KR20220033998A - 고순도 및 고수율로 제조된 아텔로콜라겐 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents
고순도 및 고수율로 제조된 아텔로콜라겐 제조방법 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 아텔로콜라겐 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 돈피 유래 콜라겐에 면역원을 제거하고 고순도 및 고수율의 아텔로콜라겐을 제조하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 따라 고수율로 제조된 아텔로콜라겐은 순도가 높고, 면역반응이 낮으며, 세포 독성이 없고, 생체 내 생분해성이 우수하고, 안전성이 높아 형태학적 특성 및 분열능이 우수하여 높은 해상도의 구조체 형성이 가능한 바이오 잉크 형태로도 사용이 가능한 바, 약물 전달을 조절할 수 있는 혈관 형성이 용이한 세포지지체 개발을 비롯하여 조직 및 재생공학용 제품으로 활용이 가능할 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 아텔로콜라겐 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 돈피 유래 콜라겐에 면역원을 제거하고 고순도 및 고수율의 아텔로콜라겐을 제조하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
콜라겐은 세포외기질(extra-cellular matrix)의 주 단백질 성분으로서 피부, 건(tendon), 혈관 등과 같은 결체 조직을 포함한 연조직은 물론 뼈 및 치아 등과 같은 경조직에도 매우 많이 들어 있으며, 포유동물의 경우 전체 단백질의 약 1/3정도를 차지하면서 어느 일정한 질서를 갖추며 세포가 집합하여 조직이나 기관의 기본적인 구조를 형성시키는 역할을 한다. 만일 콜라겐이 없다면 다세포동물은 존재할 수가 없다. 따라서 생체의 손상부위를 그 본래의 조직으로 재생시키려고 할 때 손상부위에 조직의 세포외기질이 공급될 경우 그 조직세포가 재생력을 갖게 될 것이므로, 콜라겐을 인공 조직 대체물의 기본적인 기질(matrix)로 제공한다는 것은 매우 유용할 수 있다.
한편, 생체에는 피부, 인대, 골, 혈관, 양막, 심막, 심장판막, 태반, 각막 등 콜라겐이 함유되어 있는 조직이 많지만 콜라겐의 종류는 각 조직마다 다르다. 특히 제1형 콜라겐은 피부, 인대, 골 등 거의 모든 조직에 다량 포함되어 있기 때문에 조직공학에서 가장 널리 이용되고 있다. 그러나, 콜라겐 분자의 양쪽 말단에는 나선을 형성하지 않은 텔로펩타이드(telopeptide)라고 불리는 부분이 존재하며, 이는 면역반응을 일으키는 주된 원인이므로, 의약품이나 화장품 등의 원료로 사용 시에는 이 부분을 제거한 아텔로콜라겐(atelocollagen)을 이용하기를 권장한다.
아텔로콜라겐은 일반적인 콜라겐에서 면역반응을 일으키는 콜라겐 분자 말단 텔로펩타이드가 제거된 콜라겐을 의미하며, 일반 콜라겐은 약 20% 정도의 면역반응을 일으키는데 반해 아텔로콜라겐은 0.3% 이하로 생체 적합성 소재로 이용 가능하므로 다양한 생체재료로 활용되고 있다.
이에, 면역원성이 제거된 아텔로콜라겐을 제조하는 방법이 다양하게 연구되고 있으나(대한민국 공개특허 제10-2017-0055645호), 수득률이 저조하여 생산수율을 높이고 고순도의 아텔로콜라겐 개발이 시급한 실정이다.
본 발명자들은 수득률이 개선된 아텔로콜라겐을 제조하기 위해 노력한 결과, 돈피 전처리 공정의 변경을 통해 고순도 및 고수율의 아텔로콜라겐이 제조됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 (a) 돈피 세척 후 아세트산을 처리하여 지방을 제거하고 에탄올과 함께 교반하여 전처리하는 단계;
(b) 상기 전처리된 돈피에 펩신을 처리하여 돈피의 텔로펩타이드를 제거함으로써 면역원성이 제거된 콜라겐을 수득하는 단계;
(c) 상기 면역원성이 제거된 콜라겐을 에탄올로 세척한 후, 원심분리를 통해 분리하여 중간체 아텔로콜라겐을 수득하는 단계;
(d) 상기 중간체 아텔로콜라겐에 요소(Urea)를 처리하는 단계;
(e) 상기 요소가 처리된 중간체 아텔로콜라겐을 정제 및 농축하는 단계; 및
(f) 상기 정제 및 농축된 아텔로콜라겐을 동결건조를 통해 수분을 제거하는 단계를 포함하는 고순도 및 고수율의 아텔로콜라겐을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 상기 제조 방법에 의해 제조된, 아텔로콜라겐 및 아텔로콜라겐을 포함하는 바이오 잉크 조성물을 제공하는 것을 추가 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 바이오 잉크 조성물을 포함하는 세포 지지체를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 돈피를 세척 후 아세트산을 처리하여 지방을 제거하고 에탄올과 함께 교반하여 전처리하는 단계;
(b) 상기 전처리된 돈피에 펩신을 처리하여 돈피의 텔로펩타이드를 제거함으로써 면역원성이 제거된 콜라겐을 수득하는 단계;
(c) 상기 면역원성이 제거된 콜라겐을 에탄올으로 세척한 후, 원심분리를 통해 분리하여 중간체 아텔로콜라겐을 수득하는 단계;
(d) 상기 중간체 아텔로콜라겐에 요소(Urea)를 처리하는 단계;
(e) 상기 요소가 처리된 중간체 아텔로콜라겐을 정제 및 농축하는 단계; 및
(f) 상기 정제 및 농축된 아텔로콜라겐을 동결건조를 통해 수분을 제거하는 단계를 포함하는 고순도 및 고수율의 아텔로콜라겐을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예로 본 발명은 상기 (a)단계 이후 전처리된 돈피를 -30℃ 이하의 온도에서 저온 냉동 보관하는 저장 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예로 본 발명은 상기 저장 단계 이후 전처리된 돈피를 블렌딩한 후 균질화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예로 본 발명은 상기 (b)단계를 2 내지 5회 반복 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예로 본 발명은 상기 (c)단계에서 에탄올 세척을 진행하기 전 염석여과를 진행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예로 상기 (e)단계에서 정제 및 농축하는 단계는 접선유동여과(tangential flow filtration)를 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된 아텔로콜라겐을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 아텔로콜라겐을 포함하는 바이오 잉크 조성물 또는 상기 바이오 잉크 조성물을 포함하는 세포 지지체를 제공한다.
본 발명의 제조방법에 따라 고수율로 제조된 아텔로콜라겐은 순도가 높고, 면역반응이 낮으며, 세포 독성이 없고, 생체 내 생분해성이 우수하고, 안전성이 높아 형태학적 특성 및 분열능이 우수하여 높은 해상도의 구조체 형성이 가능한 바이오 잉크 형태로도 사용이 가능한 바, 약물 전달을 조절할 수 있는 혈관 형성이 용이한 세포지지체 개발을 비롯하여 조직 및 재생공학용 제품으로 활용이 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 아텔로콜라겐 제조방법에 관한 것으로, 도 1a는 아텔로콜라겐 제조공정 모식도를 나타낸 것이고, 도 1b는 아텔로콜라겐 추출 및 정제 공정의 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐의 품질을 분석한 것으로, 도 3a는 Sircol kit 결과를 나타낸 것이고, 도 3b는 BCA protein assay 결과를 나타낸 것이고, 도 3c는 SDS-PAGE 분자량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐의 의료용 원료 기준으로의 품질을 평가한 것으로, 도 4a는 내부 원료 성적서를 나타낸 것이고, 도 4b는 외부 시험성적서를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐의 제조 수득률(%)를 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐의 순도(%)를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐 및 시판 제품(비교예F)의 처리에 따른 세포 생존율을 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐 및 시판 제품(비교예F)의 처리한 세포들을 염색하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐을 생체 내 이식하여 생체 내 생분해성을 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐을 생체 내 이식한 경우, 쥐의 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크를 이용하여 제작한 구조체의 주사전자현미경(SEM) 이미지 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 내 세포 생존 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크의 생물학적 특성을 확인하기 위해, 아텔로콜라겐 코팅 후 세포의 증식비율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐의 품질을 분석한 것으로, 도 3a는 Sircol kit 결과를 나타낸 것이고, 도 3b는 BCA protein assay 결과를 나타낸 것이고, 도 3c는 SDS-PAGE 분자량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐의 의료용 원료 기준으로의 품질을 평가한 것으로, 도 4a는 내부 원료 성적서를 나타낸 것이고, 도 4b는 외부 시험성적서를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐의 제조 수득률(%)를 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐의 순도(%)를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐 및 시판 제품(비교예F)의 처리에 따른 세포 생존율을 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐 및 시판 제품(비교예F)의 처리한 세포들을 염색하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐을 생체 내 이식하여 생체 내 생분해성을 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐을 생체 내 이식한 경우, 쥐의 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크를 이용하여 제작한 구조체의 주사전자현미경(SEM) 이미지 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크 내 세포 생존 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명에 의해 제조된 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크의 생물학적 특성을 확인하기 위해, 아텔로콜라겐 코팅 후 세포의 증식비율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 수득률이 개선된 아텔로콜라겐을 제조하기 위해 노력한 결과, 돈피 전처리 등 공정의 변경을 통해 고순도 및 고수율의 아텔로콜라겐이 제조된 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 (a) 돈피를 세척 후 아세트산을 처리하여 지방을 제거하고 에탄올과 함께 교반하여 전처리하는 단계;
(b) 상기 전처리된 돈피에 펩신을 처리하여 돈피의 텔로펩타이드를 제거함으로써 면역원성이 제거된 콜라겐을 수득하는 단계;
(c) 상기 면역원성이 제거된 콜라겐을 에탄올으로 세척한 후, 원심분리를 통해 분리하여 중간체 아텔로콜라겐을 수득하는 단계;
(d) 상기 중간체 아텔로콜라겐에 요소(Urea)를 처리하는 단계;
(e) 상기 요소가 처리된 중간체 아텔로콜라겐을 정제 및 농축하는 단계; 및
(f) 상기 정제 및 농축된 아텔로콜라겐을 동결건조를 통해 수분을 제거하는 단계를 포함하는 고순도 및 고수율의 아텔로콜라겐을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계 이후 전처리된 돈피를 -30℃ 이하의 온도에서 저온 냉동 보관하는 저장 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계에서 펩신은 돈피 1kg 당 0.5×108 내지 2.0Х108 unit의 농도로 1회 이상 처리될 수 있다. 펩신 처리 후 균질 작업을 추가적으로 수행하고, 펩신을 여과하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 (c)단계에서의 에탄올 세척은 돈피 1kg 당 1 내지 20L의 에탄올을 사용하여 1회 이상 수행될 수 있으며, 에탄올 세척을 진행하기 전 염석여과를 진행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d)단계에서 요소(Urea)는 0.01 내지 0.03M으로 처리될 수 있다.
본 발명에 있어서, (e)단계에서 정제 및 농축하는 단계는 접선유동여과(tangential flow filtration)를 이용하는 것일 수 있다.
본 발명의 제조방법에 따른 아텔로콜라겐은 고수율 고순도로 제조가 가능하며, 120 내지 380M.W의 균일한 분자량을 나타내는 아텔로콜라겐을 제조할 수 있다.
이하, 본 발명의 아텔로콜라겐 제조방법에 대해 각 단계별로 세분화하여 구체적으로 설명하기로 한다.
[(a) 단계 : 돈피 전처리 단계]
돈피의 진피를 준비하기 위한 전처리 단계로서, HACCP 적합 돈피를 팽윤(swelling)시키고, 세척한 후 아세트산에 처리하여 물리적 지방을 제거하고 멸균시킨다. 멸균된 돈피를 에탄올에 교반하고 블랜딩(blending) 한 후 균질화(homogenization) 공정을 적용하여 전처리시키는 과정이다.
[(b) 단계 : 면역원성 제거 단계]
전처리된 돈피에서 면역반응을 일으키는 콜라겐 분자 말단의 텔로펩타이드(telopeptide)를 제거하기 위해 특정 농도의 펩신을 처리하고 불활성화 시켜 면역원성이 제거된 콜라겐을 제조하는 과정으로, 펩신은 반복해서 처리될 수 있고 펩신의 각 회당 처리 후 균질작업을 추가적으로 수행하며, 각 회당 처리 후 펩신 여과 과정을 수행하는 과정이다.
[(c) 단계 : 아텔로콜라겐 수득 단계]
상기 면역원성이 제거된 콜라겐을 에탄올을 사용하여 수회 세척하고 단계별 여과 처리를 진행한 뒤 원심분리하고, 상하층의 지방 및 불순물을 제거한 후 중간층을 수득한다. 수득된 중간층에서 염석반응을 통해 아텔로콜라겐을 추출하는 과정이다.
[(d) 단계 : 요소 처리 및 분리 정제 단계]
(c) 단계에서 수득된 아텔로콜라겐에 요소(Urea)를 처리한 후 멸균시키고 접선유동여과(tangential flow filtration)을 이용하여 분리 및 정제 하는 과정이다.
[(e) 단계 : 수분 제거 단계]
(d) 단계에서 분리 정제된 아텔로콜라겐을 동결건조시켜 수분이 제거된 아텔로콜라겐을 수득하는 과정이다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명의 제조방법에 의해 고순도 및 고수율로 제조된 아텔로콜라겐의 효능을 규명하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 아텔로콜라겐의 제조방법을 규명하였으며(실시예 1-1 참조), 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 아텔로콜라겐의 제조 수득률, 분자량 및 순도를 분석한 결과, 기존 공정에 비해 생산성이 2배 이상 증가하여 현재 기술력 대비 400% 향상된 효능을 확인하였으며, 순도에 있어서도 기존 공정으로 제조된 대조군 아텔로콜라겐(86.7%)에 비해 월등히 향상된 순도(98.4%)를 확인하였다(실시예 1-3 참조).
또한, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 아텔로콜라겐의 세포 독성을 평가한 결과, 시판 제품 대비 세포 독성이 낮음을 확인하였고(실시예 1-4 참조), 생체 내 생분해성 및 안전성을 평가한 결과, 생체 내 생분해성이 우수하고, 안전성도 우수함을 확인하였다(실시예 1-5 참조).
상기 결과로부터, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 아텔로콜라겐이 높은 고순도로 높은 제조 수득률을 나타내는 것을 확인하였으며, 세포지지체 개발을 비롯하여 조직 및 재생공학용 제품으로 활용이 가능하다.
이에, 본 발명의 다른 양태로서 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 아텔로콜라겐 및 이를 포함하는 바이오 잉크 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "바이오 잉크(bio-ink)"는 살아있는 세포 혹은 바이오 분자를 포함하며, 바이오 프린팅 기술에 응용하여 필요로 하는 구조물을 제작할 수 있는 소재를 총칭한다. 바이오 잉크는 3차원 가공을 위한 물리적 성질과 세포가 목적된 기능을 수행하게 하기 위한 생물학적 환경을 제공하며, 우수한 세포 친화성을 가지는 소재를 의미한다.
본 발명의 바이오 잉크는 3D 프린터를 통해 조직공학용 지지체, 수술 임플란트, 개인별 맞춤형 보형물, 인공 혈관, 인공 장기 등 의학·바이오 분야에 활용될 수 있는 바이오 구조체를 프린팅할 수 있는 다양한 방식의 3D 프린터에 적용하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 바이오 잉크 조성물을 포함하는 세포 지지체를 제공한다.
본 발명에 따른 세포 지지체는 체내 이식이 가능한 단일 조직 구조체일 수 있으며, 여러 가지 세포를 동시에 프린팅하여 조직과 조직간의 연계를 재연할 수 있는 기능성이 향상된 조직 구조체일 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 아텔로콜라겐 추출 및 이의 특성 확인
1-1. 아텔로콜라겐 제조공정
돈피로부터 아텔로콜라겐을 추출하기 위해 도 1a 및 1b에 나타낸 제조공정으로 아텔로콜라겐을 추출하였다. 구체적으로 하기의 공정을 진행하였다.
먼저, HACCP 인증받은 돈피를 팽윤(swelling)시키고 세척한 후 0.1 내지 1.0 M의 아세트산을 overnight 동안 처리하여 물리적인 지방을 제거시키고 멸균된 돈피를 에탄올에 overnight 동안 교반하여 전처리 시킨 뒤, -30℃ 이하의 초저온에서 냉동 보관하였다.
이후 초저온 냉동 보관한 돈피를 재팽윤, 초산 제거 공정을 거쳐 블렌딩(blending) 한 후 균질화(homogenizing) 공정을 통해 가공하였다.
다음으로, 전처리 된 냉동 돈피 1 kg 당 0.5×108 내지 2.0×108 unit의 펩신을 1 내지 10℃ 온도에서 24시간 동안 처리하여 면역반응을 일으키는 콜라겐 분자 말단 텔로펩타이드(telopeptide)를 제거한 후 펩신여과를 수행하여 펩신을 불활성화시켰으며, 상기 과정을 수회 반복하여 텔로펩타이드를 최대한 제거하였다.
다음으로, 펩신이 불활성화된 콜라겐을 돈피 1 kg 당 2.5 내지 5.0 M의 NaCl을 사용하여 1 내지 10℃ 온도에서 overnight 동안 염석을 진행하고, 원심분리를 통하여 염석 여과를 진행하였다.
이후 1 내지 20 L의 에탄올을 사용하여 수회 세척하고 1 내지 10℃ 온도에서 overnight 동안 단계별 여과 처리를 진행한 후 원심분리하였다. 원심분리 결과에서 상하층의 지방 및 불순물을 제거하여 수득된 중간층에서 아텔로콜라겐을 추출하였다.
다음으로, 수득된 아텔로콜라겐에 0.01M 내지 0.03M의 요소를 처리하고 1 내지 10℃ 온도에서 overnight 동안 멸균시킨 후 접선유동여과(tangential flow filtration)를 이용하여 분리 및 정제하였다. 분리 및 정제된 아텔로콜라겐은 동결건조를 통해 수분을 제거시켜 120 내지 380 M.W의 균일한 아텔로콜라겐을 제조하였으며, 본 발명에서 제조된 아텔로콜라겐의 모식도를 도 2에 나타내었다.
제조된 아텔로콜라겐의 품질을 확인하기 위해 상기 제조 방법으로 제조된 제품(실시예)과 시판 제품(비교예 A, B, C, D 및 E)에 대해 Sircol kit 분석(도 3a), BCA protein assay 분석(도 3b) 및 SDS-PAGE 분자량 분석(도 3c)을 진행하였다. 그 결과 도 3a에 나타낸 바와 같이 Sircol Kit으로 생산수율을 비교하였을 때 비교예에 비해 실시예에서 새롭게 합성된 콜라겐의 양이 많게 나타나는 것을 확인하였으며, 도 3b 및 3c에 나타낸 바와 같이 현재 판매중인 의료용, 재생의학용, 고순도 연구용 콜라겐 표준품 또는 타사 제품과 동등한 품질을 나타내는 것을 확인하였다.
이에 더하여 도 4a에 나타낸 바와 같이 내부 품질 평가를 확인하였으며, 도 4b에 나타낸 바와 같이 인증평가 기관을 통하여 품질을 확인하였다.
1-2. 비교예 제조공정
먼저, 돈피를 팽윤(swelling)시키고 세척한 후 물리적인 지방을 제거시키고 멸균된 돈피를 에탄올에 교반하고 블렌딩(blending) 한 후 균질화(homogenizer) 공정을 통해 전처리시키고 -20℃의 일반 냉동 조건에서 저장하였다.
다음으로, 냉동 저장된 돈피 1kg 당 1×108 내지 2×108 unit의 펩신을 6시간 또는 overnight 동안 1~2회 처리하여 면역반응을 일으키는 콜라겐 분자 말단 텔로펩타이드(telopeptide)를 제거하였다.
다음으로, 펩신이 불활성화된 콜라겐을 돈피가 잠길 정도 양의 에탄올을 사용하여 세척하고 4℃에서 overnight 동안 여과 처리를 진행한 후 원심분리하고, 상하층의 지방 및 불순물을 제거하여 수득된 중간층에서 아텔로콜라겐을 추출하였다.
다음으로, 수득된 아텔로콜라겐에 0.01M 내지 0.05M의 요소를 처리하여 멸균시킨 후 분리 및 정제하여 다양한 M.V를 나타내는 아텔로콜라겐을 제조하였다.
1-3. 아텔로콜라겐 수득률 및 순도 확인
Sircol kit 및 SDS-PAGE를 통해 상기 실시예 1-1의 방법으로 제조된 아텔로콜라겐의 제조 수득률, 분자량 및 순도를 분석하고 그 결과를 하기 표 1, 도 5 및 도 6에 나타내었다.
| 주요 성능지표 | 단위 | 본 발명의 아텔로콜라겐 |
종래 기술 수준 | 측정방법 |
| 제조 수득률 | % | 12.6 % ± 2.5 | 4% | Sircol kit |
| 분자량 | kDa | 240kDa 이상 | 240kDa 이상 | SDS-PAGE |
| 순도 | % | 99 % ± 2.1 | 99% | Sircol kit |
상기 표 1의 결과로부터, 본 발명에 제조된 아텔로콜라겐이 종래 최고수준의 제조수득률인 4%에 비해 현저히 우수한 수득률(12.6%)을 나타내는 것을 확인하였으며, 분자량 및 순도에 있어서도 종래 최고수준과 유사한 것을 확인하였다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 기존 공정으로 제조된 비교예 아텔로콜라겐에 비해 본 발명의 제조공정에 따라 제조된 아텔로콜라겐의 생산 수율이 기존 공정에 비해 생산성이 2배 이상 증가하는 것을 확인하였으며, 이는 현재 기술력 대비 400% 이상의 생산 수율 증가를 의미하는 결과로 볼 수 있다.
또한, 도 6에 나타낸 바와 같이 기존 공정으로 제조된 비교예 아텔로콜라겐(86.7%)에 비해 본 발명의 제조공정에 따라 제조된 아텔로콜라겐의 순도(98.4%)가 월등히 향상된 것을 확인하였다. 특히 인증평가 기관을 통해 순도를 확인한 결과(99%)에 있어서도 시험결과가 유사하게 나타나는 것을 확인하였다.
1-4. 아텔로콜라겐 세포 독성 평가
상기 실시예 1-1의 방법으로 제조된 아텔로콜라겐의 세포 독성을 시판 제품(비교예F)과 비교하여 평가하여, 그 결과를 도 7 및 8에 나타내었다.
구체적으로, 시판 제품 (비교예F)과 실시예의 아텔로콜라겐을 4.5%, pH 7.0 ~ 7.5 수용액을 제조한 후, 1 x 106 세포수/ml 농도로 L-929 Cell을 아텔로콜라겐 수용액에 혼합하여 4시간, 1일, 4일, 7일간 세포생존률을 평가하였으며, CCK-8 용액으로 세포 염색 후에 마이크로 플레이트 판독기 (GloMax; Promaga, USA)를 사용하여 450㎚에서의 광학 밀도 (OD)값을 측정하여 분석하여, 도 7에 나타내었다.
또한, 도 8은 세포 생존율 분석을 위한 LIVE/DEAD assays를 수행한 결과로 상기 도 7에서와 같은 시험방법으로 배양한 세포에 calcein AM과 EthD-1이 포함된 LIVE/DEAD staining 용액을 사용하여 염색하였다. 형광 염색된 세포 시료들은 공촛점현미경 (FV1200; Olympus, Japan)을 사용하여 이미지를 촬영하고, 관찰하였다.
구체적으로, L-929 세포주에 4.5% 농도의 아텔로콜라겐(실시예 및 비교예F)을 처리하여, 4시간 후, 1일차, 4일차, 7일차의 세포 독성을 확인하였다. 그 결과, 도 7에서 볼 수 있듯이, 시간대별로 시판 제품(비교예F)의 경우, 평균 10%의 세포 독성을 나타낸 반면, 실시예의 아텔로콜라겐은 평균 5%의 세포 독성을 나타내어, 시판 제품(비교예F) 대비 실시예에 따라 제조된 아텔로콜라겐의 세포 독성이 더 낮음을 확인하였다.
또한, L-929 세포주에 4.5% 농도의 아텔로콜라겐(실시예 및 비교예F)을 처리하여, 4시간 후, 1일차, 4일차, 7일차의 세포 독성을 확인하고자, calcein AM 및 Ethd-1 염색을 수행하였고, 그 결과는 도 8과 같았다. 도 8에서 볼 수 있듯이, 실시예의 아텔로콜라겐은 시판 제품(비교예F) 대비 살아있는 세포 수가 많음을 확인하였다.
1-5. 아텔로콜라겐 생체 내 생분해성 및 안정성 평가
상기 실시예 1-1의 방법으로 제조된 아텔로콜라겐의 생체 내 생분해성 및 안전성을 평가하여, 그 결과를 도 9 및 10에 나타내었다.
구체적으로, 공인인증평가기관을 통하여, 상기 실시예 1-1의 방법으로 제조된 아텔로콜라겐을 농도별(1, 3, 4%)로 제조하여, 쥐에 이식한 후 16주 간 생분해성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1-1의 방법으로 제조된 아텔로콜라겐의 생분해성 및 안정성 평가를 위하여 공인인증평가기관에 의뢰하였다. 도 9 및 10의 시험평가를 위해 실험동물은 설치류인 랫드 (SD Rat, 오리엔트 바이오, 한국)를 사용하였으며, 농도별(1, 3, 4%)로 제조한 아텔로콜라겐 수용액 0.25g 용량을 등부위 척추선 기준으로 양측면에 피하주사 하였다. 체중은 이식 후 독성을 확인하기 위한 항목으로, 투여 전, 투여 당일 및 매주 1회씩 측정하였다. MRI 영상 촬영은 MR 영상 장비 (BioSpec; Bruker, Germany)를 이용하여 실험일정에 따라 1일~16주의 각 개체들을 촬영하여 영상을 분석하였다
MR imaging을 통해 확인한 결과, 농도의존적으로 분해하는 것을 확인할 수 있었다(도 9). 농도의존적으로 생분해가 되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 1 및 3% 아텔로콜라겐이 이식된 경우, 1 내지 2주 내 분해되는 것을 확인하였고, 4% 아텔로콜라겐이 이식된 경우, 3 내지 4주 사이에 분해되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 아텔로콜라겐이 이식된 동물의 체중 감소는 없는 것을 확인하여, 독성이 없음을 확인하였다(도 10).
실시예 2. 고순도 아텔로콜라겐을 활용한 바이오 잉크 제조 및 이의 특성 확인
면역원이 제거된 돈피 유래 콜라겐/아텔로콜라겐과 세포외 기질을 이중 수소결합 작용에 의한 가교(cross-linking) 방법을 이용하여 바이오 잉크를 제조하였다. 3D 바이오 프린터와 아텔로콜라겐 기반 바이오 잉크를 이용하여 제작한 구조체의 특징 및 목표 해상도 구현의 가능성을 검토하기 위해 도 11에 나타낸 바와 같이 주사전자현미경(SEM) 이미지를 촬영하였다.
이에 더하여, 의료 및 재생용 3D 바이오 잉크 가능성 평가를 위해 세포 생존을 확인한 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이 아텔로콜라겐 기반 구조체 내에서 세포의 부착 및 생존을 확인하였다.
또한, 아텔로콜라겐을 코팅 후 세포의 형태 및 분열 확인을 위해 대조군(control), 시판 제품인 아텔로콜라겐(비교예) 및 본 발명의 아텔로콜라겐(실시예)을 코팅 후 1일 내지 14일 동안 세포 증식 비율(Increasing rate of viable cells(%))을 분석한 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이 3일 이후부터 본 발명의 아텔로콜라겐을 코팅한 세포의 증식 비율이 타사의 아텔로콜라겐에 비해 더 높게 나타나는 것을 확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (9)
- (a) 돈피를 세척 후 아세트산을 처리하여 지방을 제거하고 에탄올과 함께 교반하여 전처리하는 단계;
(b) 상기 전처리된 돈피에 펩신을 처리하여 돈피의 텔로펩타이드를 제거함으로써 면역원성이 제거된 콜라겐을 수득하는 단계;
(c) 상기 면역원성이 제거된 콜라겐을 에탄올으로 세척한 후, 원심분리를 통해 분리하여 중간체 아텔로콜라겐을 수득하는 단계;
(d) 상기 중간체 아텔로콜라겐에 요소(Urea)를 처리하는 단계;
(e) 상기 요소가 처리된 중간체 아텔로콜라겐을 정제 및 농축하는 단계; 및
(f) 상기 정제 및 농축된 아텔로콜라겐을 동결건조를 통해 수분을 제거하는 단계를 포함하는 고순도 및 고수율의 아텔로콜라겐을 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (a)단계 이후 전처리된 돈피를 -30℃ 이하의 온도에서 저온 냉동 보관하는 저장 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제2항에 있어서,
상기 저장 단계 이후 상기 전처리된 돈피를 블렌딩한 후 균질화하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (b)단계는 2 내지 5회 반복 수행하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (c)단계에서 에탄올 세척을 진행하기 전 염석여과를 진행하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (e)단계에서 정제 및 농축하는 단계는 접선유동여과(tangential flow filtration)를 이용하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, 아텔로콜라겐.
- 제7항의 아텔로콜라겐을 포함하는, 바이오 잉크 조성물.
- 제8항의 바이오 잉크 조성물을 포함하는, 세포 지지체.
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| KR20170055645A (ko) | 2015-11-12 | 2017-05-22 | 인터올리고 주식회사 | 아텔로콜라겐 및 숙시닐화 아텔로콜라겐의 제조방법 |
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Patent Citations (1)
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