CN114808081A - 一种可从电极剥离的短程取向非晶胶原材料及其电化学制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物大分子组装领域，涉及一种可从电极剥离的胶原材料及其电化学制备方法。在胶原电解液中添加过氧化氢和醋酸，通过电化学方法诱导电解液中的胶原分子在电极表面进行组装，制备一种可从电极上直接剥离的胶原材料。本发明的方法易于操作，制备时间短，不使用有机溶剂，阴极不产生气泡。所获得的胶原材料以短程取向的胶原微纤通过非共价键连接而成，胶原排列致密，材料外观透明、结构均匀，胶原材料能被溶剂再次溶解，可被循环制备。本发明可以根据阴极的形状制备同样形状的胶原异形材料，以适应不同的后续加工要求。
Description
技术领域
本发明属于生物大分子组装领域，涉及一种可从电极剥离的胶原材料及其电化学制备方法。
背景技术
胶原是脊椎动物中最丰富的蛋白质之一。由于它具有低免疫源性，高生物相容性，能促进细胞增殖和伤口愈合等优点，已被广泛用于各类生物医用材料。胶原蛋白是一种三螺旋结构，在体内一些内源性信号的指导下，可以进行分级有序组装，即从三螺旋结构开始，经历胶原微纤、胶原原纤、胶原纤维的分级组装，最终形成组织结构。
在体外，人们多使用溶液浇铸方法将单纯的胶原蛋白加工成胶原生物材料。操作步骤是将胶原蛋白溶液调节至中性后至于模具中，于37℃下孵育一段时间以完成胶原分级组装过程。缺点是：1不易于加工各种异形胶原材料；2要持续几个小时，甚至过夜才能完成；3材料内部胶原纤维无序排列、胶原排列密度低、材料外观不透明。
利用电化学沉积技术(Electro-deposition EDP)制备胶原材料是一种较为先进的加工方法，其原理是对胶原的酸性溶液施加电场，驱动胶原分子向阴极区域电泳迁移；同时由于阴极上发生的电化学反应(通常是电解水反应)可升高电极附近溶液pH值，泳动到胶原等电点区域的胶原就被析出，从而形成胶原材料。与溶液组装方法对比，优点是该过程通常比较快，在30-60分钟左右可完成；二是可对材料塑形；三是材料微观结构有取向特征、胶原排列致密、材料外观透明。缺点也很明显：因为等电点区域通常位于电解液中的某个位置，不能直接在电极上沉积得到胶原材料，不方便取材，也不便利用电极形状对胶原材料进行塑形(比如获得管状、不规则形状胶原材料)；并且两个电极之间间距很小，一般1-2mm，不便于操作 (An electrochemical fabrication process for the assembly ofanisotropically oriented collagen bundles，Biomaterials 29(2008)3278–3288；Tenogenic Induction of Human MSCs by Anisotropically Aligned CollagenBiotextiles，Adv.Funct.Mater.2014,24, 5762–5770)。
此外，也有研究者利用脉冲EDP技术，在电极上获得了胶原材料。主要策略是在电解液中加入50％的有机溶剂乙醇(可能是为了降低胶原溶解度)并使用脉冲电压(减小阴极上产生的氢气气泡，以利于胶原沉积)。该方法的缺点有：有机溶剂可能造成胶原蛋白的结构改变，电极获得的材料结构均匀性不容易控制，操作时间较长，需要1.5小时，获得材料不透明 (Fabrication of free standing collagen membranes bypulsedelectrophoretic deposition，Biofabrication 11,2019,045017)。
因此，需要开发新的方法克服上述缺点，以便更加快速、有效的获得符合要求的胶原材料。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可以从电极上直接获得胶原材料的电化学沉积制备方法，以便高效的获得符合要求的胶原材料。
为达到上述目的，本发明提供了一种可从电极剥离的胶原材料的制备方法，在电解液中添加过氧化氢和/或醋酸，通过电化学方法在电极制备可剥离的胶原材料。可选的，阴极可以是不锈钢、碳纸、碳布、Pt电极、金电极、石墨电极、Ti电极；阳极可以是不锈钢、碳纸、碳布、Pt电极、金电极、石墨电极，不可以是Ti。
可选的，所述的制备方法包括以下步骤：
S1，胶原溶液的配置：在胶原蛋白溶液中添加醋酸使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH 值为1.5-4.0，浓缩后获取浓度在1-20mg/ml范围的胶原溶液；
S2，向步骤S1获得的胶原溶液中加入过氧化氢标准液体，使其在溶液中的终体积百分比为5％-17％，并搅拌、除去气泡，置于0-10℃备用；
S3，以钛片作为阴极、铂作为阳极，两个电极平行放置在电解池中电极之间的距离控制在0.5-3.0cm，在电解池中缓慢加入步骤S2所制备的胶原溶液；
S4，采用恒电压或者恒电流沉积进行电化学反应，沉积时间10-60分钟，获得可从阴极上剥离的胶原凝胶膜。
本发明的制备方法中，胶原材料能在电极上直接获得。电极间距可以从毫米增加到厘米级别，显著宽于目前常用的2mm的电极距离，极大的方便电极的搭建和后续的操作。例如，电极之间的距离可以控制在0.5-3.0cm，更好的控制在1.0-1.5cm。
可选的，电极的安装方式包括：将两个电极垂直平行放置在电解池中，或者将两个电极水平平行放置在电解池中。水平电极和竖直电极均能制备胶原材料，但发现竖直电极制备的材料容易因重力原因上薄下厚，采用水平电极可避免此情况。
可选的，步骤S1中调节加入胶原蛋白原料的质量，使最终获取的胶原溶液浓度在5-10 mg/ml。本发明通过反复测试，可以在电解液中不使用有机溶剂，而通过制备方法中其他参数的调节实现自支撑的胶原(凝胶膜)的制备(也即能从电极上剥离而成为独立的材料)，同时有效阻止阴极产生气泡。改变加入胶原蛋白原料的质量，可以调节最终获取的胶原溶液浓度。当最终获取的胶原溶液浓度超出20mg/ml后溶液失去流动性，通常在1-20mg/ml变化范围内能够获得较好的结果。
本发明中，胶原可以采用各种市售的胶原。例如，本发明实施例1中所用的胶原来自上海昊海生物科技有限公司。所述的自支撑即Free-standing，不利用其它的基底作为支撑。
可选的，步骤S1中透析液中加入醋酸的终浓度需要根据胶原电解液的pH来确定。透析液中醋酸太少，会降低透析袋中胶原电解液中的醋酸量，降低后续电化学反应中电泳过程中胶原分子的流动性。透析液中醋酸太多，会增加胶原电解液中的醋酸量，容易导致胶原分子在后续电化学反应中无法在阴极表面沉积。实际操作为：将胶原原料放置于超纯水中搅拌，并滴加醋酸，利用pH计监测过程的pH值，直到达到本发明规定的pH范围即可，此时胶原已经完全溶解。
可选的，步骤S2加入的过氧化氢终浓度为50-200μl/ml。理论上，增加过氧化氢有助于胶原凝胶膜的快速形成，但是实验结果表明，过氧化氢浓度高于200μl/ml，过氧化氢在电解液中会直接分解，导致电解液中产生气泡，不利于制备均匀的胶原凝胶膜。为了计算方便，过氧化氢的浓度为5-17％,体积比。例如可以采用各种市售的过氧化氢标准品，例如本发明实施例中使用的过氧化氢标准液体源自(永华化学股份有限公司，货号210401204)。
可选的，步骤S2中离心速度6000-8000rpm/min的速度离心。该离心速度有助于排除溶液中因操作产生的气泡，防止后续制备的胶原凝胶膜不均匀。在电解池中加入步骤S2中所制备的胶原溶液时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
可选的，步骤S4中电压变化范围在0.22-1.67V/cm2。沉积时间可以控制在10-45分钟，沉积时间可以根据温度、电压、预期胶原凝胶膜的厚度等参数设定和优化。步骤S4也可以使用恒电压的方式进行。
可选的，步骤S1中胶原溶液的配置为：按照400mg I型胶原蛋白溶于40mL超纯水的比例准确称取胶原蛋白和超纯水，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为1.5-3.0；装入透析袋(不透过胶原蛋白即可，例如MWcut off＝7.0kDa)一并放入装有含有冰醋酸的水溶液中，于0-5℃下透析3天以去除小分子杂质；透析后获得胶原蛋白粘稠液体。
可选的，步骤S2中，向步骤S1所述的胶原溶液中加入过氧化氢50-100μl/ml，并搅拌均匀，在0-5℃下以5000-10000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
可选的，步骤S3中，选取钛片作为阴极，铂丝或铂片作为阳极，在电解池中小心加入步骤S2中所制备的胶原溶液，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
可选的，步骤S4中，然后将电极连接到电化学工作站上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为5-7mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间500-2000秒。本发明的制备时间可以缩短至8-15min，在该时间窗口内可获得湿态厚度为300μm左右的胶原材料，以便更加快捷的获得所需的胶原。也可以根据所需胶原膜的厚度调整沉积时间。
可选的，电极半反应如下：
阳极：2H2O-4e-→4H++O2；或者，阴极：4H2O+4e-→4OH-+2H2。
相应的，本发明提供了一种胶原凝胶膜，其外观非常均匀，在干态和湿态均高度透明，以短程取向的胶原微纤以非共价键连接而成；胶原排列致密；材料外观透明、结构均匀；胶原材料能被溶剂再次溶解，可被循环制备。如果材料内部不均匀(尤其是因为气泡的产生，导致内部出现缺陷)当受到外力作用时候，材料会产生应力集中现象，在结构缺陷处率先断裂。此外，内部出现的结构缺陷也会使入射光发生散射，使材料的透明度下降。本发明的该胶原凝胶膜制备完成后，能够从电极剥离。
可选的，所述的胶原凝胶膜由本发明从电极剥离的胶原材料的制备方法获得。
另一方面，本发明提供了所述胶原凝胶膜或者其制备方法的应用，使用该制备方法在电极上制备胶原凝胶膜，并进而获得胶原材料。本发明制备的胶原材料可以被溶剂再次溶解，并能重新利用EDP技术制备，也即可被循环制备，可促进节能环保。
本发明中胶原凝胶膜是在电极上生产并剥离的，可以根据阴极的形状制备同样形状的胶原异形材料。例如，在本发明的优选例中，阴极为钛管时，可以获得中空的胶原管；阴极为类似心脏瓣膜形状时，可以获得类心脏瓣膜的胶原异形材料。
本发明采用改进的EDP技术，以醋酸作为酸性调节剂制备胶原电解液，使用过氧化氢分解作为阴极反应，使用Ti片作为阴极(即工作电极)、Pt片作为阳极(即对电极)，采用水平或垂直放置的方式，制备胶原材料。
本发明中，超纯水又称UP水，电阻率达到18MΩ*cm(25℃)的水，这种水中除了水分子外，几乎没有杂质，没有矿物质微量元素，更没有细菌、病毒、含氯二恶英等有机物。超纯水处理时，既将水中的导电介质几乎完全去除，又将水中不离解的胶体物质、气体及有机物均去除至很低程度的水，通常需要采用预处理、反渗透技术、超纯化处理以及后级处理四大步骤。
本发明中，恒电流沉积是指电流保持不变的电沉积过程，例如本发明的一个优选例中，电沉积反应中电流密度为6.67mA/cm2。
本发明中，胶原异形材料是指胶原的外形可以按照需要制备成各种不同的形状，例如长方形、圆形、三角形、梯形、空管型，等等。
本发明的优点包括：
A.由于醋酸是一种弱酸，可提供一定的缓冲能力，使得阴极附近的pH值能够接近胶原的等电点，从而在电极表面直接得到胶原材料。
B.可通过改变阴极电极的形状，很方便地对胶原材料进行各种异形结构塑形。
C.阴极反应为过氧化氢分解，不产生气泡，因此有利于获得外观非常均匀致密的胶原材料，尤其是在使用水平电极的情况下，还可以解决因重力造成的胶原膜上薄下厚的情况。
D.电极之间的距离可以在厘米级别，方便操作。
E.制备时间短10-15min。
F.该胶原材料的特征为：以短程取向的非晶态的胶原微纤组成；胶原排列致密；胶原材料外观透明、结构均匀,有利于获得更好的力学性能和光学性能；具有塑性形变能力；胶原微纤维之间由非共价键连接，因此可以被溶剂再次溶解，并能重新利用EDP技术制备，也即可被循环制备。
附图说明
图1是EDP技术组装过程示意图。
其中，电极的安装方式有两种：一种是将两个电极垂直平行放置在电解池中(如图1a)，另一种是将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)。
图2是胶原凝胶膜。
其中，阴极上出现的一层胶原凝胶膜如图2(a)所示，图2(b)展示E-Col胶原材料外观非常均匀，在干态和湿态均高度透明。
图3是胶原的光学性能测试结果。
其中，E-Col表现出较高的光学透明性，在450nm到780nm范围内(可见光范围)光学透过率接近90％(a)，同时胶原凝胶膜的雾度也很低，在可见光范围内仅为10％(b)。
图4是胶原的微观形貌表征。
可见，E-Col膜具有致密的组织结构，密度为0.88g/cm3，表面和断面均有取向排列的纳米纤维。相比之下，溶液组装的S-Col膜内部是一个松散的网络，密度为0.45g/cm3，其中随机聚集了较粗的、直径约几微米纤维(a)。图4(b)的TEM图像显示，E-Col由较细的微纤维紧密组织而成，高倍TEM揭示其直径约为10nm，没有明显的胶原纤维特征D带。与之相比，S-Col 中存在微米级尺寸的疏松排列的纤维，高倍TEM图像显示S-Col膜中的微米级纤维是由直径为 50nm的原纤维组装构成，原纤维呈明显的I型胶原的D带特征，约为64.5nm。
图5是取向性表征结果图。
其中，图5(a)的偏振光显微镜图像所示：S-Col薄膜无明显的光学双折射现象，表现为各向同性结构；而E-Col凝胶薄膜中观察到部分区域的光学双折射现象，表明部分区域存在取向排列结构。图5(b)的SAXS数据显示，S-Col的2D SAXS图形显示出一个强度几乎一致的环，说明其为各向同性结构；而E-Col的2D SAXS图形表现出明显的拉长的环，这表明出现了各向异性排列的结构。图5(c)左图的1D-SAXS谱线显示，当q值的范围在0.2-1.2nm-1区域内时，1D-SAXS谱线中S-Col出现了明显的D带特征散射峰(布拉格方程计算的D带约为62.7nm)，而与之前相比，E-Col并没有出现明显的D带特征峰，其为非晶态结构。图5(c)右图所示的1D-SAXS 图谱中，当q值位于0.05nm-1到0.4nm-1区域内时，与S-Col相比，E-Col膜向更高的q值偏移，这表明纤维相排列的收紧。
图6是EDP胶原材料的动静态力学性能表征结果图。
其中，拉伸实施例1所得胶原膜，会产生明显的塑性变形，卸载后形状不可逆(a)。静态机械测试显示，拉伸速率设定在10mm/min，得到胶原膜的应力-应变曲线；E-Col凝胶膜的杨氏模量为0.32±0.11MPa，变形较大，断裂伸长率在220.41±5.07％，拉伸强度在0.13±0.03MPa。E-Col凝胶膜在很小的区域内就发生了应力屈服，这表明内部仅存在较弱的交联机制(b)。动态力学测试显示，E-Col膜显示出较大的变形，加载和卸载循环之间存在明显的滞后，呈现粘弹性的力学特性(c)。
图7是胶原膜可逆性测试结果。
将实施例1制备的胶原膜分别浸泡在pH值为3.5的0.1M的醋酸或0.1M尿素溶液中，在不到10分钟的时间里，E-Col迅速溶解。与之对照的是S-Col持续保持稳定。这表明E-Col膜中分子间结合主要依赖于一些弱分子相互作用，经过醋酸溶解后的溶液能够被再次电沉积以获得E-Col材料。
图8是胶原膜的可控制备。
可见，通过改变恒电流密度以及沉积时间来控制胶原膜的厚度。控制时间0秒到3000秒条件下，电流密度为2.5mA/cm2，胶原膜的厚度范围可从0μm到400μm变化；电流密度为 5mA/cm2，胶原膜的厚度范围可从0μm到450μm变化；电流密度为10mA/cm2，胶原膜的厚度范围可从0μm到550μm变化。
图9是不同宏观几何形状的胶原材料成型图。
可见，改变阴极电极的形状，使用钛管或者一端具有瓣膜形状的不锈钢异形柱作为阴极制备各种异形结构材料。阴极为钛管时，可以获得中空的胶原管(a)；阴极为类似心脏瓣膜形状时，可以获得类心脏瓣膜的胶原异形材料(b)。
具体实施方式
本发明提供了一种电化学沉积生物大分子-胶原蛋白的技术，这是一种在电极表面而非电解液中直接获得胶原材料的方法。且该胶原材料的特征为：以短程取向的胶原微纤组成；胶原排列致密；材料外观透明、结构均匀；可以形成各种结构如膜、管异形材料。与同行报道的电化学沉积制备技术对比，其特色为：电极间距大(厘米级别)、易于操作；制备时间短；不使用有机溶剂就能在电极上直接获得。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：胶原材料制备例I
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0 kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白粘稠液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢80μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取钛片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，发生的电极半反应如下所示。
阳极：2H2O-4e-→4H++O2
阴极：4H2O+4e-→4OH-+2H2。
实验结束后在阴极上出现一层胶原凝胶膜，如图2(a)所示。用超纯水多次清洗带胶原水凝胶膜的阴极，然后从电极上剥离胶原材料E-Col。水平电极和竖直电极均能制备胶原材料，但发现竖直电极制备的材料会因重力原因上薄下厚，采用水平电极可避免此情况。E-Col 胶原材料外观非常均匀，在干态和湿态均高度透明，如图2(b)所示。
实施例2：胶原材料制备例Ⅱ
(1)胶原溶液的配置：准确称取800mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0 kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得20mg/ml的胶原蛋白粘稠液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢160μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取钛片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为20mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例3：胶原材料制备例Ⅲ
(1)胶原溶液的配置：准确称取40mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0kDa) 并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得1mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢50μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取钛片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为1mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例4：胶原材料制备例Ⅳ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为2.0。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0 kDa)并放入装有1000ml水和200ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢80μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取钛片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例5：胶原材料制备例Ⅴ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为4.0。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0 kDa)并放入装有1000ml水和20μl冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢80μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取钛片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例6：胶原材料制备例Ⅵ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0 kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢50μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取钛片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例7：胶原材料制备例Ⅶ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0 kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取钛片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例8：胶原材料制备例Ⅷ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0 kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取铂片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在1.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例9：胶原材料制备例Ⅸ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0 kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取Pt片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在0.5cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例10：胶原材料制备例Ⅹ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0 kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取Pt片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在3.0cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间800秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例11：胶原材料制备例Ⅺ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0 kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取Pt片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在3.0cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间500秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例12：胶原材料制备例Ⅻ
(1)胶原溶液的配置：准确称取400mg I型胶原蛋白于40mL超纯水中，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.5。将其装入透析袋(MWcut off＝7.0 kDa)并放入装有1000ml水和15ml冰醋酸的烧杯中，于4℃下透析72h以去除小分子杂质。透析后获得10mg/ml的胶原蛋白液体。
(2)向步骤(1)所述的胶原溶液中加入过氧化氢200μl/ml，并搅拌均匀，在4℃下以8000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解。
(3)选取Pt片(阴极)作为阴极(电极尺寸2cm x 3cm)，铂丝或铂片(阳极)作为阳极。将两个电极水平平行放置在电解池中(如图1b)，电极之间的距离控制在3.0cm。在电解池中小心加入步骤(2)中所制备的胶原溶液(浓度为10mg/ml)，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡。
(4)然后将电极连接到电化学工作站CHI660E上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为6.67mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间3000秒，实验结束后在阴极上成功制备一层胶原凝胶膜。
实施例13：EDP胶原材料E-Col的理化性能表征
采用同实施例1相同的方法制备E-Col，通过控制电流强度及施加时间，得到凝胶态厚度约为400μm的E-Col。为了比较，透析后的胶原蛋白溶液同时使用溶液法制备成胶原膜 S-Col，用0.5M NaOH将酸性胶原蛋白溶液(5mg/mL；pH＝3.5)调节到中性pH＝7.2，然后浇铸在圆形薄膜培养皿中(单位面积胶原含量与EDP组装的胶原单位面积质量相同)，在 37℃下孵育12小时以完全凝胶化，随后将凝胶在室温下脱水48小时，形成厚度约400μm 的乳白色半透明凝胶膜。
(1)光学性能测试
将上述得到的S-Col和E-Col凝胶态薄膜在超纯水中浸泡1小时，以达到饱和含水量，裁剪成固定大小的尺寸方片置于比色皿内，利用紫外可见光分光光度计(Lambda 950)检测其在可见光波长范围(380nm到800nm)范围内的透光率(％)及雾度(％)(测得数值需扣除比色皿的背景)。E-Col表现出较高的光学透明性，在450nm到780nm范围内(可见光范围)光学透过率接近90％，同时胶原凝胶膜的雾度也很低，在可见光范围内仅为10％。如图3所示。
(2)微观形貌表征
在扫描电子显微镜(SEM,S-4800,Hitachi)上进行了微观形貌分析。采用透射电镜(TEM, JEM-2100,JEOL)观察其内部超微结构。首先分别先将上述得到的S-Col和E-Col凝胶态薄膜材料使用一系列分级的乙醇脱水，然后嵌入Eponate12树脂(Ted Pella,Redding,CA)。将 60-90nm的薄片置于裸露的铜栅格上，然后用醋酸铀酰和铅染色。图像在200kV的加速电压下拍摄。图4为不同方法所得到的胶原膜的SEM的表面和断面图像。图4(a)显示，E-Col 膜具有致密的组织结构(密度为0.88g/cm3)，表面和断面均有取向排列的纳米纤维。相比之下，溶液组装的S-Col膜内部是一个松散的网络(密度为0.45g/cm3)，其中随机聚集了较粗的纤维(直径约几微米)。
图4(b)的TEM图像显示，E-Col由较细的微纤维紧密组织而成，高倍TEM揭示其直径约为10nm，没有明显的胶原纤维特征D带。与之相比，S-Col中存在微米级尺寸的疏松排列的纤维，高倍TEM图像显示S-Col膜中的微米级纤维是由直径为50nm的原纤维组装构成，原纤维呈明显的I型胶原的D带特征(约为64.5nm)。
(3)取向性表征
分别通过偏振光显微镜和小角x射线散射(SAXS)考察E-Col的取向结构。
小角x射线散射(SAXS)实验在上海同步辐射装置的BL19U2SAXS束线上进行。散射数据是在样品到探测器的距离为1900mm处用x射线束照明获得的。对样品进行60秒的测量，获得散射信号。2D SAXS数据平均成一维散射强度曲线与q，背景设置为一个多项式函数，通过每个SAXS曲线的散射最小值。利用公式(I)和(II)计算Herman取向因子(f)量化胶原网络的对齐程度：
其中φ为方位角，I(φ)为减去背景强度后随方位角的1D强度分布。平均cos2φ通过沿φ积分特定2θ衍射峰的强度计算，使用上述方程。各向同性材料fc＝0，和对理想面向单向地材料,fc＝1。
首先，如图5(a)的偏振光显微镜POM图像所示：S-Col薄膜无明显的光学双折射现象，表现为各向同性结构；而E-Col凝胶薄膜中观察到部分区域的光学双折射现象，表明部分区域存在取向排列结构。图5(b)的SAXS数据显示，S-Col的2D SAXS图形显示出一个强度几乎一致的环，说明其为各向同性结构；而E-Col的2D SAXS图形表现出明显的拉长的环，这表明出现了各向异性排列的结构。图5(c)左图的1D-SAXS谱线显示，当q值的范围在0.2-1.2nm-1区域内时，1D-SAXS谱线中S-Col出现了明显的D带特征散射峰(布拉格方程计算的D带约为62.7nm)，而与之前相比，E-Col并没有出现明显的D带特征峰，其为非晶态结构。图 5(c)右图所示的1D-SAXS图谱中，当q值位于0.05nm-1到0.4nm-1区域内时，与S-Col相比，E-Col膜向更高的q值偏移，这表明纤维相排列的收紧。
实施例14：EDP胶原材料的动静态力学性能表征
如实施例1所述的胶原膜，将其裁剪成长度30mm，宽度10mm的矩形样条。将其拉伸，会产生明显的塑性变形，卸载后形状不可逆，如图6(a)所示。采用Electro-Force3200型生物动力试验仪，研究了水凝胶在室温下的静态和动态拉伸性能。
对于静态机械测试，拉伸速率设定在10mm/min，得到胶原膜的应力-应变曲线。E-Col 凝胶膜的杨氏模量为0.32±0.11MPa，变形较大，断裂伸长率在220.41±5.07％，拉伸强度在0.13±0.03MPa。E-Col凝胶膜在很小的区域内就发生了应力屈服，这表明内部仅存在较弱的交联机制(即非共价键相互作用)，如图6(b)所示。
对于动态力学测试，E-Col薄膜的加卸载过程设定在0.001N-0.04N之间。设定拉伸速率为0.2N min-1，循环10次得到胶原膜的动态循环拉伸曲线。E-Col膜显示出较大的变形，加载和卸载循环之间存在明显的滞后，呈现粘弹性的力学特性，如图6(c)所示。
实施例15：EDP胶原材料的可逆性
采用实施例1制备的胶原膜，将其分别浸泡在pH值为3.5的0.1M的醋酸或0.1M尿素(一种强烈的氢键屏蔽剂)溶液中，在不到10分钟的时间里，E-Col就迅速溶解，如图7所示。与之对照的是S-Col持续保持稳定。这表明E-Col膜中分子间结合主要依赖于一些弱分子相互作用，例如氢键以及疏水相互作用。E-Col经过醋酸溶解后的溶液，能够被再次电沉积以获得E-Col材料。
实施例16：E-Col膜的可控制备
以实施例1的制备方法为基础，阴极钛片尺寸减小为1cm x 1cm，改变恒电流密度(2.5 mA/cm2、5mA/cm2和10mA/cm2)以及沉积时间(500，1000，2000，3000s)，其它条件不变，得到不同厚度的胶原膜。
通过测量湿态条件下样品厚度可得到厚度随恒电流密度及沉积时间的关系。如图8所示，可通过改变恒电流密度以及沉积时间来控制胶原膜的厚度。
控制时间0秒到3000秒条件下，电流密度为2.5mA/cm2，胶原膜的厚度范围可从0μm到400μm变化；
电流密度为5mA/cm2，胶原膜的厚度范围可从0μm到450μm变化；
电流密度为10mA/cm2，胶原膜的厚度范围可从0μm到550μm变化。
实施例17：不同宏观几何形状的胶原材料成型
为了证明改进EDP技术的通用性，可以产生各种形状的宏观胶原结构，我们改变阴极电极(阴极)的形状，使用钛管(外径6.0mm，内径5.0mm)或者一端具有瓣膜形状的不锈钢异形柱作为阴极，采用上述实施例1的EDP技术制备各种异形结构材料。阴极为钛管时，可以获得中空的胶原管，如图9(a)所示。阴极为类似心脏瓣膜形状时，可以获得类心脏瓣膜的胶原异形材料，如图9(b)所示。
上述相关说明以及对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些内容做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述相关说明以及对实施例的描述，本领域的技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种从电极剥离的胶原材料的制备方法，其特征在于，在胶原溶液中添加过氧化氢和醋酸，通过电化学方法在电极制备可从电极剥离的胶原材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，胶原溶液的配置：在胶原蛋白溶液中添加醋酸使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为1.5-4.0，去杂、浓缩后获取浓度在1-20mg/ml范围的胶原溶液；
S2，向步骤S1获得的胶原溶液中加入过氧化氢标准液体，使其在溶液中的终体积百分比为5％-17％，并搅拌、除去气泡，置于0-10℃备用；
S3，将阳极和阴极平行放置在电解池中电极之间的距离控制在0.5-3.0cm，在电解池中缓慢加入步骤S2所制备的胶原溶液；
S4，进行电化学沉积，沉积时间8-60分钟，获得能从阴极上直接剥离的胶原凝胶膜。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
阴极选自但不限于不锈钢、碳纸、碳布、Pt电极、金电极、石墨电极、Ti电极；阳极选自但不限于不锈钢、碳纸、碳布、Pt电极、金电极、石墨电极，Ti不用于阳极；或者，
电极的安装方式包括：将两个电极垂直平行放置在电解池中，或者将两个电极水平平行放置在电解池中；
或者，电极之间的距离控制在1.0-2.5cm。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
步骤S1中调节加入胶原蛋白原料的质量，使最终获取的胶原溶液浓度在5-10mg/ml；
或者，步骤S2加入的过氧化氢浓度为20-150μl/ml；离心速度6000-8000rpm/min的速度离心；
或者，步骤S3电极距离为1.0-2.0cm；
或者，步骤S4中，以恒电流方式或者恒电压方式进行电化学沉积。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
步骤S1中胶原溶液的配置为：按照400mg I型胶原蛋白溶于40mL超纯水的比例准确称取胶原蛋白和超纯水，滴加冰醋酸并充分搅拌，促使胶原完全溶解，调节最终溶液的pH值为3.0-4.0；装入MWcut off＝7.0kDa的透析袋一并放入装有冰醋酸的水溶液中，于0-5℃下透析3天以去除小分子杂质；透析后获得胶原蛋白粘稠液体；
或者，步骤S2中，向步骤S1所述的胶原溶液中加入过氧化氢50-100μl/ml，并搅拌均匀，在0-5℃下以5000-10000rpm/min的速度离心除去气泡，将离心完毕的胶原溶液放置在冰水混合浴中保存，防止过氧化氢的分解；
或者，步骤S3中，选取钛片作为阴极，铂丝或铂片作为阳极，在电解池中小心加入步骤S2中所制备的胶原溶液，加入时要缓慢，防止因溶液黏度过大带来气泡；
或者，步骤S4中，然后将电极连接到电化学工作站上，施加阴极电压，采用恒电流沉积，电流密度为5-10mA/cm2，电压变化范围在1-1.5V/cm2，沉积时间500-2000秒。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，电极半反应如下：
阳极：2H2O-4e-→4H++O2；或者，
阴极：4H2O+4e-→4OH-+2H2。
7.一种胶原凝胶膜，其特征在于，其外观非常均匀，在干态和湿态均高度透明；以短程取向的胶原微纤以非共价键连接而成；胶原排列致密；胶原材料能被溶剂再次溶解，循环制备；或者，胶原材料的湿态膜的厚度范围为180-550μm。
8.如权利要求7所述的胶原凝胶膜，其特征在于，由权利要求1-6中任意一项所述的制备方法获得。
9.权利要求1所述的制备方法的应用，其特征在于，使用该制备方法在电极上制备胶原凝胶膜，进而获得胶原材料。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，根据阴极的形状制备同样形状的胶原异形材料。
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