CN110404110B - 一种耐缝合的胶原基角膜再生修复材料及其制备方法 - Google Patents

一种耐缝合的胶原基角膜再生修复材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医用材料领域,公开了一种耐缝合的胶原基角膜再生修复材料及其制备方法。将胶原加入到盐酸中溶解,然后加入EDC/NHS交联剂进行交联反应,加热浓缩,得到交联胶原溶液,经脱泡后加入到培养皿中至一定厚度,然后将PCL圆环平铺到交联胶原溶液底部,风干,清洗,得到复合膜;将所得复合膜在模具中经100~120℃热压二次成型,得到耐缝合的胶原基角膜再生修复材料。本发明所得耐缝合的胶原基角膜再生修复材料生物相容性良好,耐手术中的常规缝合,并且角膜上皮细胞可以在本材料的表面上粘附和增殖,从而实现手术中角膜上皮细胞在植片上的快速上皮化,最终达到角膜缺损修复和角膜替代的目的。

Description

一种耐缝合的胶原基角膜再生修复材料及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料领域,具体涉及一种耐缝合的胶原基角膜再生修复材料及其制备方法。
背景技术
角膜是人眼睛表面一个透明的,无血管的组织,它的完整性对于正常视觉非常重要。许多因素如机械、热、化学损伤及微生物感染等可使透明的角膜出现灰白色的混浊,从而引起视力减退,甚至失明,称为角膜病。角膜病患病率高、致盲性强。目前,在角膜损伤的临床治疗中,抗生素、类固醇激素、胶原酶抑制剂、抗氧化等药物治疗和羊膜移植、自体角膜缘干细胞移植以及角膜移植等手术治疗,对于轻中度的角膜损伤可达到良好治疗效果,但对于累及角膜深层的损伤、严重基质瘢痕形成、新生血管形成及角膜缘干细胞失代偿者,治疗效果不甚理想。同种异体角膜移植是目前角膜疾病患者最有效的方法,但由于供体的缺乏、免疫排斥或者生物相容性、感染等问题,修复治疗难以获得很好的疗效并满足日益增加的医疗需求。为解决上述问题,异体角膜即人工角膜迫切需要。
近年来,组织工程角膜研究的兴起和发展为角膜患者带来新的希望,如猪角膜脱细胞基质、高分子聚合物、胶原及壳聚糖支架等。其中,脱细胞猪角膜基质因具有较好的透光率、生物力学性能及生物组织相容性,在动物实验和临床治疗方面取得了较好的效果。然而,脱细胞猪角膜基质是异种移植物,脱细胞处理后保留的细胞外基质具有潜在的抗原性;同时还具有传播潜在的动物相关性疾病的危险,因此其安全性尚需要长期的随访研究。另外,在合成替代角膜的各种材料中,重组人胶原蛋白被认为是用于制造角膜植入物有前景的材料,因为它的无毒性、非免疫原性和生物相容性。迄今为止,已有患者使用交联的重组人胶原蛋白角膜植入物取得良好的效果。然而,这些现有的植入物各有缺陷,包括拉伸强度不足,不利于常规缝合等。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处,本发明的首要目的在于提供一种耐缝合的胶原基角膜再生修复材料的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的耐缝合的胶原基角膜再生修复材料。本发明获得的角膜再生修复材料拥有胶原蛋白的活性,而且可实现耐缝合性,甚至可提供一定的光学效果。
本发明目的通过以下技术方案实现:
一种耐缝合的胶原基角膜再生修复材料的制备方法,包括如下制备步骤:
(1)将胶原(Col)加入到盐酸中溶解,然后加入EDC/NHS交联剂进行交联反应,加热浓缩,得到交联胶原溶液;
(2)将步骤(1)所得交联胶原溶液经脱泡后加入到培养皿中,然后将PCL(聚己内酯)圆环平铺到交联胶原溶液底部,风干,清洗,得到复合膜;
(3)将步骤(2)所得复合膜在模具中经100~120℃热压二次成型,得到耐缝合的胶原基角膜再生修复材料。
优选地,所述胶原是指源于牛跟腱的牛跟腱Ⅰ型胶原。
优选地,所述盐酸的浓度为0.01~0.05mol/L。
优选地,所述交联胶原溶液的浓度为5.0~6.5mg/mL。
优选地,步骤(2)中所述交联胶原溶液加入到培养皿中的厚度为5~7mm。
优选地,所述PCL圆环的内径5.0mm,外径为10mm,厚为20~40μm。
优选地,所述PCL的平均分子量为40000~60000。
一种耐缝合的胶原基角膜再生修复材料,通过上述方法制备得到。
本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果:
(1)本发明的制备方法所采用的原材料成本较低,成型工艺简单,有利于规模生产。
(2)本发明所得耐缝合的胶原基角膜再生修复材料在生理盐水中长期浸泡后未发生分层,具有良好的复合稳定性。
(3)本发明所得耐缝合的胶原基角膜再生修复材料生物相容性良好,耐手术中的常规缝合,并且角膜上皮细胞可以在本材料的表面上粘附和增殖,从而实现手术中角膜上皮细胞在植片上的快速上皮化,最终达到角膜缺损修复和角膜替代的目的。
附图说明
图1为实施例1所得耐缝合的胶原基角膜再生修复材料的宏观图。
图2为实施例1制备的耐缝合的胶原基角膜再生修复材料的截面扫描电镜图。
图3为实施例1制备的耐缝合的胶原基角膜再生修复材料的缝线拉伸强度测试图。
图4为实施例1制备的耐缝合的胶原基角膜再生修复材料(Col-PCL)与纯Col及纯PCL材料的的体外细胞增殖实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)将纯化的牛跟腱Ⅰ型胶原用剪刀剪碎,用0.01mol/L的盐酸溶液溶解并在冰浴条件下使用实验室高剪切混合器高速剪切,其转速为6000~7000rpm;
(2)将步骤(1)所得Col溶液使用搅拌桨继续搅拌,并将15mg/mL的EDC/NHS交联剂按一定的量缓慢加入到搅拌中的Col溶液中,在4℃条件下搅拌24h,其中Col:EDC:NHS质量比为6:1:1;
(3)取步骤(2)中的少量交联后的Col溶液在远红外干燥箱中浓缩,并计算Col溶液的浓度,调整Col溶液的最终浓度为5mg/mL;
(4)将步骤(3)所得的Col溶液室温慢速搅拌2h,离心除气泡,其中搅拌桨的转速为120rpm;
(5)将步骤(4)所得的Col溶液按35mL的量注入到直径为90mm的一次性细菌培养皿中,再将裁剪好的内径为5.0mm,外径为10mm,厚为40μm的PCL圆环平铺到胶原溶液底部,用50mL注射器的针头挑除少量气泡后风干成膜;
(6)待步骤(5)所得膜风干后,用无菌水多次水洗胶原基角膜再生修复材料,再次风干;
(7)将步骤(6)得到的胶原基角膜用10mm的角膜环钻取出,放进具有一定曲率的模具中,然后放入温度为120℃的真空干燥箱中进行热压24h二次成型,即得到一种耐缝合的胶原基角膜再生修复材料。
由于胶原分子可以在酸溶液中均匀分散,随着溶液的不断挥发,分子间的自组装使得胶原基角膜再生修复材料内部结构层状有序。图1是本实施例所得耐缝合的胶原基角膜修复材料的宏观图,可以看出胶原基角膜修复材料透明性较好,而且具有一定的曲率。PCL的熔点为64℃,当Col-PCL复合膜被放入真空干燥箱后,PCL会重新熔解并与Col重构。图2是本实施例制备的耐缝合的胶原基角膜再生修复材料的截面扫描电镜图。从图2中可以看出,胶原基角膜再生修复材料的核心部(Col)为层状有序结构,纯PCL为致密无序结构,周围具有较强机械性能的固定部(Col-PCL)具有局部的致密和层状有序结构,这主要是因PCL熔解后与Col的重构现象,这也是在生理盐水浸泡1月未见分层的主要原因。在手术缝合过程中,常因植片的缝合拉伸性能不足而导致手术失败。在前期的工作中由于纯Col植片无法满足临床手术缝合需求,因此利用高分子材料PCL的强拉伸性能解决手术过程中遇到的缝口撕裂问题。图3是本实施例所得胶原基角膜再生修复材料的缝线拉伸强度测试图,从图中可知,制备的胶原基角膜再生修复材料相比纯Col明显提高了拉伸性能,并且具有极显著性差异,这解决了手术中难于缝合问题。图4是本实施例制备的耐缝合的胶原基角膜再生修复材料(Col-PCL)与纯Col及纯PCL材料的体外细胞增殖实验结果图。由图中可知,在第五天时,制备的胶原基角膜再生修复材料与纯Col和纯PCL无显著性差异,但与空白对照组具有显著性差异。随着时间增加,人角膜上皮细胞明显可在胶原基角膜再生修复材料上粘附并增殖。这一结果与生物材料具有粘附与增殖的效果相符合,但增殖效果又弱于孔板上的增殖。
实施例2
(1)将纯化的牛跟腱Ⅰ型胶原用剪刀剪碎,用0.01mol/L的盐酸溶液溶解并在冰浴条件下使用实验室高剪切混合器高速剪切,其转速为6000~7000rpm;
(2)将步骤(1)所得Col溶液使用搅拌桨继续搅拌,并将15mg/mL的EDC/NHS交联剂按一定的量缓慢加入到搅拌中的Col溶液中,在4℃条件下搅拌24h,其中Col:EDC:NHS质量比为6:1:1;
(3)取步骤(2)中的少量交联后的Col溶液在远红外干燥箱中浓缩,并计算Col溶液的浓度,调整Col溶液的最终浓度为6mg/mL;
(4)将步骤(3)所得的Col溶液室温慢速搅拌2h,离心除气泡,其中搅拌桨的转速为120rpm;
(5)将步骤(4)所得的Col溶液按30mL的量注入到直径为90mm的一次性细菌培养皿中,再将裁剪好的内径为5.0mm,外径为10mm,厚为35μm的PCL圆环平铺到胶原溶液底部,用50mL注射器的针头挑除少量气泡后风干成膜;
(6)待步骤(5)所得膜风干后,用无菌水多次水洗胶原基角膜再生修复材料,再次风干;
(7)将步骤(6)得到的胶原基角膜用10mm的角膜环钻取出,放进具有一定曲率的模具中,然后放入温度为120℃的真空干燥箱中进行热压24h二次成型,即得到一种耐缝合的胶原基角膜再生修复材料。
实施例3
(1)将纯化的牛跟腱Ⅰ型胶原用剪刀剪碎,用0.01mol/L的盐酸溶液溶解并在冰浴条件下使用实验室高剪切混合器高速剪切,其转速为6000~7000rpm;
(2)将步骤(1)所得Col溶液使用搅拌桨继续搅拌,并将15mg/mL的EDC/NHS交联剂按一定的量缓慢加入到搅拌中的Col溶液中,在4℃条件下搅拌24h,其中Col:EDC:NHS质量比为6:1:1;
(3)取步骤(2)中的少量交联后的Col溶液在远红外干燥箱中浓缩,并计算Col溶液的浓度,调整Col溶液的最终浓度为6.5mg/mL;
(4)将步骤(3)所得的Col溶液室温慢速搅拌2h,离心除气泡,其中搅拌桨的转速为120rpm;
(5)将步骤(4)所得的Col溶液按25mL的量注入到直径为90mm的一次性细菌培养皿中,再将裁剪好的内径为5.0mm,外径为10mm,厚为30μm的PCL圆环平铺到胶原溶液底部,用50mL注射器的针头挑除少量气泡后风干成膜;
(6)待步骤(5)所得膜风干后,用无菌水多次水洗胶原基角膜再生修复材料,再次风干;
(7)将步骤(6)得到的胶原基角膜用10mm的角膜环钻取出,放进具有一定曲率的模具中,然后放入温度为120℃的真空干燥箱中进行热压24h二次成型,即得到一种耐缝合的胶原基角膜再生修复材料。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种耐缝合的胶原基角膜再生修复材料的制备方法,其特征在于包括如下制备步骤:
(1)将胶原加入到盐酸中溶解,然后加入EDC/NHS交联剂进行交联反应,加热浓缩,得到交联胶原溶液;所述交联胶原溶液的浓度为5~6.5mg/mL;
(2)将步骤(1)所得交联胶原溶液经脱泡后加入到培养皿中至一定厚度,然后将PCL圆环平铺到交联胶原溶液底部,风干,清洗,得到复合膜;所述交联胶原溶液加入到培养皿中的厚度为5~7mm;
(3)将步骤(2)所得复合膜在模具中经100~120℃真空热压二次成型,得到耐缝合的胶原基角膜再生修复材料。
2.根据权利要求1所述的一种耐缝合的胶原基角膜再生修复材料的制备方法,其特征在于:所述胶原是指源于牛跟腱的牛跟腱Ⅰ型胶原。
3.根据权利要求1所述的一种耐缝合的胶原基角膜再生修复材料的制备方法,其特征在于:所述盐酸的浓度为0.01~0.05mol/L。
4.根据权利要求1所述的一种耐缝合的胶原基角膜再生修复材料的制备方法,其特征在于:所述PCL圆环的内径5.0mm,外径为10mm,厚为20~40μm。
5.根据权利要求1所述的一种耐缝合的胶原基角膜再生修复材料的制备方法,其特征在于:所述PCL的平均分子量为40000~60000。
6.一种耐缝合的胶原基角膜再生修复材料,其特征在于:通过权利要求1~5任一项所述的方法制备得到。
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