CN113336973B

CN113336973B - 一种促修复双网络水凝胶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN113336973B
Application number: CN202110714167.4A
Authority: CN
Inventors: 白莹; 沈宣任; 韩建东
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2021-06-25
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2022-11-08
Anticipated expiration: 2041-06-25
Also published as: CN113336973A

Abstract

本发明公开了一种促修复双网络水凝胶及其制备方法与应用。制备方法包括如下步骤：(1)将冻干处理后的去细胞角膜基质消化，加入磷酸盐缓冲液，得到去细胞角膜基质水凝胶溶液；(2)将改性透明质酸或改性明胶溶解于引发剂溶液中，与去细胞角膜基质水凝胶溶液混合，加入交联剂混匀，紫外照射，得到促修复双网络水凝胶。促修复双网络水凝胶凝胶化前具有良好流动性，能够快速填补角膜伤口，具有很好的透光度和组织黏附性，无需预先得到精确尺寸，无需缝合；组分模拟组织微环境，利于细胞黏附生长；结构稳定、力学强度高、降解慢；可作为角膜伤口粘合剂、角膜穿孔封堵剂和无缝合板层角膜替代物。

Description

一种促修复双网络水凝胶及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及水凝胶材料技术领域，尤其涉及一种促修复双网络水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术

角膜位于眼球的最前部，是一种高度透明组织，为人眼提供总屈光力的四分之三。但与外界环境直接接触的角膜极易受到损伤而视力下降，甚至引发角膜盲。角膜移植是治疗角膜盲最有效的手段，但是由于供体的严重短缺，绝大多数患者无法复明。生物医用材料制备的水凝胶在过去20年被广泛地应用于角膜替代物的研究以促进角膜伤口的恢复，但是这种预先成型的水凝胶需要精确的尺寸、形状并经受手术缝合。缝线缝合可能会导致术后散光，缝线还会引起炎症，导致血管生成，增加感染风险等，这便需要眼科医生高的技能水平和特定的手术场所，也给实际应用带来困难。

目前，在临床上用于无缝线稳定角膜伤口和封堵角膜缺口的产品主要有氰基丙烯酸酯胶，但氰基丙烯酸酯胶的不透明性、毒性和较快降解使其只能短暂封堵缺口，后续患者还需要接受角膜移植。与合成水凝胶相比，天然水凝胶能更好地促进组织修复。用于角膜伤口修复的天然水凝胶包括胶原、明胶、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素等，但均为单一组分，无法完全模拟角膜体内环境，生物性能有限。改性透明质酸/明胶经过交联能够形成连续的大分子网络，具有更好的机械强度和稳定性，但其对角膜细胞，包括角膜上皮细胞和角膜基质细胞弱的黏附能力也限制了其在促进角膜再生中的应用。

基于去细胞基质（dECM）的水凝胶来源于组织/器官，组织/器官通过合适的脱细胞方法能够去除免疫原性，保留原组织/器官所含蛋白质（胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等）、多糖（甘聚糖、蛋白多糖、糖蛋白等）和生长因子等活性物质。相比单一组分的天然水凝胶，dECM能够更好模拟原生组织微环境，为细胞提供更多附着位点和营养物质，保证细胞黏附和生长，促进组织的再生。去细胞角膜基质（dCECM）来源于不同物种的角膜组织，其保留角膜组织所特有的蛋白质、多糖、生长因子等活性物质，更能够促进角膜组织的再生，在眼科领域具有很好的应用前景。

猪来源的去细胞角膜基质（dCECM）水凝胶来源广，在37 ℃下能够凝胶化，但是通过这种方法所得到的水凝胶透明度低、强度弱，同时眼表也很难维持37 ℃的成胶条件。虽然交联剂的引入能够在室温条件下显著提高脱细胞角膜基质水凝胶的强度和透明度，但是其在面对眼表修复过程中分泌的胶原酶、金属蛋白酶等降解过快，无法长期停留在角膜伤口上，无法满足作为角膜替代物的要求。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种促修复双网络水凝胶。

本发明的另一目的在于提供上述促修复双网络水凝胶的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述促修复双网络水凝胶的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种促修复双网络水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

（1）去细胞角膜基质水凝胶的制备

将冻干处理后的去细胞角膜基质采用胃蛋白酶溶液消化，得到均相消化液，加入磷酸盐缓冲液（PBS），得到去细胞角膜基质（dCECM）水凝胶溶液；

（2）促修复双网络水凝胶的制备

将改性透明质酸或改性明胶与引发剂溶液混合，与步骤（1）中所述去细胞角膜基质水凝胶溶液混合，加入交联剂混匀，紫外照射，得到促修复双网络水凝胶。

优选地，步骤（1）中所述去细胞角膜基质采用猪角膜破碎得到。

优选地，步骤（1）中所述胃蛋白酶溶液为盐酸溶液溶解胃蛋白酶得到。

优选地，步骤（1）中所述胃蛋白酶溶液的用量为胃蛋白酶与所述去细胞角膜基质的质量比为1:10。

优选地，所述盐酸溶液的浓度为0.01 mol/L。

优选地，步骤（1）中所述消化为搅拌消化至不存在基质块材料。

优选地，步骤（1）中所述消化完毕后，采用NaOH溶液调节pH至中性，以终止消化。

优选地，步骤（1）中所述PBS的用量为其与均相消化液的体积比为1:9。

优选地，步骤（2）中所述交联剂也可在步骤（1）中制备去细胞角膜基质水凝胶溶液过程中与PBS一同加入。

优选地，步骤（2）中所述改性透明质酸为甲基丙烯酸酐化透明质酸（HA-MA）、硫醇化透明质酸（HA-SH）、邻苯二酚修饰的透明质酸中的一种或几种。

优选地，步骤（2）中所述改性明胶为甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）。

优选地，步骤（2）中所述改性透明质酸或改性明胶和去细胞角膜基质水凝胶的质量比为40:1~1:20。

优选地，步骤（2）中所述去细胞角膜基质水凝胶在体系中的浓度为1~ 100 mg/mL。

优选地，步骤（2）中所述改性透明质酸和改性明胶在体系中的的浓度为1~ 400mg/mL。

优选地，步骤（2）中所述引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐（LAP）、AIBN、NaIO₄等中的一种。

优选地，步骤（2）中所述引发剂溶液在体系中的浓度为0.001~ 30 mg/mL。

优选地，步骤（2）中所述引发剂溶液采用的溶剂为PBS。

优选地，步骤（2）中所述交联剂为羧甲基纤维素/N-羟基琥珀酰亚胺（CMC/NHS）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）及京尼平等中的一种。

优选地，所述CMC/NHS中CMC和NHS的摩尔比为1:10 ~ 10:1。

优选地，所述EDC/NHS中EDC和NHS的摩尔比为1:10 ~ 10:1。

优选地，所述CMC/NHS与dCECM按照n（CMC）: m（dCECM）=1:5 ~ 1:100配比。

优选地，所述EDC/NHS与dCECM按照n（EDC）: m（dCECM）=1:5~1:100配比。

优选地，步骤（2）中所述混匀的方式为震荡混匀。

优选地，步骤（2）中所述与去细胞角膜基质水凝胶溶液混合之后，可加入种子细胞或者生长因子、药物，得到的促修复双网络水凝胶可进一步促进角膜再生。

优选地，所述药物为维生素C、胰岛素、转化生长因子β（TGF-β）等。

优选地，步骤（2）中所述紫外照射为采用波长320~500 nm的紫外光照射5 ~ 90 s。

一种促修复双网络水凝胶，通过上述制备方法制备得到。

上述促修复双网络水凝胶在组织修复和再生中的应用。

优选地，所述组织为角膜。

优选地，所述应用是将促修复双网络水凝胶作为角膜伤口粘合剂、角膜穿孔封堵剂或无缝合的板层角膜替代物。

优选地，所述促修复双网络水凝胶可作为细胞或分子载体，负载生长因子、细胞、药物等，进一步促进修复。

优选地，所述药物为维生素C、胰岛素、转化生长因子β等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的促修复双网络水凝胶凝胶化前具有良好流动性，能够快速填补角膜伤口，具有很好的透光度和组织黏附性，无需预先得到精确尺寸，无需缝合。水凝胶的组分能够很好模拟组织微环境，有利于细胞黏附生长，能够作为细胞或分子载体，负载细胞、生长因子或药物，促进组织再生。同时，改性透明质酸或改性明胶与去细胞基质水凝胶通过交联剂和引发剂形成连续的大分子网络，结构稳定、力学强度高、降解慢。本发明的促修复双网络生物水凝胶可作为角膜伤口粘合剂、角膜穿孔封堵剂和无缝合的板层角膜替代物，来源广，能够很好满足临床需求。

附图说明

图1为实施例1制备得到的1% HA-MA水凝胶实物图。

图2为实施例2和实施例3分别用37℃热引发和交联剂CMC/NHS引发得到的dCECM水凝胶实物对比图；其中，A为37℃热引发，B为CMC/NHS引发；图2及其他图中CECM均代表去细胞角膜基质水凝胶。

图3为实施例4和实施例5分别使用37℃热引发和交联剂CMC/NHS交联的双网络水凝胶实物对比图；其中，A为37℃热引发，B、C为CMC/NHS引发。

图4为实施例1-5中各水凝胶的储能模量检测结果图。

图5为实施例1-5中各水凝胶的透明度测试结果图。

图6为实施例1、3、5中各水凝胶的SEM图；其中，A是实施例1，B是实施例3，C是实施例5。

图7为实施例1、3、5、6、7对角膜上皮细胞的Live/Dead染色图。

图8为实施例1、3、5对角膜基质细胞的Live/Dead染色图。

图9为实施例5的水凝胶混合角膜基质细胞的光学图。

图10为实施例3和5的水凝胶作为无缝合板层角膜替代物的效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的HA-MA、HA-SH、邻苯二酚修饰的透明质酸、GelMA、去细胞角膜基质采用市面购买的商品或自主合成均可。

实施例1

称取10mg HA-MA，用1mL含3mg/mL LAP的1×PBS溶液将其溶解。用波长为320 ~500 nm的紫外灯照射15 s，得到1%w/v HA-MA水凝胶（图1）。

水凝胶如图1所示，说明透明质酸具有优秀的透明度，能够满足眼科使用需求。

HA-MA制备过程：

（1）称取2g分子量范围为5~200万道尔顿的透明质酸，溶解在200mL纯水中，在室温下用磁力搅拌器均匀搅拌至完全溶解。

（2）将完全溶解的透明质酸溶液放于4℃环境下均匀搅拌，缓慢滴加4mL甲基丙烯酸酐溶液，滴加完成后，用NaOH溶液调节pH至8。

（3）在4℃环境下磁力搅拌24h，此过程中不断用NaOH溶液进行调节，使溶液pH维持在8。

（4）反应完成后，将得到的产物装入截留分子量为5000~8000道尔顿的透析袋中。在室温下，置于纯水中透析2天，每12h更换一次纯水。透析完成后将所得改性透明质酸溶液冷冻干燥，得到甲基丙烯酸酐化透明质酸。

实施例2

称取11.11 mg的猪去细胞角膜基质，用1mL胃蛋白酶溶液（胃蛋白酶与去细胞角膜基质的质量比为1:10）消化，用NaOH溶液调节pH至中性以终止消化，加入0.111 mL 10×PBS，得到1% w/v的dCECM水凝胶溶液。放于37℃环境下凝胶化，得到1% dCECM水凝胶（图2A）。

猪去细胞角膜基质的制备：

（1）从新鲜猪眼中取下猪角膜，去除角膜周边的巩膜及结膜，并用1× PBS清洗。

（2）将猪角膜浸泡于纯水中12~24h，使角膜溶胀。

（3）从纯水中取出猪角膜，对其进行反复冻融：放于-40~-80 ℃环境中冷冻1~2h，再自然复温至20~25℃，该过程重复3次。

（4）配置脱氧胆酸钠（SD）溶液，浓度为2% w/v。

（5）将（3）中角膜浸泡于SD溶液中，在0~5℃下震荡2~3h，震荡速度为100~150rpm。

（6）震荡完毕后，取出（5）中角膜，在0~5℃下放于1×PBS中震荡清洗至无泡沫产生，1×PBS每半小时更换一次，震荡速度为100~150 rpm。

（7）将清洗完毕后的去细胞猪角膜冷冻干燥。

实施例3

称取11.11 mg的猪去细胞角膜基质，用1mL胃蛋白酶溶液消化（胃蛋白酶与去细胞角膜基质的质量比为1:10），用NaOH溶液调节pH至中性以终止消化，加入0.111 mL 10×PBS，得到1% w/v dCECM水凝胶溶液。往溶液中加入CMC/NHS，震荡均匀，于25℃静置反应25min，得到1% dCECM水凝胶（图2B）。

实施例2和实施例3的水凝胶如图2所示。通常通过将温度提高到37℃的生理范围能够使去细胞基质水凝胶发生溶胶凝胶转变，这种转变得到的水凝胶性质，比如强度，会因为不同物种、不同组织/器官而不同。37℃热引发得到的dCECM水凝胶力学强度低，无法在圆形模具中成型，透明度低，同时眼表也无法完全满足37℃的成胶条件，因此无法在眼科中使用。CMC/NHS交联剂的引入使得dCECM水凝胶溶液在常温状态下便可成胶，力学强度显著提高，使得水凝胶溶液成胶后能够具有稳定的形状，透明度也显著提高，适合于在眼科中使用。

实施例4

（1）称取20mg HA-MA，用1mL含3mg/mL LAP的1×PBS溶液将其溶解，得到2% w/vHA-MA溶液。

（2）称取22.22 mg的猪去细胞角膜基质，用1 mL胃蛋白酶溶液消化（胃蛋白酶与去细胞角膜基质的质量比为1:10），用NaOH溶液调pH至中性以终止消化，加入0.111 mL 10×PBS，得到2% w/v dCECM水凝胶溶液。

（3）将2% w/v HA-MA溶液和2% w/v dCECM水凝胶溶液等体积混合，得到1% w/vdCECM + 1% w/v HA-MA双网络水凝胶溶液。放于37 ℃环境下凝胶化25 min，用波长为320~ 500 nm的紫外灯照射15 s，得到1% dCECM + 1% HA-MA双网络水凝胶（图3A）。

实施例5

（1）称取20 mg HA-MA，用1mL含3 mg/mL LAP的1×PBS溶液将其溶解，得到2% w/vHA-MA溶液。

（2）称取22.22 mg的猪去细胞角膜基质，用1 mL胃蛋白酶溶液消化（胃蛋白酶与去细胞角膜基质的质量比为1:10），用NaOH溶液调节pH至中性以终止消化，加入0.111 mL 10×PBS，得到2% w/v dCECM水凝胶溶液。

（3）将2% w/v HA-MA溶液和2% w/v dCECM水凝胶溶液等体积混合，得到1% w/vdCECM + 1% w/v HA-MA双网络水凝胶溶液。往溶液中加入CMC/NHS，震荡均匀，于25 ℃下静置反应25 min，用波长为320 ~ 500 nm的紫外灯照射15 s，得到1% w/v dCECM+1% w/v HA-MA双网络水凝胶（图3B）。

图3的结果说明，在37℃成胶条件下，透明质酸的引入虽然能够提高水凝胶的力学性能，但是透明度与单纯的dCECM水凝胶相比有一个显著的降低，而CMC/NHS交联剂可以有效解决透明度低问题，在加入了交联剂引发成胶后，水凝胶底下的数字清晰可见，用该方法制备得到的双网络水凝胶具有很高的透明度（如图3C）。

实施例6

称取100 mg GelMA，在37℃下用1 mL含3 mg/mL LAP的1×PBS溶液将其溶解，用波长为320 ~ 500 nm的紫外灯照射15 s，，得到10% w/v GelMA水凝胶。

GelMA制备过程：

（1）称取5g的明胶，溶解在1×PBS缓冲液中，在60℃下用磁力搅拌器均匀搅拌至完全融解。

（2）往完全溶解的明胶溶液中滴加4mL的甲基丙烯酸酐溶液，在60℃下均匀搅拌3h。

（3）反应完成后，将得到的产物装入截留分子量为5000~8000 道尔顿的透析袋中进行透析。透析完成后将所得的改性明胶溶液冷冻干燥，得到改性后的明胶。

实施例7

（1）称取200 mg GelMA，在37℃下用1 mL含3mg/mL LAP的1×PBS溶液将其溶解，得到20% w/v GelMA溶液。

（2）称取22.22mg的猪去细胞角膜基质，用1mL胃蛋白酶溶液消化（胃蛋白酶与去细胞角膜基质的质量比为1:10），用NaOH溶液调节pH至中性以终止消化，加入0.111mL 10×PBS，得到2% w/v dCECM水凝胶溶液。

（3）将20% w/v GelMA溶液和2% w/v dCECM水凝胶溶液等体积混合得到1% w/vdCECM+10% w/v GelMA双网络水凝胶溶液。往溶液中加入CMC/NHS，震荡均匀，于25℃下静置反应25min，用波长为320~500 nm的紫外灯照射15 s，得到1% w/v dCECM+10% w/v GelMA双网络水凝胶。

表1 实施例1-7中各组分及其用量

物质组分	范围值	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6	实施例7
									猪的去细胞角膜基质（dCECM）浓度(mg/mL)	0~100	0	10	10	10	10	0	10
甲基丙烯酸酐化透明质酸（HA-MA）浓度（mg/mL）	0~400	10	0	0	10	10	0	0
									甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）浓度（mg/mL）	0~400	0	0	0	0	0	100	100
n（CMC）:m（dCECM）	1:5 ~ 1:100	0	0	1:50	0	1:50	0	1:50
									n （CMC）:n（NHS）	1:10~10:1	0	0	1:1	0	2:1	0	2:1
LAP浓度（mg/mL）	0.001~30	3	0	0	3	3	3	3
									成胶温度（℃）	20~37	25	37	25	37	25	25	25

1、使用哈克流变仪在相应的成胶条件下对获得水凝胶进行流变测试，平行平板直径为25mm，间距0.5mm，样品在1%应变和1Hz的固定频率下承受荷载。检测结果如图4所示。

检测结果说明，首先，交联剂的加入能够显著提高dCECM水凝胶的力学强度，对于实施例3制备的1% w/v dCECM水凝胶而言，储能模量从68 Pa提升至735 Pa。其次，透明质酸具有优秀的力学性能，能够增强双网络水凝胶中的机械性能，提高结构稳定性，降低降解速率。再者，在CMC/NHS交联及LAP引发光交联作用下，能够得到双网络水凝胶。双网络结构的存在也进一步提高水凝胶的强度，在所有的组别中，实施例5制备的双网络水凝胶具有最高的储能模量，达到3214 Pa。最后，CMC/NHS合适的交联速度给予操作者足够的操作窗口期，光引发剂LAP的引入能够使得双网络水凝胶在合适的时间点，如流变图中的第27 min，快速引发成型，便于在手术中使用。

2、使用紫外可见近红外分光光度计对成型的水凝胶在320 ~ 800nm的可见光范围内进行透明度测试，检测结果如图5所示。

检测结果说明，交联剂的加入能够显著提高dCECM水凝胶和双网络水凝胶的透明度。实施例5制备的双网络水凝胶的透明度在可见光波长内均超过80%，非常适合于眼科中使用。

3、将实施例1、3、5制备的水凝胶采用扫描电子显微镜（SEM）进行拍照，结果如图6所示。

结果显示，与实施例1和实施例3的HA-MA水凝胶和CECM水凝胶相比，双重交联的引入在提高水凝胶交联密度及各项性能的同时，并不会改变实施例5制备的双网络水凝胶的多孔结构。这种多孔结构有利于营养物质的运输和吸收。足够的孔隙大小能够为细胞提供生存空间，减少对细胞的破坏。同时在注射于眼表后，多孔结构有利于宿主细胞的入侵及生长。

4、在获得的无菌成型水凝胶（实施例1、5、6、7制备）表面分别种植人角膜上皮细胞（hce2，ATCC）和原代兔角膜基质细胞（提取方法于文献“Construction of therecellularized corneal stroma using porous acellularcorneal scaffold”中记载，doi:10.1016/j.biomaterials.2011.05.084），分别加入角膜上皮细胞培养基（含10% FBS和1%双抗的DMEM/F12）和角膜基质细胞培养基（含10% FBS和1%双抗的DMEM），培养基两天一换，于细胞培养箱（37℃，5%CO₂）中培养4天后，用Live/Dead试剂盒进行染色检测。检测结果如图7、8所示。

结果说明，实施例5和实施例7制备得到的双网络水凝胶具有优秀的细胞相容性，这归功于双网络水凝胶中的dCECM组分。在纯的HA-MA水凝胶（实施例1制备）和GelMA水凝胶（实施例6制备）中，角膜上皮细胞及角膜基质细胞无法黏附和铺展生长，只能成团轻微粘在材料表面或漂浮于培养基中。但实施例5和实施例7制备的双网络水凝胶，dCECM组分的存在能够使角膜上皮细胞和角膜基质细胞在双网络水凝胶上更好的黏附生长，这有利于角膜上皮化和促进角膜基质再生。

5、将实施例5步骤2中的10×PBS替换成10×DMEM培养基，获得的预聚液与角膜基质细胞混合均匀后，将其注射入培养板的孔板上，用波长为320 ~ 500 nm的紫外灯照射15s引发成胶。之后立即加入培养基并于培养箱（37℃，5%CO₂）中培养，放于光镜下观察。结果如图9所示。

结果说明，由于实施例5制备的双网络水凝胶凝胶前为流动态，角膜基质细胞能够与水凝胶混合均匀。成胶之后，角膜基质细胞均匀地分布在水凝胶中。此外，还可混合其他生长因子或药物，如维生素C、胰岛素、β-TGF等。

6、用直径为3.5 mm的眼科环钻在兔眼中创建深度为兔角膜厚度1/3的板层角膜缺口，将实施例3和实施例5制备得到的水凝胶预聚液注射于板层缺口上，在兔眼缺口中获得合适的角膜弧度后，用波长为320 ~ 500 nm的紫外灯照射15 s使其成胶，期间不需要任何手术缝合。结果如图10所示。

结果说明，实施例5制备的水凝胶，利用水凝胶凝胶前的流动性可以很好的填补角膜缺口，不需要预先的形状和尺寸。成胶之后能够牢固的黏附在角膜伤口上，不需要手术缝合，方便高效，同时避免手术缝合带来的额外损伤。在长时间的观察结果可看到，在面对眼表修复过程中的胶原酶、金属蛋白酶等酶环境时，实施例3制备的纯的去细胞角膜基质水凝胶在多种酶的作用下快速降解，原先的角膜缺口出现，角膜弧度缺失。而同一时刻实施例5制备的双网络水凝胶在动物体内仍具有很好的透明度，水凝胶未见降解，侧视图显示其依然能够很好维持角膜缺口弧度，看不到明显的水凝胶与宿主角膜分界，说明透明质酸组分及双网络结构能够极大维持角膜结构稳定性，延缓降解速度使得角膜基质的修复速度与水凝胶降解速度相匹配，得到角膜替代物的无需缝合，具有作为板层角膜替代物的潜力。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种促修复双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）去细胞角膜基质水凝胶的制备

将冻干处理后的去细胞角膜基质采用胃蛋白酶溶液消化，得到均相消化液，加入磷酸盐缓冲液PBS，得到去细胞角膜基质dCECM水凝胶溶液；

（2）促修复双网络水凝胶的制备

将改性透明质酸与引发剂溶液混合，与步骤（1）中所述去细胞角膜基质水凝胶溶液混合，加入交联剂混匀，紫外照射，得到促修复双网络水凝胶；

步骤（2）中所述交联剂为羧甲基纤维素/N-羟基琥珀酰亚胺CMC/NHS、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺EDC/NHS及京尼平中的一种；

所述CMC/NHS与dCECM按照n（CMC）: m（dCECM）=1:5 ~ 1:100配比；

步骤（2）中所述改性透明质酸和去细胞角膜基质水凝胶的质量比为40:1~1:20；

步骤（2）中所述改性透明质酸为甲基丙烯酸酐化透明质酸HA-MA。

2.根据权利要求1所述促修复双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，

步骤（1）中所述胃蛋白酶溶液的用量为胃蛋白酶与所述去细胞角膜基质的质量比为1:10；

步骤（1）中所述PBS的用量为其与均相消化液的体积比为1:9；

步骤（1）中所述去细胞角膜基质采用猪角膜破碎得到；

步骤（1）中所述消化为搅拌消化至不存在基质块材料；

步骤（1）中所述消化完毕后，采用NaOH溶液调节pH至中性，以终止消化。

3.根据权利要求1或2所述促修复双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，

步骤（1）中所述胃蛋白酶溶液为盐酸溶液溶解胃蛋白酶得到；

所述盐酸溶液的浓度为0.01 mol/L。

4.根据权利要求1所述促修复双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，

步骤（2）中所述引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐LAP、AIBN中的一种；

步骤（2）中所述引发剂溶液采用的溶剂为PBS。

5.根据权利要求1所述促修复双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，

所述CMC/NHS中CMC和NHS的摩尔比为1:10 ~ 10:1；

所述EDC/NHS中EDC和NHS的摩尔比为1:10 ~ 10:1；

所述EDC/NHS与dCECM按照n（EDC）: m（dCECM）=1:5 ~ 1:100配比。

6.根据权利要求1所述促修复双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，

步骤（2）中所述去细胞角膜基质水凝胶在体系中的浓度为1~ 100 mg/mL；

步骤（2）中所述改性透明质酸在体系中的的浓度为1~ 400 mg/mL；

步骤（2）中所述引发剂溶液在体系中的浓度为0.001~ 30 mg/mL。

7.根据权利要求1所述促修复双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，

步骤（2）中所述交联剂或者在步骤（1）中制备去细胞角膜基质水凝胶溶液过程中与PBS一同加入；

步骤（2）中所述与去细胞角膜基质水凝胶溶液混合之后，加入种子细胞或者生长因子、药物，得到的促修复双网络水凝胶能够进一步促进角膜再生；

所述药物为维生素C、胰岛素、转化生长因子β；

步骤（2）中所述紫外照射为采用波长320~500 nm的紫外光照射5 ~ 90 s。

8.一种促修复双网络水凝胶，其特征在于，通过权利要求1-7任一项所述制备方法制备得到。

9.权利要求8所述促修复双网络水凝胶在组织修复和再生中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，

所述组织为角膜；

所述应用是将促修复双网络水凝胶作为角膜伤口粘合剂、角膜穿孔封堵剂或无缝合的板层角膜替代物；

所述促修复双网络水凝胶作为细胞或分子载体，负载生长因子、细胞、药物，进一步促进修复；

所述药物为维生素C、胰岛素、转化生长因子β。