CN105148325B - 一种新的角膜组织修复材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的角膜组织修复材料及其制备方法。该制备方法包括以下步骤：1）柠檬酸溶液和胶原溶液的制备；2）将柠檬酸溶液和胶原溶液配制成共混溶液，加入交联剂进行交联，在2～6℃条件下，水浴锅中搅拌2～5小时，再在室温下搅拌20～30小时，除去气泡；3）将步骤2）中的溶液倒入模具，室温风干成膜，得到胶原膜；4）脱除模具，取出胶原膜，用水多次洗涤，室温下自然风干。本发明的角膜组织修复材料具有优异的光学透过性、含水性能、离子通过性、生物相容性、力学性能、抗降解性能，原料廉价易得、制备工艺简单、设备简易，可用于医疗领域中受损角膜组织的修复和替代，具有良好的应用前景和科学价值。

Description

一种新的角膜组织修复材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种新的角膜组织修复材料及其制备方法，本发明所得的材料可应用于受损角膜组织的修复和替代，属于生物医用材料领域。

背景技术

角膜疾病是一种十分常见的眼科病，世界上大约有1000万人是由于角膜病致盲的。现在唯一广为接受的治疗方法是用人的角膜供体进行移植。因此，这些角膜疾病患者必须通过手术用供体的健康角膜来替代其损伤角膜。但是，由于供体捐赠的角膜数量远少于角膜移植的需求量，所以人工角膜的研发就显得十分必要。

角膜内部不存在血管，这样就可以使角膜拥有良好的光学透过性能，其所需营养物质主要由角膜缘血管网和渗透作用提供，所以角膜修复材料应该具有良好的含水率、透光性和离子透过率。在手术时需要一定的耐缝合强度，所以修复材料还需要良好的力学性能。在术后，材料需要在体内实现上皮化，完成良性修复，故需要优良的生物相容性。由于不同病例的情况不同，还需要材料在制备的过程中实现大小可控性。

目前的角膜组织修复材料主要包括羊膜、合成的高分子材料如聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸酯、多孔聚四氟乙烯等、脱细胞角膜基质、纯天然可降解材料。柠檬酸（CA）为一种常见的有机酸，含有三个羧基，具有很好的化学反应活性。柠檬酸无毒，在实际生活和生产中有着广阔的用途，广泛应用于食品工业、化工和纺织业、禽畜生产、化妆品和医药领域。胶原（Col）是细胞外至关重要的纤维蛋白，也是组成细胞外基质的骨架。胶原在细胞外基质中构成半晶体的纤维，给细胞供应抗张力和弹性，并在细胞的迁移、发育中起作用，且胶原在各种动物中都有存在。胶原是生物科技产业最重要的原材料之一，其应用领域包括生物医用材料、化妆品和食品工业等。

好的角膜修复材料不仅要在理化性能上满足要求，还要在实际修复中达到良好的上皮与基质修复效果。在角膜损伤发生后，角膜修复材料应该能实现上皮修复，即上皮化，还应实现阻隔角膜上皮细胞和角膜基质细胞的交汇，从而防止角膜瘢痕的产生，使修复后的角膜清澈、透明，随着材料的逐步降解，最终实现角膜的修复。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的角膜组织修复材料及其制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种新的角膜组织修复材料的制备方法，包括以下步骤：

1)将柠檬酸用水配制成柠檬酸溶液，将胶原用盐酸溶液或乙酸溶液配制成胶原溶液；

2)将柠檬酸溶液和胶原溶液配制成共混溶液，加入交联剂进行交联，在2～6℃条件下，水浴锅中搅拌2～5小时，再在室温下搅拌20～30小时，除去气泡；

3)将步骤2）中的溶液倒入模具中，于室温下自然风干成膜，得到胶原膜；

4)脱除模具，取出胶原膜，用水多次洗涤，于室温下自然风干，即得到角膜修复材料。

步骤1）中所用胶原为从牛肌腱中提取的经纯化过的I型胶原。

步骤1）中所述的柠檬酸溶液的质量体积浓度为35～45mg/ml。

步骤1）中所述胶原溶液的质量体积浓度为6.5～7.0mg/ml。

步骤1）中所述盐酸溶液的摩尔浓度为0.001～0.01mol/L。

步骤1）中所述乙酸溶液的摩尔浓度为0.05～0.15mol/L。

步骤2）中所述的共混溶液中，柠檬酸与胶原的质量比为（3～10）:100。

步骤2）中所述交联剂为1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的混合物，1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺的质量比为（1～2）:1。

步骤2）中所述胶原、1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺的质量比为6:（1～2）。

本发明的有益效果是：

1)本发明的角膜组织修复材料具有层状结构，光学透过性好、含水性能好；

2)本发明的角膜组织修复材料的离子通过性能优异，便于营养物质的透过和运输，保证上皮细胞生长的需要；

3)本发明的角膜组织修复材料的生物相容性良好，角膜上皮细胞可以在本材料上粘附、增殖和分泌细胞外基质，使材料上皮化；

4)本发明的角膜组织修复材料的力学性能良好，用手术线进行缝合时不会造成撕裂；

5)本发明的角膜组织修复材料的抗降解性能良好，可以缓解、阻止角膜上皮细胞向基质层迁移，从而降低、减缓瘢痕修复的发生，实现基质层更为透明的良性修复；

6)本发明的角膜组织修复材料可用于医疗领域中受损角膜组织的修复和替代，其原料廉价易得、制备工艺简单、设备简易，具有良好的应用前景和科学价值。

附图说明

图1 实施例1的Col-CA胶原膜断面的扫描电子显微镜（SEM）照片。

图2 实施例1的Col-CA胶原膜的力学性能测试结果。

图3 实施例1的Col-CA胶原膜在胶原酶环境下体外降解性能测试结果。

图4 人角膜上皮细胞在实施例1的Col-CA胶原膜表面生长的光学显微镜照片（×50）。

图5 人角膜上皮细胞在实施例1的Col-CA胶原膜表面生长的H&E（苏木精-伊红）染色切片图（×400）。

图6 实施例1的Col-CA胶原膜进行兔体内板层角膜移植术3个月后修复情况照片。

图7 实施例1的Col-CA胶原膜进行兔体内板层角膜移植术2周后上皮化效果检测照片。

图8 实施例1的Col-CA胶原膜进行兔体内板层角膜移植术3个月后角膜平整度检测照片。

图9 实施例1的Col-CA胶原膜进行兔体内板层角膜移植术后角膜的H&E（苏木精-伊红）染色切片图（×350）。

图10 实施例1的Col-CA胶原膜进行兔体内板层角膜移植术后的OCT基质扫描图像。

具体实施方式

一种新的角膜组织修复材料的制备方法，包括以下步骤：

1)将柠檬酸用水配制成柠檬酸溶液，将胶原用盐酸溶液或乙酸溶液配制成胶原溶液；

2) 将柠檬酸溶液和胶原溶液配制成共混溶液，加入交联剂进行交联，在2～6℃条件下，水浴锅中搅拌2～5小时，再在室温下搅拌20～30小时，除去气泡；

3)将步骤2）中的溶液倒入模具中，于室温下自然风干成膜，得到胶原膜；

4)脱除模具，取出胶原膜，用水多次洗涤，于室温下自然风干，即得到角膜修复材料。

优选的，步骤1）中所用胶原为从牛肌腱中提取的经纯化过的I型胶原。

优选的，步骤1）中所述的柠檬酸溶液的质量体积浓度为35～45mg/ml。

优选的，步骤1）中所述胶原溶液的质量体积浓度为6.5～7.0mg/ml。

优选的，步骤1）中所述盐酸溶液的摩尔浓度为0.001～0.01mol/L。

优选的，步骤1）中所述乙酸溶液的摩尔浓度为0.05～0.15mol/L。

优选的，步骤2）中所述的共混溶液中，柠檬酸与胶原的质量比为（3～10）:100。

优选的，步骤2）中所述交联剂为1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺（EDC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）的混合物。

优选的，所述1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺的质量比为（1～2）:1。

优选的，步骤2）中所述胶原、1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺的质量比为6:（1～2）。

下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释和说明。

实施例1：

1）将纯化后的柠檬酸（CA）用去离子水配制成浓度为42mg/ml的柠檬酸溶液，将从牛筋中提取的Ι型胶原，用0.001mol/L的盐酸溶液配制浓度为6.5mg/mL的胶原溶液；

2）按照柠檬酸与胶原的质量比为3:100配制两者的共混溶液，加入EDC-NHS溶液（EDC、NHS的质量比为1:1）进行交联，柠檬酸-胶原共混溶液中的胶原与EDC的质量比为6:1，将加入交联剂后的溶液在4℃冰箱中搅拌反应4小时，再在室温下搅拌24小时，除去气泡；

3）将步骤2）中的溶液倒入模具中，于室温下自然风干成膜，得到胶原膜；

4) 脱除模具，取出胶原膜，用去离子水进行多次洗涤，在室温下自然风干，即得到角膜修复材料。

通过对实施例1中的Col-CA胶原膜材料进行理化性能表征，可以得出以下结论：

由图1可知，Col-CA胶原膜材料呈层状结构；

由图2可知，Col-CA胶原膜材料与Col材料和交联后的Col材料相比，其拉伸强度有所提高；

由图3可知，Col-CA胶原膜材料的降解速率缓慢，24小时后，剩余质量还在50%以上，而Col材料和交联后的Col材料的剩余质量均在20%以下，Col-CA胶原膜材料的抗降解性能有显著提升；

由图4和图5可知，人眼角膜上皮细胞在Col-CA胶原膜材料表面稳定增殖，紧密地贴附于材料表面并且保持细胞正常的多角形貌；

由图6可知，Col-CA胶原膜材料进行兔体内板层角膜移植术后，手术区域已经恢复透明性，修复观察情况优异；

由图7可知，Col-CA胶原膜材料进行兔体内板层角膜移植术后2周内即实现上皮化；

由图8可知，Col-CA胶原膜材料进行兔体内板层角膜移植术3个月后，角膜较为平整，术后修复效果良好；

由图9可知，Col-CA胶原膜材料进行兔体内板层角膜移植术后，角膜基质层已经实现修复，并且有新的基质和基质细胞长入手术区；

由图10可知，Col-CA胶原膜材料进行兔体内板层角膜移植术后，角膜厚度恢复，基质层有了明显的修复。

实施例2：

1）将纯化后的柠檬酸（CA）用去离子水配制成浓度为35mg/ml的柠檬酸溶液，将从牛筋中提取的Ι型胶原，用0.005mol/L的乙酸溶液配制浓度为6.7mg/mL的胶原溶液；

2）按照柠檬酸与胶原的质量比为7:100配制两者的共混溶液，加入EDC-NHS溶液（EDC、NHS的质量比为3:2）进行交联，柠檬酸-胶原共混溶液中的胶原与EDC的质量比为4:1，将加入交联剂后的溶液在2℃冰箱中搅拌反应5小时，再在室温下搅拌20小时，除去气泡；

3）将步骤2）中的溶液倒入模具中，于室温下自然风干成膜，得到胶原膜；

4) 脱除模具，取出胶原膜，用去离子水进行多次洗涤，在室温下自然风干，即得到角膜修复材料。

实施例3：

1）将纯化后的柠檬酸（CA）用去离子水配制成浓度为45mg/ml的柠檬酸溶液，将从牛筋中提取的Ι型胶原，用0.01mol/L的盐酸溶液配制浓度为7.0mg/mL的胶原溶液；

2）按照柠檬酸与胶原的质量比为1:10配制两者的共混溶液，加入EDC-NHS溶液（EDC、NHS的质量比为2:1）进行交联，柠檬酸-胶原共混溶液中的胶原与EDC的质量比为3:1，将加入交联剂后的溶液在6℃冰箱中搅拌反应2小时，再在室温下搅拌30小时，除去气泡；

3）将步骤2）中的溶液倒入模具中，于室温下自然风干成膜，得到胶原膜；

4)脱除模具，取出胶原膜，用去离子水进行多次洗涤，在室温下自然风干，即得到角膜修复材料。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种新的角膜组织修复材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）将柠檬酸用水配制成柠檬酸溶液，将胶原用盐酸溶液或乙酸溶液配制成胶原溶液；

2）将柠檬酸溶液和胶原溶液配制成共混溶液，加入交联剂进行交联，在2～6℃条件下，水浴锅中搅拌2～5小时，再在室温下搅拌20～30小时，除去气泡；

3）将步骤2）中的溶液倒入模具中，于室温下自然风干成膜，得到胶原膜；

4）脱除模具，取出胶原膜，用水多次洗涤，于室温下自然风干，即得到角膜修复材料。

2.根据权利要求1所述的一种新的角膜组织修复材料的制备方法，其特征在于：步骤1）中所用胶原为从牛肌腱中提取的经纯化过的I型胶原。

3.根据权利要求1所述的一种新的角膜组织修复材料的制备方法，其特征在于：步骤1）中所述的柠檬酸溶液的质量体积浓度为35～45mg/ml。

4.根据权利要求1所述的一种新的角膜组织修复材料的制备方法，其特征在于：步骤1）中所述胶原溶液的质量体积浓度为6.5～7.0mg/ml。

5.根据权利要求1所述的一种新的角膜组织修复材料的制备方法，其特征在于：步骤1）中所述盐酸溶液的摩尔浓度为0.001～0.01mol/L。

6.根据权利要求1所述的一种新的角膜组织修复材料的制备方法，其特征在于：步骤1）中所述乙酸溶液的摩尔浓度为0.05～0.15mol/L。

7.根据权利要求1所述的一种新的角膜组织修复材料的制备方法，其特征在于：步骤2）中所述的共混溶液中，柠檬酸与胶原的质量比为（3～10）:100。

8.根据权利要求1所述的一种新的角膜组织修复材料的制备方法，其特征在于：步骤2）中所述交联剂为1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的混合物，1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺的质量比为（1～2）:1。

9.根据权利要求8所述的一种新的角膜组织修复材料的制备方法，其特征在于：步骤2）中所述胶原、1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺的质量比为6:（1～2）。

10.权利要求1～9任意一项方法制备的角膜组织修复材料。