KR20020080339A - 가역성 가교결합된 히드로겔 - Google Patents

Abstract

본 발명은 히드로겔 조성물, 그의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 히드로겔 조성물은 산화된 폴리사카라이드, 및 2개 이상의 관능성 가교결합기를 갖는 가교결합제를 포함한다. 가교결합제는 폴리사카라이드와 가역적으로 가교결합하며, 결합되어 있지 않은 가교결합을 제공하는 양으로 제공된다. 히드로겔을 제조하는 방법은 산화된 폴리사카라이드를 제공하는 단계 및 2개 이상의 관능성 가교결합기를 갖는 가교결합제를 제공하는 단계를 포함한다. 가교결합제가 폴리사카라이드와 가역적으로 가교결합하며 결합되어 있지 않은 가교결합제를 갖는 히드로겔을 제조하기에 충분한 가교결합제 농도에서 이러한 가교결합제를 폴리사카라이드와 혼합한다. 히드로겔은 예를 들어 조직 처리, 세포 이식 및 약물 전달 분야에 있어서 유용하다.

Description

가역성 가교결합된 히드로겔 {REVERSIBLE CROSS-LINKED HYDROGELS}

본원은 1999년 11월 26일 출원된 미국 가출원 번호 제60/167,632호를 우선권으로 주장한다.

미국 연방정부에서 후원받은 연구 또는 개발에 대한 설명

본 발명은 미국 국립보건원 (NIH)의 승인 (승인 번호 제R01 DE13033호)하에 일부 지원받은 연구 과정 중에 수행되었다. 미국 정부는 본 발명에 대해 일정한 정도의 권리를 갖는다.

함수 히드로겔은 식품 첨가제, 혈액 접촉 물질, 생접착제, 콘택트 렌즈, 상처 드레싱, 인공 장기, 약물 전달, 조절 방출형 제제, 멤브레인, 초흡수제, 셀 캡슐화 및 면역격리 물질, 및 약물을 포함한 생활성제 전달용 운반체를 비롯하여 다양한 용도를 갖는다. 이들의 생체적합성은 이들의 수분 함량 및 주변 생물 환경과의 낮은 계면장력과 관련이 있을 수 있다. 히드로겔에 대한 가장 최근의 적용 중 하나는 조직 공학 연구에서 세포 전달용 운반체로서의 용도이다. 이러한 연구의 목적은 세포외 간질의 기능을 모방하여 3차원적으로 설계한 합성 매트릭스를 사용하여 조직 및 기관을 복구하는 것이며, 새로운 조직 또는 기관을 필요로 하는 대상에게 하나의 대안을 제시한다. 히드로겔은 체내에서 고도로 수화된 거대분자류 물질과 유사하기 때문에 연조직 공학 분야에서 유력한 물질일 수 있다. 이러한 분야에서 사용되는 히드로겔의 중요한 특성으로는 이들의 분해 시간 및 기계적 특성이 포함된다. 통상적으로는, 새로운 조직의 형성 속도에 대하여 히드로겔의 분해 속도를 조절하는 것이 바람직하며, 이 시간은 여러 조직에서 상당히 달라질 수 있다. 이러한 물질의 기계적 특성은 생체내에서 새로운 조직이 형성되는 공간을 형성하고 유지하는 이들의 능력에 있어서 중요하며, 세포가 부착하는 물질의 기계적 특성은 세포의 유전자 발현을 조절할 수도 있다. 히드로겔의 형성에 있어서는 합성 및 천연 유래의 많은 물질을 사용할 수 있다. 히드로겔의 형성에서 폭넓게 사용되는 물질의 하나는 해초로부터 유래하는 친수성 폴리사카라이드인 알기네이트 (alginate)이다. 알기네이트는 β-D-만뉴론산과 α-L-굴루론산의 천연 공중합체의 한 군을 구성한다 (문헌 (Martinsen et al., Biotechnology and Bioengineering, 33 : p. 79-89 (1989) ; Draget et al., Carbohydrate Polymers, 14 : p. 159-178 (1991)) 참조).

히드로겔의 특히 유망한 한가지 용도는 조직 공학에서의 용도이다. 조직 공학은 이식가능성이 적은 기관에 의존하기 보다는 생물 조직을 새로 형성하는 쪽으로 향하고 있다. 비-세포성 물질의 세포외 간질 (ECM)은 인간을 비롯한 많은 다세포 생물에서 확인되었다. ECM 분자로는 특정의 당단백질, 프로테오글리칸 및 복합 탄수화물이 포함된다. 매우 다양한 ECM 구조가 확인되었으며, ECM은 조직의 형성과 관련이 있었다. 간단히 말해서, 조직 공학의 방법은 "스캐폴드 (scaffold)"라고도 불리우는, 체내의 ECM을 모방한 합성의 (예를 들어, 중합성) 3차원 매트릭스를 사용하여 생체내에서 조직이 새로 형성되는 공간을 제공함으로써 조직 및 기관을 복구하는 것이다. 알기네이트는 고도의 생체적합성을 나타내고 양이 풍부하며 비용이 저렴하기 때문에 조직 공학뿐만 아니라 다른 분야에서 사용하기에도 충분히 적합하다.

조직 공학 분야에서의 히드로겔의 용도는 특히 히드로겔의 분해 시간 및 기계적 특성에 따라 좌우된다. 알기네이트가 각종 생체의학 분야에 쓰이는 히드로겔을 제조하는데 널리 사용되기는 하지만, 이온 가교결합된 알기네이트 히드로겔은 조절되지 않는 기계적 특성 및 분해 양상을 나타낸다. 그러나 바람직하게는, 조직 공학에 사용되는 히드로겔은 예를 들어 새로운 조직의 형성에 요구되는 한 적어도 조직 생성 "스캐폴드"로서 존속된다. 또한, 이러한 히드로겔에 통상적으로 사용되는 알기네이트의 분자량은 인간 신장의 제거 한계치보다 더 크기 때문에, 분해된 히드로겔은 인간의 신장에 의해 처리될 수 없다.

약물 및(또는) 세포의 전달을 위한 주입가능한 형태의 히드로겔의 사용은 또한 이로운 용도를 갖는다. 이러한 물질을 주입하여 환자의 고통과 전달 비용을 최소화할 수 있다.

통상적으로 히드로겔의 분해는 가교결합 밀도의 기능 중 하나인 것으로 생각되기 때문에, 히드로겔이 급속하게 분해되는 문제에 대한 한가지 해결책으로서 높은 가교결합 밀도를 특징으로 하는 히드로겔을 형성하였다. 그러나, 고도로 가교결합된 히드로겔은 특히 생체의학 분야에서 바람직하지 못한 특징인 기계적 강직성을 나타낸다.

바람직한 기계적 특성 및 분해 특징을 모두 갖는 히드로겔 조성물이 요구된다.

<발명의 개요>

가교결합제 상의 일부 결합 부위가 처음에는 중합체에 결합되어 있지 않지만, 다른 가교결합의 분해를 통해 이러한 부위가 이용가능하게 됨에 따라 중합체 상의 다른 부위에 결합할 수 있도록, 과량의 가역성 가교결합제를 갖는 본 발명의 히드로겔 조성물이 제공된다. 중합체에 결합된 하나 이상의 부위 및 가역성 결합에 대해 개방된 하나 이상의 부위를 갖는 가교결합제는 결합되어 있지 않은 가교결합제 또는 댕글러 (dangler)라고 한다. 당업계의 종래의 개념에 따르면 댕글러는 이들이 부착된 중합체의 부위를 차단하기 때문에 결합되어 있지 않은 이러한 가교결합은 이롭지 않으며, 방지되어야 한다는 것이었다. 그러나, 본 발명자들은 이와 같은 종래의 생각에 의한 단점을 본 발명에 따른 이로운 용도로 이르게 하는 방법을 알아내었다. 본 발명의 히드로겔의 경우, 가교결합될 수 있는 부위는 댕글러에 의한 차단으로 인해 모두 가교결합될 수 있는 것은 아니기 때문에, 결합되어 있지 않은 가교결합을 제공하여 기계적인 강직성이 보다 적은 히드로겔을 형성시키는 것이 이롭다.

놀랍게도, 분해에 대한 안정성은 기계적 강직성이 저하될수록 상응하게 감소되는 것은 아닌 것으로 밝혀졌다. 가교결합 부위가 분해됨에 따라, 결합되어 있지않은 가교결합은 새로운 가교결합을 형성하며, 따라서 분해 속도를 조절하여 늦춘다. 따라서, 본 발명은 기계적 강직성이 분해 특성과 일치하거나 결부될 필요가 없는 히드로겔을 형성한다. 특정 실시양태에서, 바람직한 낮은 분해도를 갖지만 바람직하지 못한 높은 기계적 강직성은 갖지 않는 히드로겔이 제공된다. 이러한 히드로겔은 조작, 투여 및(또는) 이식하기에 과도하게 단단한 것은 아니지만 그의 기능이 유지될 때까지는 여전히 분해에 대한 저항성을 갖는 히드로겔이 요구되는 경우의 약물 전달 및 조직 공학 분야에 있어서 특히 유용하다.

따라서, 본 발명은 개선된 중합성 히드로겔 조성물 및 그의 제조 방법, 특히 히드로겔 중합체, 바람직하게는 산화된 폴리사카라이드, 및 히드로겔 시스템에서 폴리사카라이드와 가역적으로 가교결합할 수 있는 2개 이상의 관능기를 갖는 가교결합제를 하나 이상 포함하는 히드로겔 조성물에 관한 것이다. 가교결합제는 상기 기술된 바와 같이 결합되어 있지 않은 가교결합을 갖도록 제공된다. 예시적인 히드로겔에서, 히드로겔 중합체는 알데히드기를 갖는 합성 또는 천연 유래의 알기네이트 중합체를 포함하는 폴라사카라이드이며, 가교결합제는 2개 이상의 히드라지드기를 갖는 것, 예를 들어 아디프산 디히드라지드 (AAD)이다. 히드로겔은 바람직하게는 중합체와 가역적으로 가교결합할 수 있는, 결합되어 있지 않은 많은 가교결합제를 갖기 때문에, 본 발명의 히드로겔 조성물은 그보다 더 높은 가교결합 밀도를 가지고(가지거나) 결합되어 있지 않은 가교결합제가 전혀 없는 히드로겔에 비해 대단히 향상된 분해 특징 및 향상된 기계적 특성을 나타낸다.

상기에 나타낸 바와 같이, 히드로겔 중합체는 바람직하게는 산화된 폴리사카라이드, 특히 알기네이트이다. 바람직하게는, 이러한 알기네이트 중합체로는 알긴산의 칼슘염, 나트륨염 또는 칼륨염, 또는 프로필렌 글리콜 알기네이트를 비롯하여 임의의 여러 알긴산 유도체가 포함되며, 가장 바람직하게는 높은 굴루로네이트 함량을 갖는 알기네이트 염이 포함된다. 가교결합제는 바람직하게는 중합체와 가역적으로 가교결합할 수 있는 2개 이상의 관능기, 바람직하게는 2개 이상의 히드라지드기를 포함하며, 가장 바람직하게는 가교 결합제는 AAD를 포함한다. 히드로겔에 대한 유용한 중합체 및 가교결합제의 다른 예는 1998년 3월 26일 공개된 WO 98/12228에 참고로 제공되어 있다.

히드로겔 중합체와 가교결합제는 결합되어 있지 않은 가교결합제가 존재하여 고밀도의 가교결합이 차단되도록 과량의 가교결합제를 제공하는 양으로 혼합된다.

결합되어 있지 않은 단일-말단의 가교결합제에 대한 히드로겔의 가교결합 효율은 20 내지 90%, 보다 바람직하게는 20 내지 80%, 20 내지 70%, 또는 30 내지 50%의 범위인 것이 바람직하다. 결합되어 있지 않은 가교결합제의 생성은 과량의 가교결합제의 사용에 의해 상당히 촉진된다. 또한, 히드로겔의 형성은 염 용액에서 수행되는 것이 바람직하다. 이러한 용액은 바람직하게는 NaCl을 0.01 내지 20 g/l (보다 바람직하게는 2.0 내지 10.0 g/l) 포함하며, 임의로 하기 성분 중 하나를 추가로 포함할 수 있다.

CaCl₂0.01 내지 1.0 (바람직하게는 0.1 내지 0.5) g/L;

KCl 0.01 내지 2.0 (바람직하게는 0.2 내지 1.0) g/L;

NaH₂PO₄ㆍH₂O 0.01 내지 1.0 (바람직하게는 0.05 내지 0.5) g/L; 또는

MgSO₄0.01 내지 1.0 (바람직하게는 0.05 내지 0.5) g/L.

히드로겔 중합체는 생체의학 분야에 적합하도록 저 분자량 (Mw)을 갖는 것이 바람직하다. 그러나, 50,000 달톤 이하의 분자량을 갖는 히드로겔을 사용하는 경우도 가능하다. 1,000 내지 30,000, 또는 1,000 내지 10,000의 분자량 (Mw)을 갖는 히드로겔이 보다 바람직하다. 필요하다면, 산 가수분해 및 산화 등의 방법에 의해 분자량을 조절할 수 있다. 설명된 예에 따라, 알기네이트 물질은 산 조건하에 가수분해되어 비교적 낮은 분자량 (예를 들어, Mw는 약 7,000임)의 소듐 폴리(굴루로네이트) (PG)를 생성한다. 이어서, 과요오드산나트륨에 의해 PG 침전물을 산화시켜 알기네이트 중합체인 PAG (예를 들어, Mw는 약 5,700임)를 제조한다. 이어서, 이러한 PAG 중간체를 상기 논의된 방식으로 AAD와 같은 적합한 가교결합제와 가교결합시켜, 결합되어 있지 않은 가교결합제를 갖는 히드로겔을 제조한다.

생성된 PAG 히드로겔은 그보다 더 높은 가교결합 밀도 (예를 들어, 약 16.0 ×10⁵mol/cm³이상)를 갖는 PAG 히드로겔보다 더 높은 정도의 팽윤도 (Q) 및 더 낮은 강성률 (G)을 나타내었다. 바람직한 팽윤도 (Q)는 1 내지 200, 보다 바람직하게는 5 내지 100이다. 바람직한 강성률 (G)은 0.005 내지 200 kPa, 보다 바람직하게는 0.05 내지 100 kPa이다.

히드로겔은 또한 시간에 따른 증가된 안정성, 즉 더 느린 분해를 특징으로 한다. 결합되어 있지 않은 가교결합과 가역적으로 가교결합시킴으로써 부여되는이러한 지연된 분해 특징을 갖는 히드로겔은 조직 공학적 세포 이식 및 약물 전달 등의 생체의학 분야를 비롯한 수많은 분야에 충분히 적합하다. 유용한 분야에 대한 추가의 논의는 1998년 3월 26일 공개된 WO 98/12228에 참고로 제공되어 있다.

본 발명은 중합체 히드로겔 조성물, 그의 제조 및 이용 방법, 특히 중합체와 가역적으로 가교결합할 수 있는 2개 이상의 관능기를 갖는 가교결합제를 특징으로 하는 히드로겔에 관한 것이다. 또한, 히드로겔은, 두 부위가 결합되어 있지 않은 가교결합제가 단일한 가교결합제에 의해 가교결합될 수 있는 부위를 차지하고 있기 때문에, 잠재적으로 가교결합가능한 일부 부위가 가교결합되어 있지 않도록 하는 정도의 가교결합을 특징으로 한다. 이러한 히드로겔은 종래의 히드로겔 시스템에 비해 개선된 기계적 특성 및 지연된 분해를 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, "히드로겔"이라는 용어는 물을 포함하는 가교결합된 친수성 중합체의 3차원 네트워크를 의미한다. 반드시 그러한 것은 아니지만, 히드로겔은 바람직하게는 겔로 한정된다. 히드로겔은 순 (net) 양전하 또는 음전하를 갖거나 또는 중성일 수 있다.

"가교결합하는" 및 그의 형성이라는 용어는 본원에 사용된 바와 같이 화학 결합에 의해 쇄의 어떤 원자에 결합하는 원소, 기 또는 화합물로 구성되는, 가교에 의한 중합체 분자의 두 쇄의 부착을 의미한다. 가교결합은 자연적으로도 형성될 수도 있고 인공적으로 형성시킬 수도 있다. 또한, 단일한 중합체 분자 상의 두 부위 사이의 내부 가교결합도 가능하다.

"가교결합제"라는 용어는 본원에 사용된 바와 같이 중합체 쇄들 사이에 가교결합을 형성시키는 원소, 기 또는 화합물을 의미한다.

"결합되어 있지 않은 가교결합제" 또는 "댕글러"라는 용어는 히드로겔 중합체에 결합된 하나 이상의 부위, 및 자유로운 상태로 있거나 나중에 중합체에 결합할 수 있는 하나 이상의 부위를 갖는 가교결합제를 의미한다.

"가역적으로 가교결합하는" 및 그의 형성이라는 용어는 본원에 사용된 바와 같이 분해가능한 히드로겔 시스템에서 시간에 따라 가교결합이 분해 및 재형성되는 현상을 의미한다.

본 발명은 히드로겔 조성물, 그의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

도 1은 PAG 및 150mM AAD와 가교결합된 PAG에 대한 시간에 따른 특징적인 적외선 흡수 밴드의 그래프이다.

도 2는 100mM (O), 150mM (□) 및 200mM (△) 농도의 AAD 가교결합제로 제조된 예시적인 PAG 겔에 대한 시간에 따른 중량 감소 (%)의 그래프이다.

도 3은 100mM (O), 150mM (□) 및 200mM (△) 농도의 AAD 가교결합제로 제조된 예시적인 PAG 히드로겔에 대한 시간에 따른 강성률 변화 (G/G_o)의 그래프이다.

도 4는 100mM (O), 150mM (□) 및 200mM (△) 농도의 AAD 가교결합제로 제조된 예시적인 PAG 히드로겔에 대한 시간에 따른 팽윤도 (Q/Q_o) 변화의 그래프이다.

도 5는 100mM (O), 150mM (□) 및 200mM (△) 농도의 AAD 가교결합제로 제조된 예시적인 PAG 히드로겔에 대한 시간에 따른 가교결합 밀도 (V _e /(V _e ) _o ) 변화의 그래프이다.

도 6은 예시적인 AG에 대한 강성률 (G) 대 팽윤도 (Q)의 그래프이다.

본 출원의 우선권으로 주장되는 1999년 11월 26일 출원된 미국 가출원 번호 제60/167,632호, 2000년 1월에 간행된 문헌 (K. Y. Lee et al., Macromolecules), 및 상기 또는 하기 언급된 다른 모든 특허, 출원 및 공개 문헌의 전체 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.

상기 내용 및 하기 실시예에서, 모든 온도는 보정되지 않은 채로 섭씨 온도로 기록되어 있으며, 달리 지시되지 않는 한 모든 부 및 비율은 중량을 기준으로 한다.

히드로겔 제조

요컨대, 히드로겔 중합체, 바람직하게는 알기네이트 중합체와 같은 산화된 폴리사카라이드를, 이 중합체와 가역적으로 가교결합할 수 있는 2개 이상의 관능기를 갖는 가교결합제와 상기 논의된 결합되어 있지 않은 가교결합을 형성시키는 양으로 제공하여 가교결합시켜 본 발명의 예시적인 히드로겔을 제조하였다. 예시적인 실시양태에서, 히드로겔 중합체는 히드라지드 관능기를 2개 갖는 가교결합제와 가교결합된 알기네이트이며, 생성되는 히드로겔이 결합되어 있지 않은 상당한 양의 가교결합제의 존재를 특징으로 하도록 상대적인 양으로 중합체와 가교결합제를 혼합한다. 플로리-레너 (Flory-Rehner) 방정식에 의해 측정한 바로는, 히드로겔은 바람직하게는 비교적 낮은 가교결합 밀도를 나타낸다. AAD와 가교결합된 폴리(알데히드 굴루로네이트) (PAG)를 포함하는 예시적인 히드로겔 시스템에서, 바람직한가교결합 밀도 (V_e)는 16.0 × 10⁵mol/cm³미만, 가장 바람직하게는 약 12.3 ×10⁵mol/cm³미만이다.

설명된 예에 따르면, 중합체 히드로겔은, 일반적으로 산성 조건하에 알기네이트를 가수분해하여 분리한 다음, 그로부터 폴리굴루로네이트 (PG)를 산화시켜 폴리(알데히드 굴루로네이트) (PAG)를 제조하고, PAG (20 중량% 용액)를 2개 이상의 히드라지드기를 갖는 가교결합제, 예를 들어 아디프산 디히드라지드 (AAD)와 가교결합시켜 히드로겔을 제조하였다. 가교결합제의 농도는 50 mM에서 250mM까지 달라진다.

히드로겔 중합체는 바람직하게는 산화된 폴리사카라이드, 예를 들어 프로노바 (PRONOVA (Drammen, Norway))사로부터 구입한 시판되는 소듐 알기네이트 (PROTANAL LF 20/60)와 같은 알기네이트를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 알기네이트는 굴루로네이트 단위가 중합체를 겔화하는 2가 양이온을 통해 이온 가교결합하는 부위를 제공하기 때문에 높은 굴루로네이트 함량을 특징으로 한다. 그러나, 본 발명에서는 다양한 알기네이트가 가능할 수 있을 것으로 생각된다. 본원에 사용된 용어인 "알기네이트"는 다수의 알긴산 유도체 (예를 들어, 알긴산의 칼슘염, 나트륨염 또는 칼륨염, 또는 프로필렌 글리콜 알기네이트) 중 어떤 것을 의미한다. 이러한 화합물은 합성되거나 또는 천연 유래의 것일 수 있다. 천연 및 합성 알기네이트는 둘 다 시판되거나 또는 제조할 수 있으며, 본원의 개시에 따른 본 발명의 히드로겔의 제조에서 대체시킬 수 있다. 천연 유래의 알기네이트는 통상의방법에 따라 해초 또는 박테리아로부터 유도될 수 있다 (문헌 (Biomaterials : Novel Materials from Bioloaical Sources, ed. Byrum, Alginates chapter (ed. Sutherland), p. 309-331 (1991)) 참조). 천연 유래의 알기네이트 및 합성 제조된 알기네이트는 둘 다 소정의 만뉴로네이트 대 굴루로네이트 비를 갖는 측쇄를 제공하도록 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 본 발명은 알기네이트 또는 임의의 특정한 중합체, 또는 이들의 특정 제조 방법에 제한되지 않는다. 예를 들어, 셀룰로스, 아가로스, 덱스트란, 풀룰란, 전분, 히알루로네이트 등을 비롯한 다수의 합성 폴리사카라이드 및 천연 유래의 폴리사카라이드 중 어떤 것도 예시적인 개시의 알기네이트를 대신할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 히드로겔을 제공하고 가교-결합될 수 있는 기타 생체적합성 중합체도 사용할 수 있다. 다수의 합성 중합체 및 단백질은 임의로 겔화 및(또는) 가교-결합을 촉진시키도록 변형시킨다.

본 명세서에 참고로 도입되는 문헌 (Haug et al., reported in Acta. Chem. Scand., 20 : p. 183-190 (1966))의 방법에 따라 예시적인 히드로겔용으로 PAG를 제조하였다. 이 방법에 따라, 알기네이트 물질을 산 가수분해시켜 만뉴로네이트와 굴루로네이트 잔기 사이의 β-글리코시드 결합을 분해함으로써, 본질적으로 만뉴론산 단위가 없는 저분자량 PG를 얻는다. 이어서, 상기 PG를 pH 2.85에서 단리하고, 크기 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography (SEC))로 상기 PG의 분자량 (Mw)이 7,000 (Mw/Mn=1.60)임을 확인하였다. SEC는 레이저 굴절계 (LR40, VISCOTEK), 감별 점도계 및 RALLS (T60, VISCOTEK)를 포함하는 삼중 검출 시스템상에서 수행하고, 0.1 M NaNO₃완충용액 (pH 6.3)을 유속이 0.7 ml/분인 이동상으로 사용하였다. 두 가지 TSK-겔 컬럼 (G4000PW_XL및 G3000PW_XL)을 분리에 사용하였다.

PG 침전물은 활성화된 탄소가 첨가된 중성 pH의 2차 증류수에 용해시켜 더 정제하였다. 생성된 용액을 철저히 교반하고, 활성화된 탄소를 여과하여 제거하고, PG를 에탄올로 침전시키고 동결건조하였다.

단리된 PG를 0.25 M의 과요오드산나트륨 (ALDRICH, Milwaukee, WI)으로 실온에서 산화하여 PAG를 제조하였다. 굴루로네이트 단위와 과요오드산염 사이의 비는 1:1이었다. 산화한지 19시간 후, 등몰량의 에틸렌 글리콜을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 생성된 용액을 여과하고 에탄올로 침전시켰다. 모은 침전물을 2차 증류수에 다시 용해시키고 3일 동안 투석한 후 (MWCO 1000, SPECTRA/POR), 용액을 감압 하에 농축시키고 동결건조하였다. PAG의 Mw는 SEC로 측정시 5,700 (Mw/Mn = 1.64)이고, PAG 중의 알데히드기의 수를 측정하여 확인한 산화도는 66.5% (100개의 굴루로네이트 단위 당 산화된 굴루로네이트 잔기의 수로 정의됨)이었다. 이 측정은 과량의 t-부틸 카바제이트를 PAG 용액에 첨가하고, 트리니트로벤젠 술폰산 (TNBS) 용액을 첨가하여 비반응된 t-부틸 카바제이트의 양을 측정함으로써 달성하였다 (t-부틸 카바제이트와 TNBS의 착물은 334 nm에서 분광광도계로 정량함).

바람직하게는, 이렇게 제조된 히드로겔 중합체 물질의 분자량은 인간이든 아니면 다른 숙주이든지 관계없이 숙주에 의한 신장의 제거율 역치이거나 또는 이 역치 미만이고, 분자량의 감소는 예시적인 알기네이트 중합체에 대해 상술한 산화 반응에 의해 영향을 받을 수 있다.

당업자는 본원의 예시적인 히드로겔을 위한 히드로겔 중합체의 제조 방법이 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니고, 상기 방법 및 기타 공지된 방법에 따라 제조된 바람직한 산화된 폴리사카라이드를 포함하는 각종 중합체를 본 발명에 따라 히드로겔 시스템에서 대체시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.

이렇게 얻은 PAG를 이관능성 가교-결합제인 다양한 양의 AAD (ALDRICH, Milwaukee, WI)와 가교결합시켰다. PAG와 AAD의 가교-결합은 촉매 또는 첨가제의 부재 하에 일어나는데, 이는 알데히드기가 카르복실기에 비해 히드라지드기에 대해 훨씬 더욱 강한 반응성을 보이는 것으로 알려져 있기 때문이다. AAD가 예시적인 히드로겔에 바람직한 가교-결합제이지만, 다른 바람직한 가교-결합제에는 히드로겔 중합체를 가역적으로 가교-결합시킬 수 있는 2개 이상의 관능기를 갖는 화합물이 포함된다. 바람직한 관능기는 히드라지드기이고, 임의의 다중-히드라지드 가교-결합제도 본 발명에 적합할 것이다. 그러나, 관능기는 사용된 히드로겔 중합체와 같은 인자에 따라 다양할 수 있음을 알 것이다. 가교-결합제는 예를 들어, 아민기를 포함할 수 있다. 알데히드 및 다중-히드라지드 관능기를 포함하는 히드로겔 시스템에서, 중합체 및 가교-결합제의 관능기는 예시적인 히드로겔과 반대일 수 있다. 즉, 가교-결합제는 알데히드 관능기를 포함할 수 있지만, 히드로겔 중합체는 히드라지드기를 포함한다.

예시적인 히드로겔의 형성에서, 20 중량%의 PAG 용액을 50 mM 내지 250 mM 농도의 AAD와 혼합하였다. 이러한 모든 용액은 혼합하기 전에 pH를 7.4로 맞춘 둘베코스 변형 이글스 배지 (DMEM) (LIFE TECHNOLOGIES, Grand Island, NY) 중에서 제조하였다. 히드로겔 중의 PAG의 최종 농도는 6 중량%로 고정시켰다. 히드로겔 용액을 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고 실온에서 4시간 동안 인큐베이션하여 히드로겔을 형성시켰다. 알데히드와 히드라지드기의 커플링은 KBr 펠렛 방법 (32회의 스캔 반복시 2 cm^-1의 해상도)을 이용하여 AVATAR 360 분광광도계 (NICOLET, WI) 상의 FP-ir-스펙트럼으로 확인하였다. 커플링시, 1735 cm^-1에 있는 알데히드기의 특징적 대칭 진동 밴드가 사라지고, 1658 cm^-1에 있는 히드라존 밴드가 나타난다.

AAD와 공유 가교-결합된 PAG, 즉 예시적인 히드로겔의 화학적 구조는 하기와 같다.

실험 결과

AAD를 50 mM 내지 250 mM의 다양한 농도의 가교-결합제로 사용하여 48 가지의 히드로겔을 상기한 방법에 따라 제조하였다. 이렇게 형성된 모든 히드로겔을37℃에서 DMEM (pH 7.4)에 24시간 동안 침지시켜 수화를 완결시킨 후 분해 및 기계적 특성을 평가하였다.

50 mM의 AAD 농도에서 생성된 히드로겔은 매우 약하고 수화가 완결되기 전에 붕괴되었다.

250 mM의 AAD 농도에서, 히드로겔은 형성되지 않았는데, 이는 아마도 PAG에 비해 가교-결합 분자가 너무 많기 때문인 것으로 추측된다. 결합되어 있지 않은 단일-말단의 가교-결합 분자가 너무 많으면 임의의 유의적 가교결합이 방해된다는 이론이 있다.

100 mM 내지 200 mM 농도의 AAD를 사용하여 형성한 PAG 히드로겔을 유효한 가교결합도, 분해 거동 및 기계적 특성에 대해 시험하였고, 분해 거동 및 기계적 성질은 시간에 따라 시험하였다. 전술한 바와 같이, 가교-결합된 PAG 히드로겔은 PAG 알데히드기와 AAD 히드라지드기 사이의 히드라존 결합에 상응하는 1658 cm^-1의 흡수 밴드를 특징으로 한다. 히드로겔이 분해되면, 히드라존 결합이 수성 매질의 존재 하에 가수분해된다. 이러한 히드라존 결합의 상실은 KBr 펠렛 방법 (32회의 스캔 반복시 2 cm^-1의 해상도)을 이용하여 FT-ir 스펙트럼에 의해 측정할 수 있는데, 이는 특징적인 히드라존 밴드에 의한 흡광도가 시간에 따라 점차적으로 더 약해지게 되기 때문이다. 도 1은 PAG, 및 150 mM 농도의 AAD와 가교-결합된 PAG 히드로겔을 나타내는데, (a)의 밴드는 PAG이고 (b)의 밴드는 PAG 히드로겔이고, (c)의 밴드는 분해된지 5일 후의 PAG 히드로겔이고, (d)의 밴드는 분해된지 15일 후의PAG 히드로겔이고, (e)의 밴드는 분해된지 29일 후의 PAG 히드로겔이다. 도 1의 화살표는 1658 cm^-1에 있는 히드라존 밴드를 나타낸다.

트리니트로벤젠 술폰산 용액 (TNBS)을 사용하여 유효한 가교결합도 (이중-말단), 가교결합 반응 동안의 펜던트기 (결합되어 있지 않은 단일-말단), 및 반응하지 않은 가교결합 분자를 결정하였다. 요컨대, 히드로겔을 합성하고, 동결건조한 후, TNBS 용액 (5.76 mM)으로 1시간 동안 처리하였다. 0.22 ㎛ 필터를 통해 이 혼합물을 여과하고, 여액을 이 분석에 사용하였다. 히드로겔 중의 반응하지 않은 AAD는 2 당량의 TNBS와 반응하여 가용성 착물을 형성한다. 착물 용액을 0.5 N HCl으로 희석하고, 그의 양을 334 nm에서 분광광도계로 측정하였다. 결합되어 있지 않은 단일-말단 AAD 분자는 1 당량의 TNBS와 착물을 형성하고, 이 경우 상기 착물은 히드로겔에 결합되어 있는 상태로 남아 있어 상기 용액에서 측정되지 않을 것이다. 그러므로, 과량의 AAD를 나중에 여액에 첨가하여 남아 있는 TNBS와 반응시켰다. 히드로겔에 결합된 착물의 양은 히드로겔에 처음 첨가된 TNBS의 총량에서 가용성 착물의 양을 감산함으로써 계산하였다. 사용된 AAD의 총량에서 반응하지 않은 AAD 및 단일-말단 AAD를 감산하여 표 1에 나타낸 바와 같은 가교-결합 효율을 산출하였다.

본 발명에 따라 형성된 예시적인 히드로겔의 기계적 강도는 MTS BIONIX 100 기계 시험기 (MTS SYSTEMS, France)를 사용한 압축 시험으로 압축 중의 탄성률을 얻음으로써 측정하였다. 변형률은 0.5 mm/분이고, 인덴터 (indentor)의 직경은3.15 mm이었다. 히드로겔의 강성률 (G)은 σ대 -(λ-λ²)의 기울기로 측정하였는데, 여기서, σ는 응력이고, λ는 문헌 [Treloar, Physics of Rubber Elasticity (Clarendon Press : Oxford, 1975), and Stainsby, Food Chemistry, 6 : p. 3 (1980), 상기 문헌 둘 다는 그 전체가 본 명세서에 참고로 도입됨]에 개시된 바와 같이 히드로겔의 변형 길이 : 비변형 길이의 비율이다.

이렇게 제조된 히드로겔의 팽윤도도 측정하였다. 상술한 바와 같이, 모든 히드로겔을 37℃에서 DMEM (pH 7.4)에 24시간 동안 침지시킨 후, 과량의 물을 제거하고 히드로겔의 중량을 측정하였다. 히드로겔의 팽윤도 (Q)는 하기 방정식을 사용하여 히드로겔 중 중합체의 부피 비율 (ν₂)의 역수로 정의된다.

상기 식에서, ρ_p는 중합체 밀도 (알긴산나트륨의 경우 0.87555 g/cm³)이고, ρ_s는 물의 밀도 (25℃에서 0.9971 g/cm³임)이고, Q_m은 흡수된 물과 건조된 히드로겔의 중량비로 정의된 팽윤비이다 [DeRossie et al., Polymer Gels Fundamentals and Biomedical Applications (Plenum Press, New York 1991)].

상기 방법에 따라 제조된 예시적인 히드로겔의 가교-결합 밀도는 하기 플로리-레너 (Flory-Rehner) 방정식으로 계산하였다.

상기 식에서,X ₁은 상호작용 파라미터이고,f는 가교-결합 관능도이고, ν₁은 물의 몰 부피 (18.062 cm³/mol)이고, ν₂는 히드로겔이 평형 팽윤 상태에 도달하였을 때 히드로겔 중 중합체의 부피 비율이다 [Bell et al., Biomaterials, 17 : p. 1203 (1996)].X ₁은 유사한 상호작용의 상기 모델링을 기초로 한 경우 0.35로 가정하고 [(Figuly et al., Macromolecules, 30 : p. 6174 (1997)], f는 4로 가정한다. 보다 높은 가교-결합 밀도는 히드로겔의 보다 더 단단한 기계적 성질 및 더 낮은 팽윤도에 상응한다.

표 1에는 100 mM 내지 200 mM 농도의 AAD를 포함하는 예시적인 PAG 히드로겔에 대한 특성 데이타가 기재되어 있다. 이 데이타에는 상기에서 모두 정의된 가교-결합 효율, 강성률 (G), 팽윤비 (Q_m), 팽윤도 (Q) 및 가교-결합 밀도 (V _e )가 포함된다.

강성률 (G) 및 팽윤 (Qm, Q) 데이타로 입증된 바와 같이, 초기의 가교-결합 밀도 (V _e )는 더 높지만 (즉, 100 mM 내지 150 mM의 AAD와 가교 결합된 히드로겔) 결합되어 있지 않은 단일-말단의 가교-결합제는 더 적은 PAG 히드로겔이 처음에는 더 단단한 기계적 성질 및 더 낮은 팽윤도를 나타내었다. 결합되어 있지 않은 단일-말단의 가교-결합제의 비율이 더 높을수록 PAG 히드로겔은 덜 단단한 초기 기계적 성질을 나타내었다.

분해 특성

알데히드와 히드라지드 사이의 반응이 매우 빠르기 때문에, 생성된 히드라존 결합은 가수분해되기 쉽고, 따라서 이렇게 형성된 임의의 히드로겔은 대량 부식에 의해 수성 매질 중에서 분해될 것이라고 예측된다. 그러나, 본 발명의 예시적인 히드로겔은 200 mM 농도의 AAD를 사용하여 형성되므로, 플로리-레너 방정식으로 측정할 때 16.0 x 10⁵mol/cm³미만의 보다 낮은 가교-결합 밀도를 특징으로 하지만, 결합되어 있지 않은 가교-결합제의 부분이 더 많을수록 이러한 더 낮은 가교 결합 밀도에도 불구하고 AAD의 농도가 100 mM 또는 150 mM인 비교 히드로겔보다 더 느린 분해를 나타내었다 (표 1). 위에서 요약한 방법에 따라 얻은, 이러한 놀랍고도 예측불가능한 결과는 다음과 같은 사실에 의해 입증되었다:

구체적으로, 히드로겔 건조 중량의 손실은 분해 시간의 함수로서 측정하였다 (도 2). AAD의 농도가 100 mM (O)인 PAG 히드로겔은 10일 이내에 100%의 중량 손실 (완전한 분해)을 나타내었지만, AAD의 농도가 150 mM (□)인 PAG 히드로겔은 30일 이내에 완전히 분해되었다. 그러나, AAD의 농도가 200 mM (△)인 히드로겔은 37℃, DMEM (pH 7.4) 중에서 6주 동안 인큐베이션한 후 조차도 최소한의 중량 손실 (<20%)을 나타내었다.

도 3은 100 mM (O) 및 150 mM (□)의 AAD로 가교-결합된 PAG 히드로겔의 비교예, 및 200 mM (△) 농도의 AAD를 사용하여 제조한 PAG 히드로겔의 강성률 (G/G_o)의 시간에 따른 변화를 나타낸다. 모든 히드로겔을 37℃, DMEM (pH 7.4) 중에서 인큐베이션하였다. 나타낸 바와 같이, 100 mM 및 150 mM의 AAD 히드로겔의 경우에는 기계적 강도가 급속히 상실되었지만, 본 발명의 200 mM AAD 히드로겔은 낮은 가교-결합 밀도 (표 1)에도 불구하고 평가 기간에 걸쳐 기계적 강도에 있어서 훨씬 더 작은 감소를 나타내었다.

도 4는 100mM (○), 150mM (□), and 200mM (△) 농도의 AAD로 가교-결합된 PAG 히드로겔에 대한, 시간에 따른 팽윤도 (Q/Q_o)의 변화를 나타낸다. 모든 히드로겔을 37℃, DMEM (pH 7.4) 중에서 인큐베이션하였다. 이들 데이타는 본 발명에 따라 제조된, 가교-결합 밀도가 낮은 히드로겔의 상대적 안정성을 반영한다. 특히, 100 mM 및 150 mM의 AAD로 가교-결합된 비교예의 히드로겔은 분해 과정에 걸쳐 증가된 팽윤도를 나타내었지만, 200 mM의 AAD로 가교-결합된 히드로겔은 유의한 변화를 나타내지 않았다.

도 5는 100mM (○), 150mM (□) 및 200mM (△) 농도의 AAD로 가교-결합된 PAG 히드로겔에 대한, 시간에 따른 가교-결합 밀도 (V _e /(V _e ) _o )의 변화를 나타낸다.이미 설명한 바와 같이, 가교-결합 밀도 (V _e )는 플로리-레너 방정식을 사용하여 계산하였다. 도 5의 경우, 이들 데이타는 AAD의 농도가 각각 100mM (○), 150mM (□) 및 200mM (△)인 히드로겔의 분해 후 강성률 (G)과 팽윤도 (Q) 사이의 비례 관계에 의해 지지되는데 (도 6), 이 관계는 플로리-레너 방정식의 이용을 정당화하는 가우스 탄성을 의미한다.

본 발명의 히드로겔의 향상된 분해 특성은 다중-히드라지드 가교-결합제 중에 결합되어 있지 않은 단일-말단의 가교-결합제 분자의 농도가 상대적으로 높기 때문에 생기는데, 상기 가교-결합제 분자는 초기 가교-결합의 가수분해 후 히드로겔 중합체의 가역적 가교-결합을 허용하여 시간에 따른 안정성을 보유한다. 과거에는, 가교-결합 밀도의 증가가 지연된 분해에 영향을 주어 바람직하지 못한 기계적 성질을 갖는 히드로겔을 생성시킨다고 생각하였지만, 본 발명은 중합체와 가역적으로 가교-결합할 수 있는 가교-결합제를 사용하여 히드로겔의 기계적 성질과 분해 성질을 분리하여, 기계적으로 비교적 "유연하며" 지연된 분해 특징을 갖는 히드로겔 및 이를 제조하는 방법을 제공한다.

Claims (19)

1. 히드로겔 중합체가 다른 히드로겔 중합체 분자와 상당한 정도로 가교결합하며, 또한 중합체에 결합되는 하나 이상의 관능기 및 이 중합체와 가역적으로 가교결합할 수 있는 하나 이상의 비결합된 관능기를 갖는 가교결합제를 상당한 정도로 포함하도록, 가교결합할 수 있는 2개 이상의 관능기를 갖는 과량의 가교결합제와 반응시킨 히드로겔 중합체를 포함하는 히드로겔 조성물.
2. 제1항에 있어서, 히드로겔 중합체에 결합된 하나 이상의 관능기 및 이 중합체와 가역적으로 가교결합할 수 있는 하나 이상의 비결합된 관능기를 갖는 가교결합제의 가교결합 효율이 20% 내지 90%인 조성물.
3. 제1항에 있어서, 히드로겔 중합체에 결합된 하나 이상의 관능기 및 이 중합체와 가역적으로 가교결합할 수 있는 하나 이상의 비결합된 관능기를 갖는 가교결합제의 가교결합 효율이 20% 내지 70%인 조성물.
4. 제1항에 있어서, 히드로겔 중합체에 결합된 하나 이상의 관능기 및 이 중합체와 가역적으로 가교결합할 수 있는 하나 이상의 비결합된 관능기를 갖는 가교결합제의 가교결합 효율이 30% 내지 50%인 조성물.
5. 제1항에 있어서, 히드로겔 중합체가 임의로 산화된 폴리사카라이드인 조성물.
6. 제1항에 있어서, 히드로겔 중합체가 임의로 가수분해 및(또는) 산화된 천연 또는 합성 알기네이트인 조성물.
7. 제6항에 있어서, 가교결합된 히드로겔이 1,000 내지 50,000 달톤의 중량평균분자량을 갖는 조성물.
8. 제6항에 있어서, 가교결합된 히드로겔이 1,000 내지 30,000 달톤의 중량평균분자량을 갖는 조성물.
9. 제6항에 있어서, 가교결합된 히드로겔이 1,000 내지 10,000 달톤의 중량평균분자량을 갖는 조성물.
10. 제1항에 있어서, 가교결합 이전의 히드로겔 중합체가 인간 신장의 제거 한계치 이하의 분자량을 갖는 조성물.
11. 제5항에 있어서, 가교결합제가 2개 이상의 히드라지드 관능기를 갖는 조성물.
12. 제5항에 있어서, 가교결합제가 아디프산 디히드라지드인 조성물.
13. 제1항에 있어서, 히드로겔의 초기 강성률이 0.005 내지 200 kPa인 조성물.
14. 제1항에 있어서, 히드로겔의 초기 강성률이 0.05 내지 100 kPa인 조성물.
15. 제1항의 히드로겔 조성물 함유 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 조직 공학, 세포 이식 또는 약물 전달 방법.
16. 제5항에 있어서, 폴리사카라이드가 알기네이트, 덱스트란, 풀룰란, 전분, 아가로스 또는 히알루로네이트인 조성물.
17. 제1항에 있어서, 가교결합제는 2개 이상의 알데히드기를 갖는 화합물이며, 히드로겔 중합체는 히드라지드기를 포함하거나 이 기를 포함하도록 변형된 중합체인 조성물.
18. 제1항에 있어서, 히드로겔 중합체가 합성 중합체인 조성물.
19. 제1항에 있어서, 히드로겔 중합체가 변형된 단백질인 조성물.