なゲルとなり好
ましくない。ゲル形成反応は、コラーゲン−ＧＡＧの場
合も３７℃では５分以内で終了する。
【００２４】
【実施例】実施例１ ｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸緩衝液（４℃）に塩を添加
し、生理的条件下（ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ）とし、ＩＩ型コラーゲン＋１０ｗｔ％ヒアルロン酸
（ＨｙＡ）を溶解し、その後、１．０ｍＭの濃度の架橋
剤を添加した。架橋剤として、ポリエチレングリコール
（ユニット数ｎ＝５６）のカルボキシル末端にスクシン
イミジル基を持つペンタエリトリトールベースの４官能
性ポリエチレングリコールを使用した。
【００２５】十分攪拌後、脱泡し、３７℃の温水中で１
８時間かけて架橋反応を行ったところ、コラーゲンとヒ
アルロン酸を含有するゲルが合成された。得られたコラ
ーゲンーグリコサミノグリカン複合マトリックスの膨潤
度（＝（ゲル中の水の重量）／（ゲルの乾燥重量))は１
０８．８であった。ＰＩＣ形成は認められなかった。
【００２６】実施例２ 架橋剤の濃度を０．３ｍＭとした以外は実施例１と同様
に合成を行った。実施例１と同様のゲルが得られた。得
られたコラーゲンーグリコサミノグリカン複合マトリッ
クスの膨潤度は１７７．６であった。
【００２７】実施例３ 架橋剤の濃度を３ｍＭとした以外は実施例１と同様に合
成を行った。実施例１と同様のゲルが得られた。得られ
たコラーゲンーグリコサミノグリカン複合マトリックス
の膨潤度は８３．８であった。
【００２８】実施例４ ヒアルロン酸の代わりにコンドロイチン硫酸（ＣｈＳ）
を用い、１．０ｍＭの濃度の架橋剤を添加した以外実施
例１と同様に合成を行った。実施例１と同様のゲルが得
られた。得られたコラーゲンーグリコサミノグリカン複
合マトリックスの膨潤度は９５．６であった。
【００２９】実施例５ 架橋剤の濃度を０．３ｍＭとした以外は実施例４と同様
に合成を行った。実施例１と同様のゲルが得られた。得
られたコラーゲンーグリコサミノグリカン複合マトリッ
クスの膨潤度は１１０．７であった。
【００３０】比較例１ ０．１ｍＭの濃度の架橋剤を添加した以外は実施例４と
同様に架橋反応を行った。架橋剤の濃度が低いためゲル
が形成されなかった。
【００３１】比較例２ １０ｍＭの濃度の架橋剤を添加した以外は実施例１と同
様に架橋反応を行った。得られたコラーゲンーグリコサ
ミノグリカン複合マトリックスの膨潤度は２２．１であ
った。各実施例と比較して架橋剤の濃度が高いため架橋
剤中のポリエチレングリコール鎖の影響でコラーゲンが
析出・沈殿し、不均一なゲルになった。
【００３２】図３に、実施例１〜５および比較例１、２
により得られたコラーゲンーグリコサミノグリカン複合
マトリックスの膨潤度を示すように、架橋剤濃度が高く
なるにつれ膨潤度が小さくなることが分かる。
【００３３】実施例６ １×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるように調整し
た軟骨細胞−コラーゲン−グリコサミノグリカン（ｐＨ
７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ）にペンタエリトリトー
ルベースの４官能性架橋剤を入れ、３７℃で１０分間イ
ンキュベートした。その結果の写真を図４に示す。写真
中の丸いものが全てゲル中に内包した軟骨細胞である。
軟骨細胞は、コラーゲン−ヒアルロン酸ゲル中に均一に
分散しており、軟骨細胞特有の丸い形態をしていること
が明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ポリエチレングリコールのカルボキシ
ル末端にスクシンイミジル基を有する四官能性架橋剤で
ＩＩ型コラーゲンを種々のｐＨで架橋した後の膨潤度を
示すグラフである。
【図２】図２は、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中に種々の
濃度の塩を添加した場合の透過率を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例１〜５および比較例１、２によ
り得られたコラーゲンーグリコサミノグリカン複合マト
リックスの膨潤度を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例６により得られたコラーゲンー
グリコサミノグリカン複合マトリックスに内包された軟
骨細胞を示す図面代用写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 000190943 新田ゼラチン株式会社 大阪市浪速区桜川４丁目４番26号 (72)発明者 田中 順三 茨城県つくば市鹿島台３−６ (72)発明者 田口 哲志 茨城県つくば市稲荷前19−８スプリーム成 城Ｂ205 (72)発明者 宮崎 匡輔 東京都八王子市子安町３−33−３ (72)発明者 佐倉 義幸 神奈川県横浜市金沢区寺前１−18−15 (72)発明者 大塚 龍郎 兵庫県尼崎市七松町１−３−２−2404 (72)発明者 萬代 佳宣 大阪府八尾市南木ノ本２−77−14 Ｆターム(参考） 4C081 AB05 BA13 CD052 DA01 DA15 4C090 AA05 BA45 BB17 BB69 BD36 BD42 CA35 DA24

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ポリエチレングリコールのカルボキシル
    末端に２個以上の求電子性脱離基を有する多官能性架橋
    剤によって生理的条件下で均一に架橋形成した組織再生
    マトリックス用グリコサミノグリカン−ポリカチオン複
    合体。
  2. 【請求項２】 ポリエチレングリコールのカルボキシル
    末端に２個以上の求電子性脱離基を有する多官能性架橋
    剤を用い、架橋剤濃度０．３〜３ｍＭでグリコサミノグ
    リカンとポリカチオンとを生理的条件下で均一に架橋形
    成を行いグリコサミノグリカン−ポリカチオン複合体を
    合成することを特徴とする請求項１記載のグリコサミノ
    グリカン−ポリカチオン複合体の製造法。
  3. 【請求項３】 細胞をあらかじめ混合しておき、均一に
    架橋反応を行うことを特徴とする請求項２記載のグリコ
    サミノグリカン−ポリカチオン複合体の製造法。
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